이 절차는 살아있는 마우스의 등쪽 해마에 반복적으로 광학 액세스를 제공하여 학습 작업을 수행하는 동안 메모리 형성 및 리콜 메커니즘을 연구합니다. 이 기술은 몇 주 동안 세로로 마이크로 미터 수준의 공간 해상도에서 살아있는 마우스의 등쪽 해마를 연구하는 가벼운 현미경 검사법을 사용할 수 있습니다. 기억 상실은 알츠하이머 병과 같은 일부 뇌 질환의 일반적인 특징입니다.
메모리 형성 및 리콜의 메커니즘을 이해 궁극적으로 이러한 질병으로 고통 받는 환자 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 작은 포유류와 같은 두개골을 가진 그밖 동물 시스템에 적용될 수 있었습니다. 생존 수술 중 활력 징후를 모니터링하는 것은 산만하고 스트레스가 될 수 있습니다.
절차의 더 중요한 측면에 집중하기 위해 죽은 동물에 대한 절차를 먼저 수행하는 것이 유용 할 수 있습니다. 이미징 캐뉼라를 준비하려면 먼저 3mm 직경의 스테인레스 스틸 튜브를 1.6mm 길이의 금속 고리로 자릅니다. 절단 후 링의 가장자리가 무디지 않으면 부정을 제기하십시오.
다음으로, 한 쌍의 집게를 사용하여 금속 링의 한쪽을 UV 경화 광학 접착제에 담급넣습니다. 그런 다음 금속 링을 유리 커버슬립 의 중앙에 놓고 링의 측면은 덮개 슬립을 만지는 접착제로 덮여 있습니다. UV 경화 LED 드라이버 유닛을 켜고 365 나노미터 파장 광을 접착제에 1분 동안 비추어 접착제를 치료합니다.
광원의 방향을 변경하여 링의 모든 면이 똑같이 조명되는지 확인합니다. 접착제가 적어도 2 시간 동안 굳어진 후, 금속 고리의 열린 끝에서 기혈을 단단히 유지합니다. 회전 파일이 장착 된 치과 드릴을 사용하여 링의 측면으로 플러시 될 때까지 과도한 유리 덮개 슬립을 제거하십시오.
필요한 계측기를 준비하고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스를 마취합니다. 그런 다음 머리카락을 제거하고 마우스 머리 위로 피부를 소독합니다. 다음으로 가위와 집게를 사용하여 람다 근처의 위치에서 두피에 작은 절단을 합니다.
귀 방향으로 측면으로 이동한 다음 눈 궤도 방향으로 로스트로 하여 약 4mm 의 연막에서 모랄까지 적목축의 삼각형을 형성한다. 두개골에 리도카인 한 방울을 발라주세요. 2 분 후, 음막의 지우기와 면 봉면을 사용하여 두개골을 건조.
그런 다음 이어 바를 배치하여 마우스의 머리를 고정합니다. 폭 0.5mm버가 있는 마이크로 드릴을 사용하여, 심상 봉합사에서 약 1.5밀리미터, 관상 봉합사에서 2밀리미터 의 상반되는 상반신 맞은편에 있는 정면 뼈에 작은 구멍을 만듭니다. 그런 다음 두개골 구멍에 0.86 밀리미터 폭 스테인레스 스틸 뼈 나사를 나사.
접착제 시멘트를 사용하여 제자리에 고정하십시오. 시멘트를 30초에서 1분 동안 건조시키십시오. 다음으로, 3밀리미터 직경의 트레핀 드릴을 사용하여 정수리 뼈에 작은 구멍을 만듭니다.
구멍은 처릿 봉합사에서 약 1.5 밀리미터 의 탈구와 람도이드 봉합사에서 2 밀리미터 의 할수를 배치합니다. 조심스럽게 뼈 플랩을 제거합니다. 그런 다음 Dumont 집게를 사용하여 수막을 제거합니다.
피질 물질을 압다하여 외부 캡슐에 도달합니다. 진공 펌프에 연결된 19 게이지 무딘 바늘을 사용하고 식염수로 관개하여 노출된 조직의 탈수를 피하고 출혈이 해결된 후 잔류 혈액을 씻어내도록 하십시오. 피질 조직을 천천히 약 50~100미크론으로 빨아서 캡슐에서 피질이 분리되어 칭굴럼 또는 코퍼스 캘로섬의 섬유를 노출시킨다.
그런 다음 가장 깊은 섬유가 노출 될 때까지 등광섬유를 조심스럽게 껍질을 벗깁니다. 완료되면, 식염수로 조직을 헹지. 다음으로 얇은 집게를 사용하여 바닥 캐뉼라를 식염수로 찍어 두개골 구멍 위에 놓습니다.
