저자 편집에 Gráinne Tierney를 감사 하 고 싶습니다.

STS 세포 대량 수술 환자 STS에서에서 excised 종양 으로부터 격리 됩니다. 프로토콜 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다 하 고 좋은 임상 연습 가이드라인과 헬싱키 선언에 따라 수행 됩니다. 모든 환자는 연구에 참여 하는 것 서 면된 동의 했다. 수술 표본 경험된 육 병리학 자에 의해 분석 하 고 수술의 3 시간 이내에 처리 됩니다.
1. 종양 표본 수집 및 처리:
<ol><li>DMEM 낮은 포도 당 매체 파라핀 필름으로 밀봉의 50 mL를 100 mL 무 균 소변 용기에 육 병리학의 도움으로 종양 표본을 수집 합니다.</li>
	<li>종양 절제 후 3 h의 최대 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
	<li>메 마른 조직 문화 후드 아래 모든 다음 단계를 수행 합니다.<ol>
<li>70% 에탄올과 후드를 소독 하 고 멸 균 장갑을 착용.</li>
		<li>70% 에탄올 (사용 멸 균 거 즈)와 철강 inox 족집게를 소독.</li>
		<li>파라핀 영화 소변 컨테이너에서 제거 하 고 삭제.</li>
		<li>70% 에탄올과 소변 컨테이너의 외부 세척.</li>
		<li>광장 페 트리 접시를 엽니다.</li>
		<li>소변 컨테이너를 열고 멸 균된 강철 inox 핀셋을 사용 하 여 사각형 페 트리 접시에 종양 견본을 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS와 종양 표본 두 번 씻는 다.</li>
	<li>무 균 수술 메스를 엽니다.<ol>
<li>1-2 m m3 조각으로 종양 표본을 잘게 잘게.</li>
		<li>2 mL 튜브에 총 샘플의 1/4을 수집 합니다.</li>
		<li>Trizol 시 약 (구입) 튜브의 1 mL을 추가 하 고 즉시-80 ° C (샘플에에서 사용 됩니다 다운스트림 분석 STS 유전자 식 계산에 대 한)에서 동결.</li>
	</ol>
</li>
	<li>15 mL 튜브에 가늘게 파쇄 된 종양 재료의 나머지를 수집 합니다.<ol>
<li>콜라의 4 개 mL를 추가 유형 I 솔루션 (콜라 유형 내가 4 µ g/mL의 농도에서 PBS에 용 해).</li>
		<li>희석 된 콜라 DMEM 높은 문화 미디어의 4 mL와 함께 솔루션 타입 (최종 농도 콜라 종류의 나는 2 µ g/mL).</li>
		<li>15 mL 튜브 닫고 파라핀 영화와 함께 인감.</li>
		<li>소화를 활성화 하기 위해 15 분 교 반 조건에서 37 ° c 배양 기에서 압 연 통에 15 mL 튜브를 넣어.</li>
		<li>15 분 후 하룻밤 실 온에서 교 반 조건 아래 압 통에 튜브를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 날 살 균 후드 15 mL 튜브를 넣어.</li>
	<li>부드럽게 50 mL 튜브의 상단에 연결 된 100 µ m 살 균 필터를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.</li>
	<li>10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 글루타민, 및 1% 페니실린/스 보충 DMEM 높은 문화 미디어 필터를 세척.</li>
	<li>100 µ m 살 균 필터, 실 온에서 5 분 동안 50 mL 튜브 및 225 x g에서 원심 분리기를 닫습니다.</li>
	<li>튜브를 거꾸로 하 여는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	<li>다시 1-2 mL DMEM 높은 문화 미디어 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 글루타민, 및 1% 페니실린/스 보충 셀을 일시 중단 합니다. 참고: 볼륨 처리 종양 샘플의 크기에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>Neubauer 챔버와 셀을 계산 합니다.<ol>
<li>Trypan 파랑의 1:2 샘플을 희석 하 고 희석의 10 µ L를 사용 하 여 셀의 개수.</li>
		<li>두 번 이상 계산 하 고 셀 수집된의 평균 총 알아야 복제의 평균을 계산.</li>
	</ol>
</li>
	<li>80000 셀/c m2의 조밀도에 표준 단층 문화에 플레이트 세포. 참고: 항상 실험에 컨트롤을 포함 합니다. 각 조건에 대해 3 기술 복제를 수행 합니다. 2 생물 복제를 수행 합니다. 전 임상 약리학, 유전자 발현 및 단백질 표정 분석, 실험 한다 실시 문화 통로의 낮은 수와 함께 셀 손실 암 세포 고기를 뿌리기의 30-45 일 이내.</li>
