Name: laminar flow-based assays to investigate leukocyte recruitment on cultured vascular cells and adherent platelets
Uploaded: 2018-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets at JoVE.com

우리는 박사 마틴 M. 슈미트와 선 Fraemohs 감사합니다. 이 작품 (ZonMW VIDI 016.126.358, 혈액 수혈 연구 (LSBR Nr. 1638) Landsteiner 재단 및 도이치 가운데 (SFB1123/A2) R.R.K.에 게 수 여 과학적인 연구를 위한 네덜란드 기초에 의해 지원 되었다

여기에 설명 된 모든 메서드는 의료 윤리 및 동물 윤리 보드의 마스트리히트 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 플로우 기반 분석 결과 인간 세포와
<ol><li>
인간의 혈액에서 혈소판의 분리
	<ol>
<li>응고 제 시트르산 (3.2%)에서 정 맥 혈액을 그립니다.</li>
		<li>1/15 양의 산 시트르산 포도 당 추가 (ACD: 80mm trisodium 시트르산, 52 m m 구 연산 및 183 mM 포도 당) 피를.</li>
		<li>혈소판 풍부 혈장 (PRP)를 15 분 동안 브레이크 없이 350 x g에서 원심.</li>
		<li>15 mL 원뿔 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 ACD의 1/20 볼륨을 추가 합니다.</li>
		<li>혈소판 가난한 플라스마 (PPP)를 15 분 동안 브레이크 없이 1,110 g에서 원심.</li>
		<li>폐기는 상쾌한. 피펫으로 팁 (P 1000)의 끝을 잘라, 그것 넓은 구멍, 혈소판 활성화의 예방에는 에이즈 그리고 신중 하 게 혈소판 버퍼 ph 6.6 PRP와 동일한 볼륨에 혈소판 펠 릿을 일시 중단 (PB: 136 m m NaCl, 10 mM Hepes 2.7 m m KCl, 2 mM MgCl2, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 및 0.1% 포도 당). ACD의 20 분의 1 볼륨을 추가 하 고 부드럽게 혼합.</li>
		<li>15 분 동안 브레이크 없이 1,110 g에서 혈소판 작은</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 신중 하 게 위에 혈소판 1 mL 혈소판 버퍼 (pH 7.5) 일시 중단.</li>
		<li>자동된 혈액학 분석기 1/10 희석에서 혈소판 농도 측정 합니다.</li>
		<li>2 x 107/mL의 수를 달성 하기 위해 혈소판 버퍼 (pH 7.5)로 볼륨을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(Brinkmann 외. 에서 적응 하는 인간의 혈액에서 polymorphonuclear 세포의 고립 11 )
	<ol>
<li>헤 파 린 (10 U/mL)로 응고 제 24 mL의 혈액을 그립니다.</li>
		<li>1.077 g/mL 밀도 polysucrose 나트륨 diatrizoate 매체의 6 mL을 추가 ( 재료의 표참조) 15 mL 원뿔 튜브, 그리고 신중 하 게 위에 레이어 5-6 mL 전 혈을.</li>
		<li>브레이크 없이 800 x g에서 20 분 동안 원심 분리기.</li>
		<li>발음 하 고 명확한 노란 가기 레이어를 삭제 낮은 붉은 단계 granulocytes 신선한 15 mL 원뿔 튜브에 포함 된 전송. 2 mM EDTA 14 mL, 및 브레이크 없이 300 x g에서 10 분 원심 분리기의 최종 볼륨을 포함 하는 PBS를 추가 하 여 셀을 씻어.</li>
		<li>한편, 밀도 그라데이션 중간 준비 (예를 들어, percoll, 재료의 표참조) 2 mL PBS 재고 솔루션 x 10와 18 mL 밀도 그라데이션 매체를 혼합 하 여 작업 솔루션. PBS이 작업 솔루션을 희석 (1x) 85%, 80%, 75%, 70%, 그리고 65% 그라데이션 중간 솔루션 4.25 mL를.</li>
		<li>서로 모든 중간 비율의 2 개 mL를 레이어 링 하 여 밀도 그라데이션으로 2 원뿔 튜브를 준비 합니다. 가장 높은 농도 함께 시작 하 고 감소 하는 순서에서 계속. 튜브에 레이어 방수 표시와 함께 표시 합니다.</li>
		<li>신중 하 게 각 두 준비 그라디언트에 세포 현 탁 액의 2 mL 레이어.</li>
		<li>신중 하 게 균형된 원심 분리기에서 브레이크 없이 800 x g에서 20 분 동안 원심 분리기.</li>
		<li>원심, 후 상위 계층 및 65%의 대부분을 제거 레이어 (첫 번째 링) PBMCs, 그리고 interphases 85% 계층까지 남은 화이트 새로운 튜브에 수집 (두번째 반지, PMN).</li>
		<li>PBS 2 m m EDTA, 튜브 및 브레이크 없이 300 x g에서 10 분 원심 분리기를 작성 하 여 세포를 씻어.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 행 크의 버퍼 (pH 7.45), 포함 10 mM Hepes 및 0.2% 인간의 알 부 민 (분석 결과 버퍼)의 1 mL에 sedimented 셀 (일반적으로 ≥95 %는 PMN) 일시 중단.</li>
		<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀 및 셀 1 x 106/mL에서 일시 중단.</li>
		<li>형광 라벨 및 관류 백혈구 (단계 3.3)의 계속.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
준비의 부착 혈소판-혈관 세포-monolayers
	<ol>
<li>
세포 배양 접시 준비 (경작된 한 세포)
		<ol>
<li>미리 희석된 쥐 꼬리 콜라겐 (30 µ g/mL PBS 0.2 µ m 필터를 통해 필터링에 희석)의 1 mL와 함께 35 mm 셀 문화 요리 코트.</li>
			<li>37 ° C에서 30 분 동안 incubate 콜라겐 솔루션을 삭제 하 고, 한 번 PBS 가진 접시를 세척.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
문화 요리에서 혈관 세포의 문화
		<ol>
<li>주 (예를 들어, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) 또는 (예를 들어, EA 불멸 하 게 혈관 세포 분리. Hy926, SVEC) 1.5 mL 셀 분리 솔루션 (예를 들어, accutase) T75 플라스 크에 합류를 성장. 세포 분리 솔루션 무력화 챔버 계산 셀 셀 농도 결정 하는 적절 한 성장 매체의 4.5 mL를 추가 합니다. 적절 한 성장 매체 (예를 들면, 완전 한 내 피 세포 성장 매체)에 105 셀/mL x 0.5에서 세포를 일시 중단 합니다.</li>
			<li>각 35 mm 접시에 세포 현 탁 액의 2 개 mL를 추가 합니다. 5% CO2 와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 셀 (셀 유형에 따라 24-48 h 복용) 합류까지 문화.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