그런 다음 유리 덮개 슬립이 섬유와 접촉 할 때까지 캐뉼라를 두개골에 밀어 넣습니다. 두개골을 말리고 두개골 위에 빠른 접착제 시멘트를 적용하여 캐뉼라를 제자리에 고정시하십시오. 또한 캐뉼라의 가장자리에 접착제를 적용하지만 접착제가 캐뉼라에 실행되지 않도록주의해야합니다.
일단 건조하면 스테레오탁스 암을 사용하여 두개골과 접촉하여 캐뉼라 위에 머리 홀더 플레이트를 놓습니다. 치과 아크릴의 혼합물을 준비한 다음 전체 두개골에 적용합니다. 노출된 두개골 전체, 나사 및 열린 피부를 치과 아크릴로 덮어 준비를 안정화시하십시오.
15분 후, 이동식 접착제 필름을 헤드 홀더 플레이트에 발라 이물질이 캐뉼라로 유입되는 것을 방지합니다. 뇌를 이미지할 준비가 되면 마취에 대한 세부 사항을 위해 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 다시 따르십시오. 충분히 진정되면 집게를 사용하여 헤드 홀더 플레이트에서 접착제 필름을 조심스럽게 제거하십시오.
준비에 손상을 입히지 않도록 필름을 부드럽게 제거합니다. 다음으로, 가열 카펫 위에 현미경 아래에 마우스를 배치하고 홀더에 헤드 플레이트를 고정합니다. 동물의 눈에 눈 연고를 바하십시오.
그런 다음 주사기와 얇은 바늘을 사용하여 탈이온 된 물을 캐뉼라에 떨어 뜨리고 진공 펌프로 제거하여 이미징 캐뉼라를 청소하십시오. 낮은 배율 장거리 목표를 사용하여 잔류 물, 먼지, 무결성 및 형광의 존재를 위해 캐뉼라를 시각적으로 확인하십시오. 그런 다음 머리 홀더 암의 각도를 조정하여 캐뉼라를 광학 축에 정렬합니다.
1.0 숫자 조리개와 4mm 작동 거리로 25X 목표로 전환합니다. 그런 다음 캐뉼라에 충분한 탈온화된 물을 추가하여 채우고 캐뉼라 위에 여분의 물을 유지합니다. 마지막으로, 두 개의 광자 여기를 사용하고 형광 신호를 이미지합니다.
여기에 표시된 i1-GFP 형질전환 마우스 뇌에서 2P 이미지 스택. Thy1-GFP 마우스는 피라미드 뉴런의 드문 무작위 집단에서 Thy1 프로모터의 통제 하에 세포질 향상 GFP를 발현한다. 일반적으로, 등쪽 해마 CA1에서 피라미드 뉴런의 주요 축은 XY 이미징 평면에 대략 수직이다.
이들 영역은 이미징 캐뉼라 아래부에서 GFP 발현의 패턴을 보여주는 낮은 배율 3차원 스택에 수동으로 매핑된다. 세로 추적을 위해, 캐뉼라의 시야 내의 몇몇 두뇌 지구가 정의됩니다. 각 영역은 약 240 x 240 마이크로미터의 영역에 해당하며 1~7개의 수지상 세그먼트를 포함합니다.
여기에 이미지 된 시리즈는 14 일 동안 다른 시간 간격으로 획득 CA1 피라미드 뉴런과 기저 드런라이트의 하나의 마이크로 미터 z 단계 이미지 스택을 보여줍니다. 그러나, 더 긴 이미징 기간 및 간격가능. 대부분의 이미지는 지층 오리엔스의 수지상 척추이지만, 층 복사의 경사 원점에 수지상 척추를 이미지화할 수도 있습니다.
이 기술의 또 다른 확장은 바이러스 벡터를 가진 등쪽 CA1 해마 부위를 주입하여 CA1 피라미드 뉴런에서 활동 유발 가소성을 이미지하는 것입니다. 이를 통해 각 동물에서 수백 개의 CA1 피라미드 형 뉴런이 2P 이미지 스택으로 도시된 것으로 측정할 수 있습니다. 지나치게 조직을 제거할 때 해마의 손상을 방지하는 것이 중요합니다.
또한 안정적인 준비를 위해 캐뉼라를 올바르게 배치해야 합니다. 설명된 준비는 동물의 머리에 이식될 수 있는 소형 현미경과 같은 광학 화상 진찰의 다른 종류의 사용을 허용합니다. 이것은 연구원이 자유롭게 움직이는 동물에 있는 신경 활동을 따를 수 있습니다.
원래, 기술은 해마 뉴런에서 구조적 가소성을 연구하는 데 사용되었다. 오늘, 그것은 또한 다른 뇌 영역에서 신경 활동을 공부에 구현.