	<li>Cytological 샘플 준비입니다.<ol>
<li>DMEM 높은 문화 미디어 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 글루타민, 1% 페니실린/스와 보충의 200 µ L에 100000 세포를 수집 합니다.</li>
		<li>피펫은 일회용 깔때기로 솔루션 (200 µ L 피 펫) 필터를 장착 하 고 유리 슬라이드와 함께 탑재.</li>
		<li>cytocentrifuge를 열고 예제를 삽입 합니다.</li>
		<li>18.6 x g 20 분에 cytocentrifuge를 실행 합니다.</li>
		<li>필터를 장착 하는 깔때기를 삭제 합니다.</li>
		<li>10 분 뒤에 5 분에 대 한 클로 프롬 아세톤에 슬라이드를 수정.</li>
		<li>-20 ° c.에 슬라이드 저장 참고: 해 동 하 고 얼룩이 지기 전에 샘플 화 얼룩 제조업체의 지침에 따라 수행. 3 기술 복제를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. STS 세포 배양:
<ol><li>일주일에 한 번 (DMEM 높은 문화 미디어 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 글루타민과 1% 페니실린/스 보충) 미디어를 변경 합니다.<ol>
<li>200-1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 문화 매체를 버리십시오.</li>
		<li>200-1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 새로운 신선한 매체를 추가 합니다.</li>
		<li>셀 통로:<ol>
<li>합류는 약 90% 세포 분리: 참고: STS 셀 문화 증폭 문화 조건에 따라 일주일에 한 번 수행 되어야 한다.</li>
			<li>폐기 매체, PBS로 세척 및 트립 신 1의 2-3 mL를 추가 PBS에 x 참고: 트립 신 사용의 볼륨 얻은 배양된 세포의 크기에 따라 달라 집니다.</li>
			<li>37 ° c.에 3-5 분에 대 한 셀을 품 어</li>
			<li>200-1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 접시에서 분리 된 세포를 수집 합니다.</li>
			<li>15 mL 튜브로 분리 된 세포를 플라스틱 고 DMEM 높은 문화 미디어 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 글루타민, 효소 반응을 중지 하 1% 페니실린/스와 보충의 4 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>실 온에서 5 분에 대 한 225 x g에서 원심.</li>
			<li>폐기는 상쾌한.</li>
			<li>다시 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 글루타민, 및 1% 페니실린/스 보충 DMEM 높은 문화 미디어의 1 mL을 추가 하 여 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
			<li>새로운 문화 접시 또는 제조업체의 지침에 따라 최종 볼륨을 플라스 크에 세포 씨앗 참고: 1:3 보다는 더 많은 세포를 분할 하지 않습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 다운스트림 분석:
참고: 다른 실험의 다양 한 밖으로이 모델 (아래 참조)를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그것은, 그러므로, 연구의 설계 단계는 분석 샘플 및 복제의 충분 한 숫자를 준비할 수 있도록 수행 됩니다 결정 하는 중요 한.
<ol><li>MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드 등 확산 분석 실험</li>
	<li>Apoptotic 분석 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 (TdT) 같은 닉 끝 라벨 (TUNEL) 분석 결과</li>
	<li>Immunohistochemical 분석</li>
	<li>유전자 표정 분석</li>
	<li>서쪽 오 점 분석</li>
	<li>ELISA 분석 결과</li>
	<li>형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 분석</li>
	<li>
이 종이 식 모델 vivo에서</li>
</ol>