유리 coverslip 준비 (혈소판 부착)
		<ol>
<li>HCl EtOH에 한 번 유리 coverslip 담가 (1.2 M / 50 %v / v).</li>
			<li>초순에 2 번 coverslip 린스.</li>
			<li>N2coverslip 건조.</li>
			<li>사전 코트 유리 coverslip 희석된 쥐 꼬리 콜라겐의 관류 챔버의 채널의 위치에 따라 100 µ L와 난 (30 µ g/mL PBS 0.2 µ m 필터를 통해 필터링에 희석)을 입력 합니다.</li>
			<li>RT에서 30 분 동안 품 어 콜라겐 솔루션을 삭제 하 고 씻어 coverslip 3 x PBS.</li>
			<li>실시간에서 0.5 h HEPES에 1 %BSA 콜라겐 코팅 coverslip 차단</li>
			<li>세척 하 고 건조는 coverslip 관류 챔버에 탑재. 격리에서 인간 혈소판 또는 각각 1.1 또는 2.1, 단계에 설명 된 대로 마우스 피.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
혈소판의 동원 정지
		<ol>
<li>채널당 2 x 107/mL 혈소판 정지의 70 µ L을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO21.5 h에 품 어.</li>
			<li>신중 하 게 형광 라벨 및 백혈구 (단계 3.3)의 재 관류와 실시간 계속에서 적어도 30 분 동안 차단 솔루션 (HEPES에 5 %BSA) 비 점착 혈소판 대체.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
혈관 세포 단층의 자극
		<ol>
<li>37 ° C, 5% CO2에서 4 h에 대 한 신선한 미디어 10 ng/mL 종양 괴 사 인자 α (TNFα)를 포함 하는 미디어를 대체 하 여 혈관 세포를 자극.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 플로우 기반 분석 Murine 셀
<ol><li>
마우스의 혈액에서 혈소판의 분리
	<ol>
<li>심장 빵 꾸에서 21 G 바늘 (~ 1 mL)을 사용 하 여 그리기 피 취 (마 취 제 80 mg/kg 및 medetomidine 0.3 mg/kg) 6-8 주-오래 된 마우스 (C57Bl/6)로 응고 제 시트르산 (3.2%)에서.</li>
		<li>ACD의 1/6 볼륨을 추가 합니다.</li>
		<li>220 x g에서 원심 분리기, 혈소판 풍부 혈장 (PRP)을 얻기 위해 5 분 동안 중간 브레이크.</li>
		<li>새로운 튜브에 적혈구의 1/3 플러스 상쾌한 (~ 600 µ L)를 전송</li>
		<li>6 분 브레이크 없이 95 x g에서 원심.</li>
		<li>상쾌한 (PRP)을 전송 하 고 Tyrode의 버퍼에 1/10 희석에서 혈소판 농도 측정 (TH 버퍼: 136 m NaCl, 5 mM Hepes, 2.7 m m KCl, 0.42 m NaH2포4m m * H2O 2 m m MgCl2, 0.1% 소 혈 청 알 부 민, 0.1% 포도 당) 자동된 혈액학 분석기.</li>
		<li>ACD + 0.1 U/mL apyrase의 1/25 볼륨을 추가 하 여는 혈소판을 세척 하 고 2,870 g, 2 분 동안 중간 브레이크에서 원심.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 600 µ L TH 버퍼, ACD의 1/10 볼륨 및 0.1 U/mL apyrase를 추가 합니다. 피펫으로 팁 (P 1000)를 잘라 넓은 만드는 보어, 혈소판 활성화의 예방에서 원조 하 고 부드럽게 펠 릿을 일시 중단.</li>
		<li>2,870 g에서 원심 분리기, 2 분 동안 중간 브레이크</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 부드럽게 일 버퍼에는 혈소판을 일시 중단.</li>
		<li>2 x 107/mL의 수를 달성 하기 위해 일 버퍼와 볼륨을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
혈소판 부착 monolayers의 준비
	<ol>
<li>1.3.3 당 유리 coverslip (부착 혈소판)를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
혈소판의 동원 정지
	<ol>
<li>채널당 2 x 107/mL 혈소판 정지의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO21.5 h에 품 어.</li>
		<li>신중 하 게 형광 라벨 및 백혈구 (단계 3.3)의 재 관류와 실시간 계속에서 적어도 30 분 동안 차단 솔루션 (HEPES에 5 %BSA) 비 점착 혈소판을 바꿉니다</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스 혈소판 단층의 자극
	<ol>
<li>백혈구 (단계 3.3)의 관류, 전에 트 롬 빈의 관류에 의해는 혈소판을 자극 (0.5 nM) 37 ° c.에 3 분 동안 HHHSA 버퍼에</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 형광 라벨 및 백혈구 (PMN 또는 인간과 RAW264.7 THP-1 또는 Murine 플로우 기반 분석 결과 대 한 기본 마우스 Monocytes)의 관류
<ol><li>
형광 라벨
	<ol>
<li>셀 permeant 녹색 형광 핵 산 얼룩 (1 µ M) 백혈구 (1 x 106/mL) 레이블을. 37 ° c.에 30 분에 대 한 셀을 품 어</li>
		<li>5 분, 300 x g에서 원심 분리 하 여 PBS 가진 세포를 세척 하 고 0.5 x 106 셀/mL (5 mL 당 유량에 따라 테스트 조건) 분석 결과 버퍼에서의 농도에 세포를 중단.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
흐름 챔버 시험 준비
	<ol>
<li>셀 단층에 백혈구 접착, 세포 배양 접시에서 삭제 하 고 흐름 챔버에 조립. 주사기에 튜브를 연결 합니다. 고정된 혈소판에서 백혈구 접착, 주사기에 마이크로 슬라이드를 연결 합니다. 미리 따뜻한 물 목욕 37 ° c</li>
		<li>받아 관류 주사기 (50 mL), 설치 주사기 주사기 홀더, 및 세트에 펌프 철회 모드. 0 ml, 펌프 볼륨을 설정 하 고 50 mL 주사기 26.70 m m 직경 설정.</li>
		<li>튜브의 한쪽 끝을 팔꿈치 luer 커넥터를 연결 합니다. 주사기에 luer 잠금 커플러 놓고 luer 잠금 커플러를 팔꿈치 luer 커넥터와 튜브를 연결 합니다. 흐름 약 실에 무료 튜브 끝을 연결 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
백혈구 관류 및 접착
	<ol>
<li>셀 단층에 백혈구 접착, 세포 배양 접시에서 삭제 하 고 흐름 챔버에 조립. 주사기에 튜브를 연결 합니다. 고정된 혈소판에서 백혈구 접착, 주사기에 마이크로 슬라이드를 연결 합니다.</li>
