The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.

참고 : (126 ° C, 11 분 오토 클레이브에 의해) 멸균 조건 (층류 캐비닛)에서 사전 살균 물질과의 모든 단계를 수행합니다. 아웃 줄무늬 E.와 LB 플레이트 대장균 OP50 매월, 위에 밖으로 행진 신선한 LB 플레이트를 요구하고 restreak 4 ° C로 유지. 1. 세균성 식품 (대장균 OP50) 준비 <ol><li> 주 1. 접종 E.의 단일 식민지 두 보편적 인 병 2 × 5 ㎖의 LB 대장균 OP50 8 시간 동안 37 ° C (220 RPM)에서 인큐베이터를 흔들어에서 장소. </li><li> 8 시간 배양 한 후, E를 2 ㎖를 사용 대장균 OP50 LB 문화는 3 × 200 ml의 (LB)을 각각 접종 인큐베이터를 흔들어에 넣어 플라스크 (220 RPM) O / 37 ° C에서 N (17 시간). </li><li> 20 × 50 ㎖ 원심 분리기 튜브의 무게를 측정 튜브에 무게를 쓰기. </li><li> 날 혈청 학적 피펫을 사용하여 2. 나누어 O의 30 ㎖ / N E. 사전에 대장균 OP50 문화는 원심 분리기 튜브의 무게. 7741 X 원심 분리기G, 10 ° C, 8 분. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 가만히 따르다에 뚜껑을 반전 튜브를 유지하고 몇 분 동안 서 둡니다. 피펫을 사용하면 뚜껑에서 수집 한 수 초과 뜨는을 제거합니다. 튜브를 달아 펠릿의 중량을 계산한다. </li><li> 30g / L의 현탁액을 제공하고,이 튜브에 볼륨을 표시하는 데 필요한 양을 계산한다. 1~3개월 내에서 또는 사용하기 위해 -20 ° C에서 날짜, 라벨 및 장소 튜브 - 80 ° C 3 개월 이상 저장하는 경우. </li><li> 선충을 성장 세균 현탁액을 준비; , 소용돌이 부드럽게 펠렛을 재현 탁 밖으로 해동 각 튜브에 11, 12 완전한 매체 S의 필요한 볼륨을 추가하는 세균 펠릿을 허용, 다른 관의 풀 내용은 필요한 볼륨을 얻었다. 무균 조건에서 작업 할 수 있습니다. </li></ol> 96 웰 플레이트 형식으로 의약품 표준 2. 준비 참고 : 약물 라이브러리를 사용하는 경우, 약물 플레이트가 하나 설치되어있다DMSO의 화합물의 농도. 차 심사는 하나의 농도로 화합물을 테스트합니다. 설명은 10 μM에서 통계적 유의성 선택한 후, 0-160 사이 μM 농도 범위에서 확증 시험 화합물에 대한 약물 판의 제조에 따른다. 다음 단계는 다른 농도를 테스트하도록 구성 될 수있다. 주의! 약물을 처리하기위한 필요한 예방 조치를 따르십시오 (일반적으로 마스크, 안전 고글에 직면, 장갑이 필요합니다). <ol><li> 확증 검사에 대한 표준 작업과 약물 플레이트를 준비 : 멸균 1.7 ml의 microcentrifuge 관에 화합물의 필요한 양을 무게 DMSO에 16 밀리미터의 화합물을 제조 (즉, 100 배 노출에 대한 원하는 최고 농도에 상대적으로 집중). </li><li> 8, 4, 2, 1, 0.5 및 0.25 mM의 규격 (멸균 조건)을 얻었다 DMSO 2 : 직렬 16 mM의 스톡 1 희석. 이들은, 100X 농축하고 0 (비히클 만)의 최종 농도까지 희석된다약물 노광시 (1 % DMSO에서) 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 및 160 μM. </li><li> 층류 캐비닛 예 플레이트 위치 A1을 위해, 96- 웰 플레이트의 칼럼 내의 화합물 표준 웰 당 20 내지 50 μL를 배치 : 16 mm의 B1 : 8 mm의 C1 : 4 mm의 D1 : 2 mm의 E1 : 1 밀리미터, F1 : 0.5 mm의 G1 : 0.25 mM의 약물 및 H1 : DMSO. 다른 약물의 희석 시리즈에 대해 서로 다른 열을 사용합니다. </li><li> 약물 플레이트에 열 (12)의 우물에 나누어지는 차량. 참고 :이 그 차량이 전체 판의 위치 대리점에서 테스트 보장, 차량 제어 아래 행 (H)에 따라 시험에 추가하여 열 테스트를 용이하게 할 것이다. 주 : 확증 각 약물 스크리닝 플레이트 테스트 될 11 개의 약물의 최대 플러스 차량 제어를위한 일련의 희석을 보유하고있다. </li><li> 필요한 때까지 레이블 및 도장 판은 -20 ° C에서 호일과 장소 커버. </li></ol> 3. 선충 실험 참고 : 모든 단계 U을 수행파인더 무균 조건, 무균 및 사전 살균 물질 및 시약. C를 유지 엘레은 E.와 NGM 판에 정기적으로 균주 다른 프로토콜 단계에 대한 대장균 OP50. (12)하기 권장 타이밍은 표 1에 제공된다. <ol><li> 1 일 작업 : 다음 동기화를위한 바이오 센서 균주의 액체 배양을 설정합니다. <ol><li> 2 ML의 S 완료에 (음식을 그냥 실행 한 어린 유충을 많이) 하나 6cm의 NGM 판에서 선충을 가지고 30g / L E. 플라스크로 전송 S 전체 (전체 부피 250 mL의 용량 원추형 유리 플라스크에서 30 mL) 중의 대장균 OP50. 20 ° C, 160 rpm으로 3 일 품어. </li></ol></li><li> 4 일 작업 (약 30 ~ 35 분을 허용) : 표백제 문화는 알을 수확 및 웜 인구를 동기화합니다. 1 분, 600 × g으로 원심 분리에 대한 모든 단계를 수행한다. <ol><li> 사용 직전 표백제 솔루션을 준비 : 0.156 M KOH / NaOH를 각각 16 ml의 4 ml의 표백제를 추가합니다. </li><li> 2 × 14 ml에 붓고15 ML 원뿔 원심 분리 튜브에 웜 문화. 벌레는 중력 (3 분)에 의해 해결하도록 허용합니다. 제거하고 액체 위의 정착 선충을 폐기합니다. 각각의 튜브에 표백제 용액 5 mL를 추가하고 타이머를 시작합니다. 하나의 튜브에 볼륨을 결합합니다. </li><li> 2 분 동안 부드럽게 튜브를 반전 벌레의 파괴 및 현탁액에 계란의 석방을 입체경에서 확인합니다. 때 대부분의 계란이 해제되거나 표백제 용액에서 2 분, 원심 분리기의 최대 시간. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 14 ML의 S 완전하고 원심 분리기와 펠렛 1 배를 씻으십시오. </li><li> , 상층 액을 버리고 10 ml의 표백제 솔루션을 추가하고 타이머를 시작 (이 두 번째 표백 단계는 웜 시체의 대부분이 분해되어 더 이상 입체경에서 볼 수 있습니다 보장). 2 분간 원심 표백제 용액에 최대 시간 후. </li><li> 워시 펠릿 배는 S 전체에 부드럽게 각각의 원심 분리 후 전체 14 ML의 S에 뜨는에 resuspend 펠렛을 가만히 따르다. 14 ML의 S C가 최종 세척 후, 재현 탁 달걀 펠릿omplete. </li><li> 원뿔 유리 플라스크에 볼륨을 전송합니다. 20 ° C, 160 rpm에서 18 ~ 24 시간을 품어. 참고 : 수확 계란 O / N을 부화 및 제 애벌레 령 (L1)에서 개발을 체포 인해 음식의 부족, 따라서 그들은 모두 성장의 같은 단계에있을 것입니다 것입니다. </li></ol></li><li> 5 일 작업 : 약물 분석에 대한 동기 웜 문화를 설정합니다. 참고 : 기아 매체에 현탁 웜은 피펫 팁 및 튜브 등의 소수성 플라스틱 표면에 부착하는 경향이있다. 0.01 % 트윈 20은 플라스틱 표면 친수성을보다 렌더링 계수에 큰 정확도 (0.01 % 트리톤 X100가 또한 사용될 수있다)을 사용할 수 있도록 여기에 계면 활성제이다. 선충은 박테리아 보충 매체에있을 때, 그들은 플라스틱에 집중하는 경향이 없습니다. <ol><li> 플랫폼 (160 RPM)를 흔들어에 플라스크를 유지, 플라스크에 부화 L1 년대의 번호를 확인합니다. <ol><li> 플라스크에서 100 μL 샘플을 3 배 타고 900 μL 액체 M과 별도의 1.7 ML의 마이크로 튜브로 (깨끗한 팁 때마다 사용)edium 0.01 % 트윈 -20. 참고 : 한 번만 청소 팁으로 갈망 100 μL 샘플. 분배 할 때 그런 다음, 트윈 보충 매체에 피펫 위로 몇 번 다운 팁을 준수하는 모든 벌레를 분리합니다. </li><li> 각 세중 희석 관에서 4 배 10 μL 방울의 선충을 계산합니다. 평균 값을 계산하고 원뿔 유리 플라스크에 존재하는 웜의 수를 추정하고있다. </li></ol></li><li> 10 μL 당 10 선충과 2 × 20 ​​ml의 문화를 설정하는 데 필요한 부화 선충 서스펜션의 볼륨을 계산합니다. 원심 분리 단계에서 일부 이후 선충 손실을 고려하여 10 %로 계산 된 볼륨을 높입니다. </li><li> 가만히 따르다 볼륨이 2 × 15 ML의 원심 분리 튜브에 요구 (미리 무게). 부드럽게 실제 분배 볼륨, 소용돌이를 얻어 5 mL를 피펫 (만 멸균 끝이 튜브를 입력해야합니다)를 초과 볼륨을 제거하여 볼륨을 대상으로 조정 튜브의 무게. </li><li> 이었다 완전한 신선한 S를 14 ml의 볼륨을 확인시간 선충. 원심 분리기 (1 분간 600g). 제거하고 선충 펠렛을 방해하지 않도록주의하여 상층 액을 버린다. </li><li> 30g / L (E)와 완벽한 S 5 mL를 추가 펠렛 선충에 대장균 OP50. 30g / L E. 완료 15 ML의 S를 함유 원추형 유리 플라스크로 각 튜브에 5 mL를 전송할 대장균 OP50. 