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).</li><li>Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+treatment+of+soft-tissue+sarcoma+gold+standard+and+novel+therapies.">Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).</li><li>Fletcher, C. 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저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

잘 정의 된 전 임상 모델 종양의 분자 배경 명료, 가난한 예 후를 예측 하 고 암 환자에 대 한 새로운 치료 전략을 개발 필요 합니다. 이것은 특히 STS 등 희귀 한 종양에 대 한 중요 한 형태에서 그 높은, 공격적인 잠재적인, 및 임상 행동 STS 생물학 및 환자 관리21의 우리의 이해에 도전. 또한, 사용할 수 있는 몇 가지 상업 육 종 셀 라인 엽 종양18의이 그룹에 대 한 ...

모든 고체 종양1,2, 1%에 대 한 간 엽 기원 회계의 이질적인 장애의 스펙트럼을 포함 하는 부드러운 조직 sarcomas (STS) 그리고 이상의 50의 존재를 인식 하는 새로운 세계 보건 기구 분류 다른 하위3. 이 중, 가장 일반적인 histotypes 있으며 체형 육 종 또는 liposarcoma leiomyosarcoma, 15%와 모든 성인 STS, 각각4,5의 11%를 차지. STS는 신체의 다른 부분에서 개발할 수 있습니다, 비록 사지 그리고 retroperitoneum 60%와 20%의 경우, 각각6에서 발생 하는 가장 일반적인 사이트는.
지역화 된 질병에 대 한 치료의 초석은 넓은 외과 절제술, 보조 및 neoadjuvant 요법의 혜택은 아직 명확 하지 않다 고7선택 된 경우만 간주 됩니다. 전이성 설정에서 화학 요법 치료의 표준 이지만 제한 된 결과8를 보여줍니다. STS의 분자 생물학의 더 나은 이해는 현재 차별 진단 개선, 사용 가능한 치료를 최적화 하 고 치료를 위한 새로운 표적 식별에 도움이 될.
이 컨텍스트 내에서 불멸 하 게 셀 라인9를 사용 하 여 몇 년 동안 암에 대 한 연구를 수행 하고있다. 이러한 실험 모델 일반적으로 표준 단층 지원에 배양 또는 vivo에서 이 종이 식10모델 확립 immunodeficient 설치류에 이식. 불멸 하 게 셀 라인 관리 및 매장이 쉬운 자료를는 연구 실험의 충분 한 번호를 수행할 수 있습니다 나타냅니다. 그들은, 실제로, 가장 저렴 하 고 가장 널리 전 임상 연구11에 도구를 사용.
그러나, 셀 라인 기반 암 모델도 몇 가지 제한이, 구절의 증가 함께 단층 시스템에서 예: 연장 문화 유도 phenotypic 및 유전적 부동, 만들기에 정리 주요 종양을 적은 셀 기능입니다. 또한, 셀 라인 문화 셀 상호 작용 및 신호 분자 크로스 토크는 종양의 생물 학적 행동을 모방 하 고 종양 microenvironment 특성화를 재현 하지. 이러한 문제는 전 임상 및 임상 결과12사이 기존 하는 격차의 기초를 형성 합니다.
위의 감안할 때, 환자 파생 주 문화에 관심13을증가 했다. 실제로, 악성과 정상적인 직물의 절단 암 세포 표현 형 및 따라서 종양 microenvironment의 대표는 시작 물자를 제공 하 고이 잃기의 위험을 줄여줍니다. 또한, 외과 절제술을 받은 환자에서 수확 한 신선한 종양 견본의 사용 단일 종양을 조사 하 고 다른 병 변 환자의 몸14의 동일한 부분에서 비교 하 있습니다. 위의 이유로 조직 파생 셀 문화 종양 이상과 약리학15,16,17, 특히 어떤 상용 육 종 세포 라인에 STS를 연구 하는 귀중 한 자료를 제공 제한 된18있습니다. 우리는 따라서 환자 파생 STS 1 차 셀 문화 수술 삭제 종양 조직13,,1920에서 시작을 설정 하는 방법을 최적화 합니다. 우리의 방법 뒤에 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 하룻밤 효소 조직 분리 하는 작은 조직 조각으로 종양 견본 disaggregating 이루어져 있다. 다음 날, 효소 소화 신선한 문화 미디어를 추가 하 여 중지 되 고 얻은 서 스 펜 션 조직 파편, 셀 집계 및 초과 매트릭스 또는 파편을 제거 하도록 필터링 됩니다. 마지막으로, 격리 된 종양 세포의 일부분은 유리 슬라이드, 고정 및 cytomorphological, immunohistochemical 및 분자 cytogenetic 평가 STS 주 문화 설립을 확인 하기 위한 다운스트림 분석에 대 한 저장에 cytospinned (MDM2 증폭의예: 물고기 분석이 나타냅니다 잘 차별화 liposarcoma 및 dedifferentiated liposarcoma 표준 차별 진단을) 4. 나머지는 유전자 식 프로 파일링 및 약리 연구에 대 한 표준 단층 문화로 시드. 실험 낮은 사용 하 여 수행 됩니다 모든 구절을 피하기 위해 특정 암 subclones의 선택 주 문화 그리고 경험된 육 병리학 자에 의해 분석. 우리는 완전히 인간 STS ex vivo 모델13,19,20를 따라서 만들었습니다. 이 높게 다재 다능 한, 쉽게 핸들 모델의 전 임상 연구, 예를 들어 진단 및 예 후에 대 한 새로운 분자 마커를 식별 하거나 활동의 깊은 이해 및 메커니즘의 종류에 대 한 유용한 도구를 나타낼 수 STS의 관리에 사용 되는 표준 및 새로운 약물의 액션.