		<li>백혈구 관류와 접착에는 혈관에 대 한-또는 혈소판 단층, 분석 결과 버퍼 채우기 1 mL 피펫으로와 튜브를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 두 번째 튜브 다음 놓고, 튜브를 집어넣은 흐름 챔버에 연결.</li>
		<li>백혈구 관류, 이전 세포 현 탁 액을 3mm CaCl2 와 2 mM MgCl2 를 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 품 어</li>
		<li>챔버와 튜브에서 가능한 공기를 제거 하는 셀의 관류 사전 분석 결과 버퍼 perfuse</li>
		<li>꽉 그들을 당기고 하 여 튜브 끝을 닫고 갇혀에서 기포를 방지 세포 현 탁 액을 분석 결과 버퍼에서 튜브를 전환 합니다. 첫 번째 셀 도착할 때까지 적절 한 흐름 속도/전단 응력으로 셀을 perfuse.</li>
		<li>2 분에 대 한 적절 한 흐름 속도/전단 응력으로 셀 perfuse 및 (예를 들어, EVOS FL) 거꾸로 위상 대비/형광 현미경으로 압 연 및 부착 세포의 2-6 분 사이 6 사진을 캡처할 100 배 확대를 사용 하 여 연결 에 디지털 CCD 또는 CMOS 카메라. 참고: 흐름 속도/전단 응력 흐름 챔버 크기와 perfusate의 점도에 따라 달라 집니다. 여기에서 사용 하는 관류 챔버에 대 한 ( 재료의 표참조): Τη= *Φ 97.1* Τ: 전단 응력 (1 dyn/cm2) Η: 점성 (0.015 dyn * s/cm2) Φ: 유량 (0.67 mL/min)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
백혈구 드 접착
	<ol>
<li>De-adhesion에서 덫을 놓아 되 고 기포를 방지 튜브를 압박 하 여 분석 결과 버퍼에 셀 서 스 펜 션에서 튜브를 전환 합니다.</li>
		<li>세포 관류 적절 한 흐름 속도/전단 응력 (참조 3.3.7 참고) 분석 결과 버퍼와 분리 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
백혈구 환생
	<ol>
<li>백혈구 환생에 대 한 백혈구 (3 단계) perfuse는 적절 한 양의 백혈구 준수 (~ 50 셀/보기 분야) 때까지.</li>
		<li>분석 결과 버퍼에 백혈구 정지를 바꿉니다.</li>
		<li>시간 경과 의해 37 ° c.에 30-60 분 마다 10-15 s transmigrating 셀을 기록</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+immune+deficiencies+with+defects+in+neutrophil+function.">Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function.</a> American Society of Hematology. 2016 (1), 43-50 (2016).</li><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues.">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li><li>Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+immune+system+interactions+in+atherosclerosis.">Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).</li><li>Wang, Y., Sakuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+engagement+of+platelet+glycoprotein+Ibalpha+via+the+integrin+Mac-1+is+critical+for+the+biological+response+to+vascular+injury.">Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury.</a> Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).</li><li>Zhao, Z., Vajen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+junctional+adhesion+molecule+A+from+platelets+increases+early-stage+neointima+formation+after+wire+injury+in+hyperlipidemic+mice.">Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice.</a> Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).</li><li>Wang, Y., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+integrin+Mac-1+regulates+thrombosis+via+interaction+with+platelet+GPIb&#945;.">Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIb&#945;.</a> Nature communications. 8, 15559 (2017).</li><li>Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS-based+microfluidic+devices+for+biomedical+applications.">PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications.</a> Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).</li><li>Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+shear+viscosity+and+shear+rate+from+pressure+drop+and+flow+rate+relationship+in+a+rectangular+channel.">Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel.</a> Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).</li><li>Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+junctional+adhesion+molecule-a+guides+monocytes+into+flow-dependent+predilection+sites+of+atherosclerosis.">Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis.</a> Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 생체 외에서 분석 결과 혈관 염증, 동안 백혈구 신규 모집의 기본 메커니즘을 조사 하는 간단한 방법 이지만 지적을 몇 가지 중요 한 포인트는. 이 분석 결과 성공적으로 수행 하기 위한 첫 번째 요구 사항은 백혈구는 그대로 고 confluent 혈관 또는 혈소판 단층의 살포 이다. 이 사전 코팅 콜라겐 유형 표면의 난에 의해 얻을 수 있습니다. 일반적으로, 주요 혈관 세포를 작업할 때 그것은 부?...