아래 참고 시간 선충 먼저 음식을 제공했다. </li><li> 현미경 슬라이드 선충을 계산 (신선한 팁 때마다 사용) 약 10 (± 2) 당 10 μL의 평균을 확인에 조심스럽게 플라스크 (160 RPM)를 흔들어, 9 × 10 μL 방울을. </li><li> 20 ° C, 42 ~ 44 시간 동안 160 rpm으로 인큐베이터를 흔들어에서 선충 플라스크를 놓습니다. </li></ol></li><li> 7 일 작업 : 전사 96 웰 플레이트에 선충 및 약물 노출을 시작합니다. <ol><li> 하나의 플라스크에 선충 문화를 결합 부드럽게 플라스크를 소용돌이 유지하고 60 ml의 멸균 통에서 선충 문화의 3 × 4 ml에 배치합니다. 흔들리는 플랫폼 (160 RPM)에 저점을 놓습니다. </li><li> 사용 8 짱에서 채널 피펫은 투명 평면 바닥과 96 웰 블랙 마이크로 타이 터 플레이트의 웰 당 25 μL 중단 선충 나누어지는합니다 (모두 발광 및 형광 측정을 촬영하거나에만 발광 흰색 번호판). 접시 뚜껑을 덮고 옆으로 설정합니다. <ol><li> 후 매 2 판의 설정, 손실 된 볼륨을 대체하는 통에 다른 2 × 2.5 ㎖의 선충을 배치 (약 7 ㎖를 저점으로 &#39;죽은 볼륨을&#39;유지). </li><li> 선충과 13/14 플레이트를 설정합니다. 11 선충 플레이트는 두 개의 96- 웰 플레이트 약물을 시험해야한다. 12 일 선충 판은 독점적으로 제어 등의 차량으로로드됩니다. 13 일 판은 8 일에 배경 형광 (아래 참조)을 설정하는 데 사용됩니다. 실수 셋업 중에 발생한다 여분의 판을 사용하기 위해 제조 할 수있다. </li></ol></li><li> 진탕 배양기에 젖은 실에서 각 웰과 장소 플레이트에 완벽한 S의 나누어지는 74 μL (자료 목록 참조) (20 ° C, 160 RPM) UNTIL (음식이 제공 한 후 예를 들어, 45 시간 30 분) 미리 선택된 발달 한 번에 나누어 테스트 화합물 준비. [잘 당 볼륨은 이제 99 μL입니다]. </li><li> 시험 약물 판 (들)을 해동. </li><li> 팁 각 시간을 변경, 약물 선충 판을 설정하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 약물을 분취 96 웰 플레이트 당 5 분을 허용합니다. <ol><li> 약물 판의 1 일 열에서 1 μL를 가지고 열 선충을 포함하는 판의 1-5에 추가; 열 선충을 포함하는 판의 8-12로 약물 플레이트에서 2 번째 열에서 반복합니다. 열 (6)과 선충 판의 7 차량의 1 μl를 추가합니다. 참고 : 화합물 / 차량 100 희석 : 선충 플레이트에 웰 당 총 볼륨 1의 결과로 100 μL 될 것입니다. </li><li> 열에 약 판의 3 번째 / 4 번째 컬럼의 1 μl를 추가하여 반복 과정 제 선충 판의 1-5 / 8-12; 열 (6)과 선충 판 7에 차량을 추가 할 수 있습니다.</li><li> 남은 약물 플레이트 열을 테스트하기 위해 계속합니다. 약물 판의 열 (12)로부터 샘플링하여 모든 우물에서 차량 한 선충 판의 최소를 설정합니다. 다시 인큐베이터 20 ~ 22 시간 동안 20 ° C (160 RPM)을 떨고에 습기 챔버에 넣어 판 (8 일 참고 사항을 참조하십시오). </li></ol></li><li> 다음날 발광 버퍼를 파트 준비 : 1 % DMSO 0.15 % 트리톤 X-100을 얻기 위해 완벽한 S의 필요한 볼륨 DMSO 10 % 트리톤 X-100을 추가합니다. 발광 용 플레이트 읽기 당 5 ml를, 플러스 루미 인젝터를 프라이밍 1 ml의 허용. </li></ol></li><li> 8 일 작업 : 실험 엔드 포인트를 읽기 - 형광 및 생물 발광을. (GFP의 형광 판독은 생물 발광 데이터를 정상화하기위한 수단으로 권장합니다.) 주 : 음식 기재된 실험 조건 하에서 상당한 자손 생산을 방지하기 위하여 선충에 제공 한 후 66 ~ 67 시간에서 엔드 포인트를 판독하고자합니다. <ol><li> 설정 판은 GFP 판독에 대한 배경 컨트롤로 사용할 수 있습니다. C15 ML 튜브에 13 번째 판에서 ombine 아니라 내용. 선충은 (2-3 분) 정착하도록 허용합니다. 물론 당 100 μL 세균 현탁액으로 마이크로 (투명 하단에 검은 색)을로드하는 상층 액을 사용합니다. <ol><li> 선충을 볼 수있는 우물 아래로 지적 현미경 배경 제어 판을 준수하십시오. 후속 데이터 분석에 사용되는 배경이 추정치로부터 제외. </li></ol></li><li> 배경 컨트롤을 포함하여 각 96 웰 플레이트의 형광을 읽어보십시오. (설정 : 판의 바닥에서 광학, 20분의 485 여기 필터, 20분의 528 방출.) </li><li> 발광 측정을위한 버퍼를 준비합니다 루시페​​린 (20 mM)을 부품을 제조하는 버퍼 (전날)를 추가, 1 %로 DMSO (1 배), 0.15 % 트리톤 - X100 (3 배) 0.3 MM의 루시페린 (배를 발광 버퍼를 얻기 위해 ). 150 μL 발광 버퍼 프라임 루미 인젝터의 6 배. <ol><li> 이전 단계는 약물 노출시 차량으로 1 % DMSO를 가정합니다. 차량이 물이있는 경우, CO를 조정3 %에 발광 버퍼에 DMSO의 ncentration (즉, 배). </li></ol></li><li> 한 번에 하나의 판으로 작업 할 수 있습니다. 웰 당 50 μL 발광 버퍼를 분배. (물론 150 μl의 최종 부피, 발광 버퍼의 3 배 희석 : 1 % DMSO, 0.05 % 트리톤 - X100 0.1 mM의 루시페린 최종 농도.) 장소 바로 플랫폼을 흔들어 타이머를 시작합니다. <ol><li> 플랫폼 (160 RPM)을 흔들어 3 분 후, 발광 (측정 당 1 초)를 참조하십시오. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 형광 결과에서 읽기 평균 GFP 배경을 뺍니다. 각각의 GFP 읽기에 의해 생물 발광을 나눕니다. <ol><li> 높은 GFP 값은 화합물에 노출 선충에 대해 검출되는 경우, 임의의 화합물의 형광을 고려하여 그 자체 화합물의 형광을 측정한다. 평균보다 높은 경우, 대신에 배경으로 사용합니다. </li></ol></li><li> 익스프레스 생물 발광, GFP 정규화 된 생물 발광의각 플레이트에서의 차량 제어에 대한 평균 값의 비율로 ND GFP 형광 데이터. </li><li> 각각의 농도 평균값과 오차 막대 플롯. </li><li> &#39;농도&#39;, &#39;실험&#39;과의 상호 작용의 효과와 2 웨이에게 분산 (ANOVA)의 분석을 이용하여 유의성에 대한 시험 (각 데이터 포인트는 하나의 웰을 말한다)와 대 (사후 시험으로서 듄 네트의 시험을 사용하여 . 차량 제어). 주 : &quot;실험&quot;또는 &quot;상호 작용&quot;용어가 중요한 경우, 추가 실험이 응답을 확인해야한다. 실험 사이의 변동이 데이터 그림의 관찰로부터 명백한없는 경우, 일방향 ANOVA는 독립적 인 실험으로부터 풀링 된 데이터에 대해 수행 될 수있다. <ol><li> 단 차량 판 (들)의 통계적인 분석을 위해, 컬럼 (6) -7에서 모든 웰과 대조군으로 행 H의 모든 웰을 선택 (이 화합물은 일상적으로 테스트하는 동안 차량에 할당 된 위치에있다). </lI&gt; </ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+phenotypic+gap:+real-time+assessment+of+mitochondrial+function+and+metabolism+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> BMC Physiol. 8, 7 (2008).</li><li>Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+sublethal+toxicity+assessment+using+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans,+a+novel+whole-animal+metabolic+biosensor.">Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor.</a> Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).</li><li>McLaggan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sublethal+levels+of+environmental+pollutants+found+in+sewage+sludge+on+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+biosensor.">Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor.</a> PloS one. 7, e46503 (2012).</li><li>Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+control+of+the+Crabtree+effect+in+ascites+hepatoma+cells.">Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells.</a> Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).