<table><tbody><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>EuroClone</td><td>ECB7501L</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>EuroClone</td><td>ECS0180D</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-4-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Triazol reagent</td><td>Ambion Life-Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>EuroClone</td><td>ECB3052D</td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of a primary culture of patient-derived soft tissue sarcoma

연 조직 sarcomas (STS) 어려운 진단, 분류 및 관리와 함께 다른 유형의 악성의 스펙트럼을 나타냅니다. 날짜 하려면,이 드문 단단한 종양의 50 이상 조직학 하위 확인 되었습니다. 따라서, 그들의 특별 한 다양성 및 낮은 발병 률,이 종양의 생물학의 우리의 이해 여전히 제한 됩니다. 환자 파생 문화 STS 이상과 약리학 연구에 이상적인 플랫폼을 나타냅니다. 우리는 따라서 종양 표본을 외과 절제술을 받은 환자에서가 걷이에서 시작 하는 STS의는 인간의 전 임상 모델을 개발 했다. STS 세포 배양 환자 파생 콜라 소화에 의해 수술 표본에서 얻은 고 여과 의해 분리. 셀 계산, 시드, 그리고 표준 단층 문화에서 14 일에 대 한 되었고 다운스트림 분석 처리. 분자 또는 제약 분석을 수행 하기 전에 STS 주 문화의 설립 cytomorphologic 기능, 그리고 가능한 경우, 평가 통해 확인 되었다 immunohistochemical 마커. 이 메서드는 1)이 제대로 탐험된 악성의 자연의 역사를 공부 하 고 2) 그들의 행동의 메커니즘에 대 한 자세한 노력에 다른 약물의 효과 테스트 하는 유용한 도구를 나타냅니다.

우리 설계 환자 파생 된 연 조직 육 종의 기본 문화 설립 여기 한 특정 STS histotype13에서 얻은 결과의 예를 보고 하는 간단한 방법. 프로토콜, 잘 분화 liposarcoma를 포함 하 여 다른 STS histotypes의 기본 문화의 설립을 위해 사용 되었다 liposarcoma, myxoid liposarcoma, pleomorphic liposarcoma, myxofibrosarcoma, undifferentiated dedifferentiated pleomorphic 육 종, 요점, 및 desmoid fibromatosis입?...