부상, 염증, 또는 감염, 백혈구 신속 하 게 응답에 병원 체 또는 손상-관련 된 분자 패턴 (PAMPs, DAMPs)는 활성화 상태로 변경 하 고 혈 류 염증과 조직 손상의 사이트로 이동 합니다. 백혈구의 능력을 그들의 세포질이 고 분자 환경 상호 작용 하는 그들의 올바른 기능에 필수적 면역 세포, 백혈구 접착 결핍증1등 유전 질환에 의해 강조입니다. 백혈구 접착은 지난 수 십년 동안 강렬한 수 사의 대상이 되고있다 그리고 이것은 초기 1990 년대2,3백혈구 접착 폭포의 개념 귀착되. 백혈구 접착 일으키는 혈관 표면 롤오버 셀 피에 백혈구의 selectin-중재 캡처로 시작 됩니다. 이 압 연 백혈구를 endothelium 바인딩된 철새 신호, 예를 들면, 발산, integrins의 활성화를 유도 대 한 검색을 수 있습니다. 그 후, 활성화 integrins 회사 백혈구 체포 결과 내 피 ligands 바인딩 중재. 백혈구 수 있습니다 이후 크롤링 및 확산, 내 피 단층을 관통 하 고 기본 조직으로 transmigrating 하기 전에 extravasate를 준비 합니다. 정식 백혈구 캐스케이드의 기본 개념은 그것의 소개부터 크게 불변에 남아 있었다, 몇몇 중간 단계 추가4. 그럼에도 불구 하 고, 정확한 분자 메커니즘 및 백혈구 신규 모집에서 포함 된 많은 선수의 역할을가지고 하지 명확히 지금까지, 그리고 백혈구 신규 모집의 감염, 염증, 그리고 (자동-) 면역 분야에서 중요 한 주제에 남아 있다 연구입니다.
예를 들어 동맥 경화 같은 혈관 염증 성 질병, 중 혈관 벽 드라이브 패 개발에 백혈구 신규 모집 증가. 불안정 한 동맥 경 화성 플 라크 파열 수, 혈소판 및 응고 시스템의 대규모 활성화 하 고 그 후 선박5의 폐색을 선도 합니다. 이 심근 경색 이나 뇌졸중 등 심각한 심장 혈관 결과 발생할 수 있습니다. 또한, 백혈구 및 혈소판 (예를 들어, 매트릭스 구성 요소와 부드러운 노출된 혈관 벽 내부에의 상호 작용의 수많은 연결 예: 관상 동맥의 stenting 후 그것으로 내 피 노출 발생 임상, 근육 세포)와 혈소판 혈관 상해 취재와 백혈구의. 이러한 상호 작용은 monocyte 혈소판 상호 작용 neointima 형성6,7드라이브 수 있습니다 질병의 추가 개발을 위한 중요 합니다. 또한, 혈소판-백혈구 상호 작용 백혈구 integrin 맥-1 (αMβ2)에 의해 중재 및 혈소판 GPIbα 최근 쥐8혈전 증의 새로운 드라이버 확인 되었습니다.
연구, 그리고 고립 된 매트릭스 분자의 광범위 한 스펙트럼, 불멸 하 게 세포 백혈구와 혈관 근원의 라인에 대 한 백혈구 및 혈소판의 원천으로 인간과 동물성 혈액의 넓은 가용성을 감안할 때, 그것은 백혈구를 시뮬레이션 가능 설정, 특별히 설계 된 흐름 관류 챔버를 사용 하 여 실험실에서 흐름에서의 상호 작용 많은 변종 접착 관류 챔버 진공 기반에서 지난 수 십년 동안 설계 되었습니다. 모든 이체는 공통점이 움직이지 부분 (예를 들어, 교양된 혈관 세포 또는 매트릭스 단백질)으로 더 큰 누출 방지 챔버를 움직이지 부분에 체액의 관류를 사용 하는 미리 정의 된 채널을 갖춘 조립. 또한, 성형 기술 진보 실리 카 폴리머9기반 맞춤 솔루션의 개발을 사용할 수 있습니다. 점도 perfused 액체의 유량과 채널의 높이 주로 흐름 관류 장치10의 전단 응력 특성을 결정합니다. 이 문서에서는, 우리는 생체 외에서 접착의 기본 메커니즘 연구, 드 접착, 방법 및 정 맥 및 동맥 흐름 정권에서 백혈구의 환생 제시. 여기에 제시 된 방법의 장점은 그들은 일반적인 카메라 연결 된 형광 현미경을 사용 하 여 수행할 수 있습니다 하 고 높은 기술 능력을 보유 하는 경험을 필요 하지 않습니다. 생체 외에서 시험 (예를 들어, 추가 억제제 또는 항 체를 차단 하 여), 여러 가지 방법으로 조작할 수 있습니다 따라서 혈관 염증의 다른 모델에 적용 그리고 접착의 조사 단백질 기능을 허용 또는 특정 화합물의 평가입니다.