</li><li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+the+Crabtree+effect:+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants.">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li><li>Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tobacco-specific+nitrosamine+4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone+(NNK)+induces+mitochondrial+and+nuclear+DNA+damage+in+Caenorhabditis+elegans.">The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans.</a> Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+life+exposure+to+ultraviolet+C+radiation+on+mitochondrial+DNA+content,+transcription,+ATP+production,+and+oxygen+consumption+in+developing+Caenorhabditis+elegans.">Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).</li><li>Kuang, J. J., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+failure+to+extend+lifespan+via+disruption+of+complex+II+is+linked+to+preservation+of+dynamic+control+of+energy+metabolism.">The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism.</a> Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).</li><li>Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans+as+multicellular+eukaryotic+biosensors.">Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors.</a> FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Brenk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learnt+from+assembling+screening+libraries+for+drug+discovery+for+neglected+diseases.">Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases.</a> ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).</li><li>Lagido, C., Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nematodes as environmental indicators. , 225-251 (2009).</li><li>Thorne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+in+chemical+biology:+a+compendium+of+inhibitors,+mechanistic+evaluation+of+chemotypes,+and+suggested+use+as+a+reporter.">Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter.</a> Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).</li><li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism.">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497, 451-457 (2013).</li><li>Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+approaches+to+restore+mitochondrial+function.">Pharmacological approaches to restore mitochondrial function.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).</li><li>Tsang, W. Y., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genome+content+is+regulated+during+nematode+development.">Mitochondrial genome content is regulated during nematode development.</a> Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).</li><li>Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-Consumption+during+Development+and+Aging+of+the+Nematode+Caenorhabditis-Elegans.">Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans.</a> Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).</li><li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development.">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li><li>Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+absorption+efficiency+in+Caenorhbditis+elegans+delivered+by+different+methods.">Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods.</a> PloS one. 8, e56877 (2013).</li><li>Yochem, J., Gu, T., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+marker+for+mosaic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+indicates+a+fusion+between+hyp6+and+hyp7,+two+major+components+of+the+hypodermis.">A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis.</a> Genetics. 149, 1323-1334 (1998).</li><li>Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li><li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans:+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation.">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress:+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae.">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Grow+or+Not+to+Grow:+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest.">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li><li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest.">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li><li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans.">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li><li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media.">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li><li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH,+salinity,+and+hardness+in+aquatic+media.">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li><li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response.">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li><li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans.">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어