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Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

다음 프로토콜 환자 파생 된 연 조직 육 종 (STS)의 주 문화는의 설립에 집중 한다. 이 모델 분자 배경 및 약리 프로필 이러한 드문 악성 종양의 더 나은 이해를 우리를 도울 수 및 STS 관리를 개선 하기 위한 추가 연구에 대 한 출발점을 대표할 수 있었다.

환자에서 파생 된 연 조직 육 종의 기본 문화 설립

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

establishment-primary-culture-patient-derived-soft-tissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

14.2K 조회수.  Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS. 다음 프로토콜 환자 파생 된 연 조직 육 종 (STS)의 주 문화는의 설립에 집중 한다. 이 모델 분자 배경 및 약리 프로필 이러한 드문 악성 종양의 더 나은 이해를 우리를 도울 수 및 STS 관리를 개선 하기 위한 추가 연구에 대 한 출발점을 대표할 수 있었다.

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Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains poor when metastasis has occurred. The Cancer Stem Cell (CSC) theory holds that there is a subset of tumor cells within the tumor that have stem-like characteristics, including the capacity to maintain the tumor and to resist multidrug chemotherapy. Therefore, a better understanding of OS biology and pathogenesis is needed in order to advance the development of targeted therapies to eradicate this particular subset and to reduce morbidity and mortality among patients. Isolating CSCs, establishing cell cultures of CSCs, and studying their biology are important steps to improving our understanding of OS biology and pathogenesis. The establishment of human-derived OS-CSCs from biopsies of OS has been made possible using several methods, including the capacity to create 3-dimensional stem cell cultures under nonadherent conditions. Under these conditions, CSCs are able to create spherical floating colonies formed by daughter stem cells; these colonies are termed &#34;cellular spheres&#34;. Here, we describe a method to establish CSC cultures from primary cell cultures of conventional OS obtained from OS biopsies. We clearly describe the several passages required to isolate and characterize CSCs.

The presence of cancer stem cells (CSCs) in bone sarcomas has recently been linked to their pathogenesis. In this article, we present the isolation of CSCs from primary cell cultures obtained from human biopsies of conventional osteosarcoma (OS) using the ability of CSCs to grow under nonadherent conditions.

암의 설립은 인간 기존의 골육종에서 세포 배양 줄기

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

연구

암 연구학

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been shown to be responsible for tumor initiation, metastasis, and drug resistance. Therefore, it is important to develop specific TIC-targeting therapy in addition to current chemotherapy strategies, which mostly focus on the bulk of non-TICs. In order to further understand the mechanism behind the malignancy of TICs, we describe a method to isolate and to characterize TICs in human sarcomas. Herein, we show a detailed protocol to generate patient-derived xenografts (PDXs) of human sarcomas and to isolate TICs by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using human leukocyte antigen class I (HLA-1) as a negative marker. Also, we describe how to functionally characterize these TICs, including a sphere formation assay and a tumor formation assay, and to induce differentiation along mesenchymal pathways. The isolation and characterization of PDX TICs provide clues for the discovery of potential targeting therapy reagents. Moreover, increasing evidence suggests that this protocol may be further extended to isolate and characterize TICs from other types of human cancers.

We describe a detailed protocol for the isolation of tumor-initiating cells from human sarcoma patient-derived xenografts by fluorescence-activated cell sorting, using human leukocyte antigen-1 (HLA-1) as a negative marker, and for the further validation and characterization of these HLA-1-negative tumor-initiating cells.