<table><tbody><tr><td>Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pump &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; model: 210-CE</td><td>&amp;nbsp;world precision instruments</td><td>78-9210W</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td><td>corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>228-0700</td><td></td></tr><tr><td>Elbow Luer Connector Male</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Female Luer Lock Coupler</td><td>Ibidi</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>Flow chamber</td><td>University Hospital RWTH Aachen</td><td></td><td>Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Str&amp;ouml;mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorg&amp;auml;ngen an Zelloberfl&amp;auml;chen. 2005.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ibidi sticky slide VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips for sticky slides&amp;nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type I, rat tail</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TNF-&amp;alpha;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6)</td><td>Anaspec / Eurogentec</td><td>24191</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt Solution 10x</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer solution 1M, liquid</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>15630049</td><td></td></tr><tr><td>BUMINATE Albumin, 25%&amp;nbsp;</td><td>Baxter</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>Water for injection</td><td>B. Braun</td><td>3624315</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Merck</td><td>102382&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-12203</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-22010</td><td></td></tr><tr><td>Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)</td><td>ATCC</td><td>&amp;nbsp;PCS-100-011</td><td></td></tr><tr><td>Vascular Cell Basal Medium&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-030</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Kit-BBE</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-040</td><td></td></tr><tr><td>Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-012</td><td></td></tr><tr><td>Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-042</td><td></td></tr><tr><td>Human endothelial cell line, EA.hy926</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2181</td><td></td></tr><tr><td>Human Monocytic cell line, THP-1</td><td>DSMZ</td><td>ACC-16</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 with Ultra-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F/U1</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monocyte/macrophage RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM), high glucose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin</td><td>Becton Dickinson</td><td>367876</td><td></td></tr><tr><td>VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood</td><td></td></tr></tbody></table>