모델 생물 C. 엘레은 강력한 실험 시스템을 제공합니다. 그것은 문화가 용이하고 (L4까지 청소년 애벌레 단계 (L1)을 통해) 성인의 재생에 계란에서 3.5 일 라이프 사이클과 풍부한 유 전적으로 동일한 자손을 생산하고 있습니다. 그것의 작은 크기 때문에, 이것은 편리 화합물 스크리닝을 용이하게, 96- 웰 플레이트에서 성장 될 수있다. 우리는 C의 변종에 따라 표현형 검사 프로토콜을 제시 96 웰 플레이트 루미 및 멸균 캐비넷이 요구되지만 에너지 수준의 생체 센서로서 작용 간스. 14 프로토콜은, 모든 실험에 적용 할 수있다. 이 우수 실험실 기술을 이용하여 분석에서 오염을 방지하는 것이 중요하다. 수동으로 작동하는 경우, 달성 가능한 선충 플레이트의 최대 수는 2 × 96- 웰 플레이트의 약물 검사를 허용하고 두 차량 번호판을 포함한 실험 당 13이다. 대표 결과는 내가 rotenon 억제제 미토콘드리아 복잡한 제시된다즉, 슈퍼 옥사이드 발생 파라콰트, 시트르산 회로 중간 옥 살로 아세테이트와 공지 반딧불이 루시퍼 라제 저해 활성을 갖는 화합물 네. 옥 살로 아세테이트는 향상에 ATP의 더 큰 발전에 기인 할 가능성이 주도하는 반면 예측으로 처음 두 화합물은 생물 발광의 감소되었다. 옥 살로 아세테이트 데이터 세트는 또한 리포터로서 개똥 벌레 루시퍼 라제에 기초 실험에서 고유 변화를 보여준다. 3 개의 독립적 인 실험의 최소 알 수없는 화합물에 대한 응답의 안정성을 확인하는 것이 바람직하다. 개똥 벌레 루시퍼 라제 활성의 억제는 시험 관내 분석 상업용 키트를 사용으로 식별 하였다. (3) 화합물 중 하나의 수준을 증가 억제와 일치 GFP 형광의 실질적인 증가를 초래 GFP 표지 된 루시퍼 라제 효소의 활성에 결합함으로써 반딧불 루시퍼 사이트하고 렌더링 더 안정적이다. 어떤 경우에는 15억제제 과량 기판에 의해 변위되면 (되지 특히이 경우) 이는 생물 발광 수준 증가로 이어질 수있다. 15 그것은 것이 중요 반딧불 효소와 상호 작용하는 화합물로부터 잘못하여 결과를 해석되지 ATP 수준을 감소 또는 증가함에 / 미토콘드리아 기능. 발광 신호의 변화는 매우 자주 운동, 발전과 성장으로 건강의 추가 측정과 상관 관계. 생물 발광 신호의 급격한 감소가 검출되지만 웜 현미경 관찰에 의해 대조군과 구별되는 경우 예를 들어, 화합물은 용의자 루시퍼 라제 억제제이다. 하지 성장 또는 자기 형광 화합물에 의해 설명 GFP 형광의 증가는 또한 억제제를 가리킬 수있다. 루시퍼 라제 억제제 (15)의 개수는 알려져 있고 PubChem에 입력되었다. 따라서 첫 번째 인스턴스에서, 그것은 PubChem 보유 루시퍼 라제 억제제에 대한 정보를 참조하는 것이 좋습니다이다; T 다음추가에 의해 미토콘드리아 기능에 대한 효과의 정제 된 효소 3 및 / 또는 확인과 시험 관내 시험 법의 복합 효과 esting. (16, 17) GFP 형광 측정 가능한 생물 발광과 함께이 엔드 포인트를 측정하기위한 강한 케이스를 만들기 반딧불이 루시퍼 라제의 레벨을 검출 (및 전술 한 바와 같이 일부 루시페라아제 효소 저해제의 전위 검출)을 가능하게한다. GFP에 생물 발광 수치의 정상화는 (이 여러 기술의 복제를 포함함으로써 달성 될 수 있지만) 웰 사이 웜 번호의 변화를 차지하기위한 수단이다. 민감도를 들어, 측정에서 배경 형광을 빼는 것이 중요하다. 이 프로토콜은 그러나 선충의 형광도가 현재 분석의 (제한, 어떤 노화 스투에 특히 중요한 회계 처리하지 않은 배경 형광에 세균 현탁액의 공헌을 평가) 나이가 선충의 형광도 증가 주어진 죽는다. 시험 화합물의 자기 형광도 병렬로 평가되어야한다. 연구원 생물 발광 유전자의 발현 수준에서 어떤 변형 차이를 제어하기 위해, 서로 다른 유전 적 돌연변이 또는 다른 유전자의 침묵 후 세포 ATP 풀을 비교하는 프로토콜을 적용하도록 할 때 GFP 정규화 불가결 보인다. 프로토콜 내에서 중요한 매개 변수는 노출이 시작되는 발달 단계, 노출의 길이, 다른 우물에서 선충의 비슷한 번호를 얻기를 포함한다. 노출하지만, 선충의 발달의 모든 단계에서 L3 단계를 시작할 수 이상이 바람직하다. 미토콘드리아 DNA 콘텐츠, 산소 소비와 ATP 수준에서 매우 유의 한 증가에 의해 입증에이 단계에서, 선충은 성인으로 개발을위한 산화 적 인산화에 따라 달라집니다. 18,19,20 본 프로토콜은 박람회를 시작합니다L4 단계에서 URE. (오히려 먼저 L1 단계에서 음식을 구비 한 경우보다) 만이 단계에서 96 웰 플레이트에 선충을 분취하는 이유는, 판이 증발을 최소화하기 위해 습한 챔버에 배치되어 있지만, 증발의 정도가 여전히 발생한다는 것이다 뚜껑에 형성 아주 작은 방울로 볼 우리의 진동 인큐베이터, (이것은 다른 떨고 인큐베이터에 문제가되지 않을 수 있습니다). 단지 표준 약물의 첨가 전에 플레이트에 선충을 분취하여, 실제 약물의 농도로 인해 증발 부피의 임의의 작은 변화에 의해 영향을받지 않는다. 차량 선충 판 넣기 만 선충이 고르게 우물 사이에 분포되어 있는지 확인하는 데 유용합니다. 차량 만 판을 위해 발견 된 유의 한 차이가 우물에 선충을 분배 가난한 기술을 나타내는 것입니다. 노광 길이는 고려해야 할 중요한 요소이다. 독립적으로 성장의 에너지 상태에 대한 효과는 관심, 프로 경우로토콜은 (예를 들면, 거의 즉시 반응에서, 2 시간)보다 짧은 노광을 수용하도록 변경 될 수있다. C.으로 화합물 한편, 엔트리 엘레 조직은 약간의 시간이 걸릴 수 있습니다. 예를 들어 12 ~ 24 시간이 레스베라트롤 및 5- 플루오로 -2&#39;- 데 옥시 우리 딘 (FuDR)의 최대 내부의 농도를 달성하기 위해 요구된다. (21) 따라서, 긴 노출 (18 시간 내지 24)는 노출 레벨을 최대화하기 위해 정당화 될 수있다. 