육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 발하는 세포의 격리 및 특성화

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. Although there are many established gastric cancer cell lines and many conventional transgenic mouse models for preclinical research, the disadvantages of these in vitro and in vivo models limit their applications. Because the characteristics of these models have changed in culture, they no longer model tumor heterogeneity, and their responses have not been able to predict responses in humans. Thus, alternative models that better represent tumor heterogeneity are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models preserve the histologic appearance of cancer cells, retain intratumoral heterogeneity, and better reflect the relevant human components of the tumor microenvironment. However, it usually takes 4-8 months to develop a PDX model, which is longer than the expected survival of many gastric patients. For this reason, establishing primary cancer cell lines may be an effective complementary method for drug response studies. The current protocol describes methods to establish PDX models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. These methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

The current protocol describes methods to establish patient-derived xenograft (PDX) models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. The methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연<sup&gt; +</sup흑종에서&gt; Putative 암 줄기 세포

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

의학

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

생체공학

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

인간의 전정 신경초종의 차 문화

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor organoids developed in our laboratory consist of a mix of multiple tumor-derived cell populations, and thus represent a better approximation of tumor cell diversity and milieu than the established 2D cancer cell lines. Organoids serve as an ideal in vitro model, allowing for cell-extracellular matrix interactions, known to play an important role in cell-cell interactions and cancer progression. Patient-derived organoids also have advantages over mouse models as they are of human origin. Furthermore, they have been shown to recapitulate the genomic, transcriptomic as well as metabolic heterogeneity of patient tumors; thus, they are capable of representing tumor complexity as well as patient diversity. As a result, they are poised to provide more accurate insights into target discovery and validation and drug sensitivity assays. In this protocol, we provide a detailed demonstration of how patient-derived breast organoids are established from resected breast tumors (cancer organoids) or reductive mammoplasty-derived breast tissue (normal organoids). This is followed by a comprehensive account of 3D organoid culture, expansion, passaging, freezing, as well as thawing of patient-derived breast organoid cultures.

A detailed protocol is provided here for establishing human breast organoids from patient-derived breast tumor resections or normal breast tissue. The protocol provides comprehensive step-by-step instructions for culturing, freezing, and thawing human patient-derived breast organoids.

환자 유래 유방 오가노이드의 확립 및 배양

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

췌장암 유래 종양 오가노이드 및 신선한 조직의 섬유아세포

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. Patient-derived tumor organoids have been used in translational cancer research and can be applied to assess treatment sensitivity and resistance, cell-cell interactions, and tumor cell interactions with the tumor microenvironment. Tumor organoids are complex culture systems that require advanced cell culture techniques and culture media with specific growth factor cocktails and a biological basement membrane that mimics the extracellular environment. The ability to establish primary tumor cultures highly depends on the tissue of origin, the cellularity, and the clinical features of the tumor, such as the tumor grade. Furthermore, tissue sample collection, material quality and quantity, as well as correct biobanking and storage are crucial elements of this procedure. The technical capabilities of the laboratory are also crucial factors to consider. Here, we report a validated SOP/protocol that is technically and economically feasible for the culture of ex vivo tumor organoids from fresh tissue samples of pancreatic adenocarcinoma origin, either from fresh primary resected patient donor tissue or patient-derived xenografts (PDX). The technique described herein can be performed in laboratories with basic tissue culture and mouse facilities and is tailored for wide application in the translational oncology field.

저자 스포트라이트: Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts from fresh tissue  

Tumor organoids have revolutionized cancer research and the approach to personalized medicine. They represent a clinically relevant tumor model that allows researchers to stay one step ahead of the tumor in the clinic. This protocol establishes tumor organoids from fresh pancreatic tumor tissue samples and patient-derived xenografts of pancreatic adenocarcinoma origin.

췌장암 유래 종양 오가노이드 및 섬유아세포를 신선한 조직에서 확립

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...

환자에서 파생 된 연 조직 육 종의 기본 문화 설립

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암의 설립은 인간 기존의 골육종에서 세포 배양 줄기

육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 발하는 세포의 격리 및 특성화

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연

수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양

인간의 전정 신경초종의 차 문화

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

환자 유래 유방 오가노이드의 확립 및 배양

췌장암 유래 종양 오가노이드 및 섬유아세포를 신선한 조직에서 확립

췌장암 유래 종양 오가노이드 및 섬유아세포를 신선한 조직에서 확립