laminar flow-based assays to investigate leukocyte recruitment on cultured vascular cells and adherent platelets

부상이 나 염증 부상 또는 조직 손상의 사이트에 따라 백혈구의 채용 최근 수십 년 동안 조사 되 고 백혈구 접착 폭포의 개념에 결과 있다. 그러나, 정확한 분자 메커니즘 백혈구 신규 모집에 참여 하지 아직 완전히 확인 되었습니다. 백혈구 신규 모집의 감염, 염증, 그리고 (자동) 면역 연구 분야에서 중요 한 주제를 유지, 이후 우리 접착의 기본 메커니즘 연구, 드 접착, 간단한 층 플로우 기반 분석 결과 제시 및 정 맥 및 동맥 흐름 정권에서 백혈구의 환생. 생체 외에서 분석 결과 백혈구와 혈관 염증의 다른 모델에서 세포 파트너 간의 상호 작용을 기초 분자 메커니즘 연구를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 설명 층 플로우 기반 분석 결과 사용 하 여 병렬 흐름 챔버는 거꾸로 단계 대조 현미경 카메라에 연결 된 백혈구 내 피 세포 및 혈소판, 시각 다음 기록 될 수 있는 상호 작용을 공부 하 오프 라인 분석. 내 피 세포, 혈소판, 또는 백혈구 억제제 또는이 프로세스 동안 특정 분자의 역할을 결정 하는 항 체와 pretreated 될 수 있습니다. 전단 조건, 즉 동맥 또는 정 맥 전단 응력, 점도 perfused 액체의 유량과 채널의 높이 의해 쉽게 적응 될 수 있다.