노출 시간은 상당한 수준의 재생이 잘 일어날 수 있도록하지 않는 시간으로 제한되어야한다. 우리는 선충의 총 개발 시간이 66 ~ 67 시간에서 유지하는 것이 좋습니다. 편리하지만, 선충은 그때까지 임신하는하고 egglaying을 시작했다. 그럼에도 불구하고, 우리는 무시할 수 달걀 제제에서 생물 발광 측정하는 결과 (도시 생략). 쉬르 5 프로모터 구동 트랜스 진 발현은 먼저 전용 1시 58분 시간 반 100 세포 단계 22 ℃에서 수정 후 검출hitinous 달걀 껍질은 루시페린의 항목을 제한 할 가능성이있다. 다른 사람은 유정란이 임신하는 성인의 대사에 크게 기여하지 않은 것으로 나타났습니다. (23) 그러나, 중요한 자손의 생산을 가능하게 조건을 피할 수 있습니다. 선호하는 경우, 실험 시간 척도 다시 이동 할 수 있습니다 : 우리는 이전에 늦게 L3 애벌레 단계 (36 시간)에서 환경 독소에 노출을 시작하고 55 시간에서 생물 발광 및 GFP 측정을 수행 한 조건부 멸균 2 또는 유전 적 배경. 예 FER-15 (B16) II에 관해서는, 자손의 생산을 방지하기 위해 사용될 수있다; 15 ℃로 유지 될 수있다 (hc17) IV 이중 돌연변이-1 FEM하지만, 25 ℃에서 멸균한다. (24) 불임을 유도하는 FuDR를 사용하는 것은 그 자체로 선충의 신진 대사에 영향을 미칠 수있는이 권장되지 않는다. (25) 분석 할 수 또한 부분 상실 (SECURITY) 기능을 비활성화로 더 투과 손톱과 균주에서 수행 될 수약제에 민감한 약물의 투과성을 증가 할 예정. (26)이다 이온 버스 8 돌연변이이 짧은 노출과 낮은 화합물 농도를 촉진 할 것이다. 이 선충 루시페린을 추가하는 조건은 또한 발광 버퍼에 1 % DMSO 및 0.05 % 트리톤 X100은 루시페린 가용성을 향상시키기 위해 필요하지 않을 수있다, 즉, 조정 필요가있다. 이 프로토콜은 화합물 배달을위한 차량으로 1 % DMSO를 사용합니다. 우리가 이전 책에서 논의 된 것처럼 치명적인 것은 아니지만, DMSO의 농도는 약간의 생물학적 효과가 있습니다. 가능한 약물 라이브러리의 많은 3 차량의 희석 후 세포 기반 분석에 적합 할 것 농도에서, DMSO 100 % 준비되어있다 0.1 %이다. 높은 화합물 농도에서 C. 반응을 유도하는 데 필요한 엘레가 1 % 미만인 DMSO에서 분석을 수행하는 것이 불가능하도록 인간 세포와 비교할 때. 다시 말하지만, 균주의 사용과더 투과성 손톱은 차량의 낮은 농도로 시험 발생할 수 있습니다. DMSO보다 높은 1 %의 농도는 사용하지 않는 것이 좋습니다. 이전 수치에 루시페린과 세트 배양 시간을 준수해야합니다. 이전에 나타낸 바와 같이, 발광이 다음 30 분에 1 이상의 발광 느린 점진적인 감소이어서, 루시페린 첨가 처음 5 분 동안 비교적 안정 남은 초 후에 분 이내에 최대 농도에 도달한다. 특정 화학 물질에 대한 운동 반응은 루시페린의 초기 분배 후 30 분의 초기 단계에서 수행 할 수있다. 프로토콜 선충 인구의 동기화를 달성하기 위해 계란을 수집 기아 다음 단계를 포함한다. 다른 발달 단계는 세포의 ATP 수준에 차이 및 시험 화합물에 다르게 반응 할 수 있기 때문에 우리는 선충 테스트 인구의 동기화를 권장합니다. S의 전체의 굶주림을 수행함으로써M9에 ​​반대하는 매체로, 부화 선충은 그 애벌레 개발하지 않도록, 탄소원 (에탄올)와 함께 제공되지만 완전히 고갈되지 않습니다. (27, 28) 또한 L1 체포의이 음식에 대한 신속한 대응을위한 준비가 끝났다하고 그 표시되었습니다 정상 L1 증가율 음식 사용할 수있게 한 후 3 시간 내에 달성된다. (29) 그러나, 그것을 가능성 기아 단계 C.의 신진 대사를 변경시킬 수 있음 엘레 배제 할 수 없다. 기아의 길이가 24 시간을 초과하지 않아야이 때문에 30 (18 시간 동기화에 충분하다). 특정 실험실 완전히 고갈 단계를 우회 나이 동기화 COPAS Biosorter를 사용할 수있는 가능성을 가지고있다. 다른 실험실 전에 표백에 (OP50와 NGM 플레이트) 고체 배지에 (단계 3.1) 선충 인구 확대를위한 환경 설정을 가질 수 있으며,이 너무 잘 작동합니다. 우리는 선충의 배양을위한 표준 매체 등의 화합물에 노출시 S 매체를 사용 howeveR 다른 매체 예를 K 매체 또는 EPA 적당히 하드 물, 선택할 수는 종종 생태 독성 연구에 사용됩니다. (31, 32) 프로토콜은 수단 선별하고 미토콘드리아의 기능에 미치는 영향의 측면에서 더 테스트를 위해 후보를 식별 할 수를 제공합니다. 차 심사의 단계에서 그것은 몇 가지 화합물 따라서 약물 화면은 철저한 간주되어서는 안됩니다 때문에 하나의 농도를 테스트 할에 누락 된 가능성이 높습니다. 히트 예컨대 산소 소비 C. 위해 미토콘드리아 기능의 다른 양태를 평가하는 기법의 사용에 의해 확인 될 수있다 엘레는 GFP 표현 미토콘드리아와 균주, 미토콘드리아 막 잠재력 및 / 또는 ROS 측정을위한 얼룩. 16,33,34 방법론의 가장 큰 의미는 다세포 유기체 수준에서 화합물 및 / 또는 조건의 많은 수를 스크리닝하는 방법을 가지고있다, 그리고 중요한 일을 활용 할 수 있도록C의 전자 유전 취급 용이성 행동의 메커니즘을 조사하기 위해 엘레 간스. 이 기술은 가속화하고 흥미로운 화합물 및 대상의 발견에 새로운 경로를 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것은 질병 관련 맥락에서 화합물 라이브러리의 심사에 대한 인간의 질병과 관련된 유전 적 배경을 가진 센서의 조합이 제공하는 많은있을 것이라는 점을 예상한다.

이 절차의 목적은 전반적인 C.의 에너지 상태의 신속한 계량화 화합물 스크리닝에서 엔드 포인트로 이것을 사용하여 볼 수있는 생체 내에서 간스. 이론적 근거는 선충 C에서 반딧불 루시 페라 제의 유전자 발현을 기반으로 플라스미드 pSLGCV (1 통해 엘레 1-3 <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862</a> ). 루시퍼 라제 효소 (신호를 표적 루시퍼 페 록시 제거한) 녹색 형광 단백질 GFP 융합되고 세포질에서 구조적 및 보편적으로 발현된다. 루시페린 기질을 외생 제공되는 경우 이는 발광 리드​​. 웜이 투명하기 때문에, 광은 상대적 광 단위 (RLU)로서 루미 측정 될 수있다. 생물 발광 반응과 가용성 셀룰러 ATP 연료 생산 빛 수준을 결정합니다. 따라서, luminometry은 모든 편의를 제공합니다ATP를 생산하는 미토콘드리아에서 주로 일어나기 때문에 t는 상대적 ATP 수준을 평가 및 미토콘드리아 기능에 의해 확장을 의미한다. 미토콘드리아 기능 및 생물 발광 레벨 사이의 링크는 미토콘드리아 전자 전달계 유전자 및 수반 광 출력의 감소를 통해 이전 사일런 입증되었다. 1 PE254 (feIs4)를 지정하고 생성 된 생물 발광 균주 및 PE255 (feIs5) 1 (자료 목록 참조) 3. 상호 교환 사용할 수있는 다수의 연구는 아 지드 화 나트륨 (1), 카드뮴 (2), 하수 등의 다양한 생체 이물 화학 물질에 노출 된 후 생체 내에서 세포의 ATP 수준에보고 이러한 센서 균주를 활용 한 슬러지 추출물 3, 5&#39;- 플루오로 -2- 데 옥시 우리 딘 (6), 및 담배 특이 니트로사민 7. 균주는 또한 C 자외선 방사선에 대한 노출의 효과를 모니터링하는 데 유용했을 <s업&gt; (8)과 미토콘드리아의 호흡 쇄 기능을 방해의 효과. 1,9-는 GFP 융합 (PE39)없이 루시퍼 라제 유전자를 발현 발광 센서의 초기 버전은 또한 중금속 효과 조사 및 호흡기 사용되고 . uncoupler 10 균주 PE254과 PE255은 루시 페라 제를 수행 : GFP 융합 GFP의 형광 발광 값의 정상화를위한 편리한 수단을 제공하고, 선충 질량에 비례하여 증가 할 것으로 나타났다 6,9 잘 당 벌레의 차동 양의 효과도 될 수 있습니다. 분석 (조건 당 5 우물의 최소)에서 여러 기술 복제를 포함하여 고려. (3) 프로토콜은 에너지 수준의 생체 모니터링의 가능성을 제공한다 (반대로 더 기술적 힘드는 체외 ATP의 결정) 화합물의 스크리닝을 가능하게하고 전체 MU의 생리적 환경에서 재배치lticellular 유기체. 절차 및 / 또는 RNA 간섭에 의한 유전자 사일런 하시어 변이주에 형질 전환 유전자를 염색체에 통합 건너 유전 다양한 배경으로 확장 될 수있다; 따라서, C의 최대한 활용 모델 생물로 간스. 이 방법에 의한 미토콘드리아 독성 약물 후보의 후기 실패를 줄이고 더 높은 동물 실험의 감소를 향해 기여를 할 수 있도록해야한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Orion II Microplate Luminometer</td>
			<td>Berthold Detection Systems</td>
			<td></td>
			<td>with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLx800 fluorimeter&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td>with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ks 130 basic shaking platform</td>
			<td>Ika</td>
			<td>#0002980000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4349</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Refrigerated incubator shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>with eppendorf rotor A-4-44&#160; (for 50/15ml tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette, Costar</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#4489</td>
			<td>Serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 50 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 15 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 60 mm tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#631-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile spatula</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#3007; #3004</td>
			<td>for weighing out chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mM Millex GP filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>#SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#MCT-150-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 well assay plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#3603</td>
			<td>Black plate clear bottom with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96 well assay plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#236105</td>
			<td>White plate with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir reagent 60 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Finnpipette</td>
			<td>#9510027</td>
			<td>used as trough for nematodes&#160; in protocol section 4.4.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage box/damp chamber</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>#10 800 058 001</td>
			<td>174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#239305</td>
			<td>Store in aliquots at 4&#176;C,&#160; seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, potassium salt</td>
			<td>Biotium Inc</td>
			<td># 10101-2</td>
			<td>Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 &#176;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td># P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#317275</td>
			<td>Purity 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>#A16046</td>
			<td>Diltute to 10% in ddH20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#475914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans bioluminescent strains</td>
			<td>Author&#39;s own laboratory</td>
			<td>PE254, PE255</td>
			<td>contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General chemicals</td>
			<td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a screenable in vivo assay for mitochondrial modulators using transgenic bioluminescent caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