공부 하 고 내 피 백혈구 접착, 붙일 레이블된 THP-1 셀 했다 3 다 인/c m2에서 2 분에 대 한 TNFα 또는 비 자극 하는 내 피 단층 위에 끼얹는다. 부착 monocytic 세포의 총 수는 2-6 분 동안 6 독립 필드를 캡처하여 관류의 2 분 후 결정 되었다. 부착 세포 6 사진 거꾸로 위상 대비/형광 현미경 (예를 들어, EVOS FL)으로 캡처한 계량 했다 디지털 CCD 또는 CMOS 카메라에 연결 ?...

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Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K 조회수.  Maastricht University. 혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

연구

생체공학

Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone and inflamed tissues.  E-selectin expression is constitutive on dermal and bone microvessels and is inducible by pro-inflammatory cytokines, such as IL-1&#945;/  and TNF-&#945;, on microvessels in inflamed tissues.  This lectin receptor mediates weak binding interactions with carbohydrate counter-receptor ligands on circulating leukocytes, which results in a characteristic  rolling  behavior.  Because these interactions precede more stable adhesive events and diapedesis activity, characterization of leukocyte rolling activity and identification of leukocyte E-selectin ligands have been major goals in studies of leukocyte trafficking and inflammation and in the development of anti-inflammatory therapeutics (1-5).  The intent of this report is to provide a visual, comprehensive description of the most widely-used technology for studying E-selectin   E-selectin ligand interactions under physiologic blood flow conditions.  Our laboratory in conjunction with the Harvard Skin Disease Research Center uses a state-of-the-art parallel-plate flow chamber apparatus accompanied by digital visualization and new recording software, NIS-Elements.  This technology allows us to analyze adhesion events in real time for onscreen visualization as well as record rolling activity in a video format.  Cell adhesion parameters, such as rolling frequency, shear resistance and binding/tethering efficiency, are calculated with NIS-Elements software, exported to an Excel spreadsheet and subjected to statistical analysis.  In the demonstration presented here, we employed the parallel-plate flow chamber to investigate E-selectin-dependent leukocyte rolling activity on live human bone marrow endothelial cells (hBMEC).  Human hematopoietic progenitor KG1a cells, which express a high level of E-selectin ligand, were used as our leukocyte model, while an immortalized hBMEC cell line, HBMEC-60 cells, was used as our endothelial cell model (6).  To induce and simulate native E-selectin expression in the flow chamber, HBMEC-60 cells were first activated with IL-1 .  Our video presentation showed that parallel-plate flow analysis is a suitable method for studying physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling activities and that functional characterization of leukocyte E-selectin ligand(s) in the flow chamber can be ascertained by implementing protease or glycosidase digestions.

This report provides a visual depiction of parallel-plate flow chamber analysis for studying leukocyte endothelial interactions under physiologic shear stress. This method is particularly useful for investigating the role of endothelial (E)-selectin and leukocyte E-selectin ligands that trigger leukocyte rolling on endothelial cell surfaces.

Microvascular 내피에 Physiologic E - Selectin - 중재 백혈구의 롤링 분석

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

생물학

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; Autoperfused 미세 흐름 (microflow) 상공 회의소의 분석

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

면역학 및 감염병학

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

미세 분석 결과 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내 피 세포 (hiPSC-ECs)에 백혈구 접착의 평가 대 한

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

발생학

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

흐름에서 백혈구의 모집에 기질 세포의 영향 분석

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

An In Vitro Flow Investigation of the Effect of Stromal Cells on Leukocyte Recruitment

Source: Munir, H. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52480">Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2015)
The video demonstrates a method for investigating the impact of stromal cells on leukocyte recruitment. In a parallel plate flow chamber model, pro-inflammatory cytokines induce the expression of adhesion receptors by endothelial cells, facilitating neutrophil recruitment and migration. The cross-talk between stromal cells and endothelial cells diminishes neutrophil recruitment to the endothelial cells.

백혈구 모집에 대한 기질 세포의 효과에 대한 체외 흐름 조사

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Isolation and Culture of Primary ...