방법을 설명하는 대표 결과 로테 논 (도 1), 파라콰트 (도 2), 옥 살로 아세테이트 (도 3), 및 약물 라이브러리 (13) (도 4)의 선별 과정으로서 반딧불 루시퍼 라제 억제제로 선택하고 4 화합물에 대해 수득 하였다. 약물 노출은 모든 경우에 L4 단계에서 시작하고, 음식이 제하지만 다른 화합물에 비하여 45 ~ 46 시간에 제공 한 후 선충 파라콰트 노출 실험은 41 시간에 시작 하였다. 프로토콜은 약물 노출의 개시 및 노광 시간 길이를 선택하는 데있어서 유연성의 정도 허용한다. 그러나, 검사 목적, 설정 시간은 한 번 실험 사이의 재현성을 위해 선택하는 준수해야합니다. 엔드 포인트는 넓은 달걀 누워 우물에서 자손의 부화를 방지하기 위해 66 ~ 67 시간 개발 시간으로 측정해야한다. 타이밍에 대한 지침은 T에서 제공됩니다(1) 수. 로테 논, 내가 억제제 미토콘드리아 복합체는, 농도 범위에 모두 비교적 짧은 (2 시간)과 더 이상 노출 (24 시간) (그림 1) 이후 생물 발광을 감소시켰다. 이때, 어떠한 GFP 측정치가 수행되지 않았지만 기술적 복제 수가 사용 (N = 6)에 웰 (3) 사이에 웜 번호 차이를 고르게하기에 충분하다. 24 시간 노출이 생물 발광의 감소에 기여할 것으로 기대되었다 복잡한 I 억제의 결과로서 선충이 성장하는 동안의 시간 윈도우와 느린 개발이다. 이는 특히 상기와 20 μM의 농도에서, 본 발달 지연과 입체경 하에서 육안으로 확인 하였다; 또한 일부 치사율은 (질적 관찰 정량화되지 않음) 40 μM에서 발견되었다. 어떤 치사율은 2 시간 노출 후 관찰되지 않았다하지만 웜 운동에 효과가 관찰되었다. 제어 occu에 생물 발광 상대적으로 급락로테의 가장 낮은 농도로 rred 효과가 쉽게 2 시간 노출에 빠른 육안으로 검출되지 않았다하는 2.5 μm의를 테스트했다. 생물 발광에있는이 감소는 감소 된 세포의 ATP와 일치한다. 최대 억제가 특이 로테 타겟팅 후속 실험은 0, 5 μM [농도 범위 0-160 μM 사이에 수행되는 것을 나타내는 사용 로테의 최저 농도 (2.5 μM)에 의해 달성 된 다른 약물과 비교의 대상으로 선정 처음에 10 μm의에 심각한 영향이있는 것으로 확인 된 (다른 곳에 게시 할). 제초제 파라콰트는 활성 산소 종의 증가를 통해 미토콘드리아의 기능에 영향을 미친다. 여기, 우리는 C의 생물 발광에 미치는 영향을 보여 24 시간 (그림 2)에 대한 농도의 범위에 노출 된 후 간스 변형 PE254. 변형 루크 :: GFP 융합을 수행으로, GFP의 형광은 루게릭 병이었다O 정규화하는 수단으로 측정 하였다. 6,9- 파라콰트 크게 생물 발광, GFP 형광 정규화 생물 발광을 감소시켰다. 둔넷 (Dunnet) 사후 시험 차량 제어와 관련하여 상당한 차이 파라콰트의 농도를 생물 발광과 정규화 생물 발광 4 및 8 mm로했다뿐만 아니라 정규화 생물 발광 2 mM의 것으로 나타났다. 크게 GFP의 형광을 줄일 수있는 유일한 농도는 mM의 성장 효과와 가끔 죽은 웜 (질적 관찰) 관찰되었다되는 농도 (8)이었다. 생물 발광 (정규화 생물 발광)의 감소, 미토콘드리아의 기능과 ATP 생산에 대한 영향 감소와 일치 형광보다 더 컸다. C. 테스트 시트르산 회로 중간 옥 살로 아세테이트 8 mm의 단일 농도 간스 변형 PE254은 생물 발광의 증가 (그림 3)되었다. 아니 GFP의 형광 없습니다NCE 측정치가 얻어 또는 추가 육안 관찰을 행 하였다; 그러나 하나의 농도에 이러한 반응은 더 농도 범위에 확증 노출 효과의 자세한 관찰을받을만한 것이다. 그것은 그럼에도 그것이 GFP 형광을 평가하여 루시페라아제 수준에 어떤 효과를 제어하는​​ 것이 바람직 할 것이다 ATP (궁극적으로 더 생산, 시트르산 사이클의 더 큰 활성을 이끌어 가정 될 수있는이 화합물에 의한 생물 발광의 향상은 놀라운 일이 아니다 후속 실험에서). 옥 살로 아세테이트 데이터 세트는 루시퍼 기초 실험에서 본 응답 변동의 정도를 나타내 도시. 경험상 이러한 가변성은 특히 덜 해로운 노광 조건에 대한 테스트 시스템의 기능이다. 반딧불이 루시퍼 라제 저해 화합물 DDD00001434는 DDD0001477, DDD00000635과 DDD00023047는 폴리 우레탄에 효과를보고 시험관 모두를 시험 하였다rified 및 생체 내에서 효소를 사용하여 C. 엘레의 루크 : GFP 변형을 표현. 시험 화합물 중 노광 조건 하에서 선충 사멸을 초래한다는 증거는 없었다. 모든 4 화합물 (25) 및 100 μM (도 4a)를 테스트 2 농도에서 시험 관내에서 루시페라아제 활성에 영향을 미쳤다. DDD00001434는 생체 내 생물 발광 (그림 4B)의 큰 감소를위한 신뢰할 수있는 명분을 제공하는, 거의 완전히 정제 된 루시 페라 제의 활성을 죽였다. 직접 비교하지 않지만, 시험 관내 및 생체 내 분석에서 DDD00023047에 응답하여 두 분석에서 유사했다. DDD0001477과 DDD00000635는 체외보다 생체 내에서 더 큰 감소를 일으키는 원인이되었다. 이들 화합물은 22 시간 전에 루시페린 기판 라이브 웜에 제공하고, 결과 루시페린이되었을 때 그들이 쉽게 루시퍼 라제 활성 부위에서 변위되지 않은 것을 반영 available가. 또한, DDD0001477 및 DDD00000635 셀룰러 ATP 수준에 추가적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이 반딧불 루시 페라 제를 포함하지 않는 방법에 의해 평가되어야 할 것이다. 참고로 DDD00000635을 화합물에 노출 라이브 웜에 GFP 신호의 강한 강화했다. 이는 이하에서 논의 될 것이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> 미토콘드리아 복합체 I은도 1은 C. 로테의 에너지 상태를 감소 억제제 엘레 스트레인 PE254의 생물 발광에 의해 측정. 동기화 L4 스테이지 웜 0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 2, 1 % DMSO 내의 160 μM 로테 노출 (45-46 시간 L1 유충에 제공 음식 후) 시간 (짧은) 또는 각각 48에서 24 시간 (긴 노출) 생물 발광의 사전 판독 및 웜 개발의 69 시간 음식을 제공 한 후. 생물 발광 단위 (상대 라이트 유니트, RLU)을 차량 (1 % DMS의 백분율로 나타내었다O) 값. 오차 막대는 각각의 농도에서 로테 복제 기술의 SEM을 도시한다 (N = 6). 테스트 한 모든 농도는 비히클 대조군 (p &lt;0.001)에 관하여 매우 유의 한 차이의 결과. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> 산화 적 스트레스에 파라쿼트도 2는 C.의 에너지 상태를 감소 (생물 발광 측정) 농도 의존적으로 간스 스트레인 PE254. (L1 유충에 제공 음식 후 41 시간에서이 경우에 편리) 동기화 L4 스테이지 웜은 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 또는 8로 노출시켰다 24 시간 동안 MM의 파라쿼트. GFP의 형광 (단위 상대 형광 단위, RFU)는 생물 발광 데이터 (단위 RLU), 65 시간 개발에서 얻은 두 엔드 포인트를 정상화하는 데 사용되었다. 컨트롤 데이터의 비율 (1 % DMSO)로 표현된다. 오차 막대는 기술 복제의 SEM을 묘사(N = 서로 다른 농도 5, N = 18 컨트롤). 일원 분산 분석 : *** P &lt;차량 제어 0.001 상대. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> 그림 3. TCA 회로의 중간 옥 살로 아세테이트 (8 mM)을 C의 생물 발광을 강화 엘레 변형 PE254. 동기화 L4 무대 웜 (L1 유충에 제공 음식 후 45 ~ 46 시간)을 갓 30 분 ± 18 시간 동안 8 MM의 옥 살로 아세테이트 준비에 노출되었다. 생물 발광도 (RLU)을 ± 63.5 시간 1 시간의 발달시 판독하고, 차량 제어의 백분율로 표현 하였다 (DDH 2 O). 다른 열은 동일한 실험에서 서로 다른 96 웰 플레이트에 분배 8 기술 복제의 다른 데이터 세트를 나타낸다. 오차 막대는 기술 복제의 SEM을 묘사 (N = 8). 이 방법-ANOVA &#39;설정&#39;과 &#39;집중&#39;요소로와 : ̵6; 설정 &#39;P&gt; 0.05,&#39;농도 &#39;P &lt;0.001과 상호 작용 용어 P&gt; 0.05. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> (B) <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> 반딧불 루시 페라 제 발광에 알려진 억제 활성 (DDD00023047 : DDD00001434, C2 : DDD0001477, C3 : DDD00000635 및 C4 C1) 던디 신약 화합물 라이브러리 (13) 4 화합물에 대한 응답 그림 4. 테스트. 정제 된 반딧불 루시퍼 라제의 활성에 대한 화합물 (A) 효과, (빛 단위로 측정 RLU) 비히클 대조군에 대한 백분율로 나타냈다. ATP 생물 발광 CLSII 키트 (로슈, 만하임, 독일)의 웰 (96-w 백색에 분주 루시퍼 라제 효소의 동일한 양의 지시에 따라 사용 하였다엘 마이크로 타이 터 플레이트). 10 μM ATP 및 화합물 1 μL의 최종 농도를 제공 하였다 (최종 농도를 나타냄) 또는 DMSO (1 %)를 첨가 하였다. 발광 신호는 10 초 동안 통합되었습니다. 오차 막대는 기술 복제의 SEM을 묘사 (N = 4). 분석 : 일원 분산 분석; * p &lt;0.05 *** p &lt;차량 제어에 대하여 0.001. 및 C2와 C3 상당한 (각각 DDD0001477 및 DDD00000635; P &lt;0.05). GFP의 형광에 (B) 생물 발광의 생체 측정, 표준화 된 생물 발광하고, C1 (P &lt;0.001 DDD00001434)에 매우 중요한 25과 100 μm의 차이점 C.의 GFP 형광 22 시간 동안 시험 화합물에 노출 된 후 67 시간 개발시 엘레 변형 PE254. 오차 막대는 기술 복제의 SEM을 묘사 (N = 8). 통계 분석 (편도-ANOVA)는 3 데이터 세트 (3 XN = 8)에서 풀링 된 데이터에 대해 수행. * p &lt;0.05 *** p &lt;각 차량 제어에 대하여 0.001. DifferenC4 (DDD00023047)에 노출 된 다음 정규화 된 생물 발광에 대한 25 100 μM 만 통계적으로 유의 한 (P &lt;0.05) CES. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 하루의 시간 </td><td> 1 일 </td><td> 2 일 </td><td> 3 일 </td><td> 4 일 </td><td> 5 일 </td><td> 6 일 </td><td> 7 일 </td><td> 8 일 </td></tr><tr><td> 9 ~ 10 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 5 단계 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 5 단계 </td></tr><tr><td> 11 ~ 12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 4 단계 </td><td> 5 단계 </td></tr><tr><td> 12 ~ 13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 4 단계 </td><td></td></tr><tr><td> 13 ~ 14 </td><tD&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14 ~ 15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 ~ 16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> 1 단계 </td><td></td><td></td><td></td><td> 3 단계 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> (17 ~ 18) </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> 2 단계 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 프로토콜 단계 표 1. 개요 선충 실험의 각 날에 (3 절)을 수행하고 타이밍을 제안한다.

Watch this Scientific Journal Video about A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans at JoVE.com

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Screenable<em&gt; 생체</em&gt; 형질 전환 발광 생물을 사용 미토콘드리아 변조기에 대한 분석<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

a-screenable-vivo-assay-for-mitochondrial-modulators-using-transgenic

Research

JoVE Journal

Biology

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

9.9K 조회수.  University of Aberdeen. A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function. 

비디오: A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

연구

생물학

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

트렌스 제닉의 생성 C. 엘레간스 Biolistic 변환에 의해

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

의 시각화 Caenorhabditis Elegans</emLipophilic 바이탈 염료, DiI를 사용하기> 표피 구조

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

GIRK 채널의 변조기를 식별을위한 형광 검사 분석

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

에서 프로스타글란딘 추출 및 분석<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.