건강 / 미 국립 암연 구소 (NCI) 그랜트 (찰스 J. Dimitroff에 RO1CA118124)의 국립 연구소,,이 프로젝트에 대해 자금은 미국 암 협회의 연구 학술 상, (찰스 J. Dimitroff에 06-024 - 01 - CSM)에 의해 제공되었으며 관절염과 Musculoskeletal 보건 / 국립 연구소 및 피부 질환 부여의 국립 연구소 (박사 토마스 S. Kupper에 P30 AR042689, 브리검 앤드 위민스 병원, 보스톤, MA).

1. 흐름 챔버에 대한 배양 접시에 hBMEC의 준비 (HBMEC - 60 세포) Monolayer <ol><li> 코트 35 37 4 박 20μg/ml의 fibronectin의 2ml (PBS)을 ° C로 3 시간 동안 X 10mm 조직 문화 요리 ° C. </li><li> 요리 fibronectin 솔루션을 기음과 1.5 X10 5 HBMEC - 60 세포를 추가 HEPES 및 글루타민과 함께 [매체 199 10% FBS 10 % 인간 세럼, 5 단위 / ML의 헤파린, 1ng/ml 재조합 인간 fibroblast의 성장 인자, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신] 요리와 그들이&gt; 90 % 합류로 성장할 수 있도록. (이 2 일이 소요) </li><li> 성장 미디어를 기음과, E - selectin 표현을 상향 조절, 4-6 시간에 대한 IL - 1β 50ng/mL 신선한 매체를 추가하십시오. 세포 monolayers 이제 분석을 압연에 대한 준비가되어 있습니다. 안티 - 인간의 E - selectin 모아브 (클론 BBIG - E4 (5D11)가) 37시 ~ 1 시간에 대한 20μg/ml에 추가할 수 있습니다 ° C.를 끄고, E - selectin 기능을 차단하려면 </li></ol> 2. 흐름 챔버에 대한 인간의 조혈 전구 KG1a 전지의 준비 <ol><li> 인간 조혈 전구 KG1a 세포는 글루타민과 함께 RPMI - 1640에 (1x10 6 셀 / ML) confluency로 성장와 10 % FBS / 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신과 흐름 챔버 분석에 사용하기 위해 술병에서 직접 pipetted입니다. </li><li> 휴대폰 번호는 hemacytometer 후 세포가 10mM HEPES (H / H 버퍼)와 2mM CaCl 2 HBSS 1 X 10 6 세포 / ML에서 다시 보류 아르를 사용하여 계산됩니다 </li><li> 세포 분석에 사용할 때까지 얼음에 저장됩니다. </li></ol> 3. 현미경, 병렬 플레이트 흐름 회의소와 주사기 펌프 (그림 1)의 준비 <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_7/1009_figure1.png" alt="그림 1" width="600" height="409" /> 그림 1. 병렬 플레이트 흐름 회의소 분석의 일러스트. 거꾸로 현미경, 하버드 주사기 펌프, 컴퓨터 / 카메라 및 병렬 플레이트 흐름 챔버는 효율적이고 재현성 세포 분석을위한 최적의 배열에 배치됩니다. <ol><li> 주사기 펌프로 거꾸로 현미경과 전원 전원 및 광원의 전원을 켜고 현미경에 10X 목표를 선택합니다. </li><li> 홀더에 50mL 원뿔 튜브를 삽입하고 H / H 및 2mM CaCl 2 입력합니다. </li><li> 50mL 원뿔 튜브 아래의 테스트 튜브 홀더에 넣어 5ml 플라스틱 테스트 튜브 </li><li> (주사기의 플런저과 몸 모두가 모두 확보되어 있는지 예정) 주사기 펌프에 60mL 주사기를 배치합니다. </li><li> 60mL 주사기 끝 3 방향 정류장 - 콕에 5mL 주사기를 연결 중지 - 수탉 3 방법을 첨부합니다. </li><li> 오른쪽에있는 입력 튜브, 뒤로 왼쪽과 진공관 출력 튜브와 함께 현미경 무대 플레이스 병렬 흐름 회의소 장치 (GlycoTech 주식 회사). </li><li> 병렬 플레이트 장치가 무대에 맞게 수 있도록 진공 야외 밸브에 진공 튜브를 연결합니다. (이 테스트 흐름 챔버에서 진공 스커트가 빵빵한 경우.) 공기 밸브를 끄십시오. </li><li> 출력 튜브 라인 (현미경의 가장 왼쪽에) 3 방향 중지 - 물건에 연결합니다. 장치는 현재 HBMEC - 60 monolayer 플레이트에 삽입하기위한 준비가되어 있습니다. </li><li> 현미경의 중심에 자리 HBMEC - 60 monolayer 판과 장소. </li><li> 진공 및 위치 monolayer 판은 중앙에있다 것과 같은 접시 위의 흐름 챔버 장치를 켭니다. </li><li> 부드럽게 HBMEC - 60 monolayer 판에 흐름 챔버 장치를 낮추고 흐름 챔버 장치가 다운 흡입 수 있습니다. (가 이스케이프 공기도 소리이어야하며이 시점에서 당신은 고무 가스켓을 압축 챔버에 압력을 적용해야 할 수도 있습니다.) </li><li> 일단 진공 곳에 입력 튜브 2mM CaCl 2와 H / H를 포함하는 50mL 원뿔 튜브로 (오른쪽)에 설립되었습니다. </li><li> 오픈 3 방향 정류장 - 콕에서 60mL 주사기와 장소 펌프로 흐름을 허용하는 &#39;펌프 모드. &quot; </li><li> 접시에있는 세포를 운반하지 않고 입력 / 출력 라인에서 공기를 제거하려면 액체가 장비에 도달 ML / 분 직전에 다음 신속하게 0.5으로 설정, 흡기 관을 채우기 위해 2mL/minute에서 설정 주사기 펌프를 사용합니다. 이 신중하게 설정하고 접시에서 monolayer 사하여 주실 공기 방울을 방지하기 위해 필수적인 주요 좋습니다. </li><li> 유체가 60ml 주사기, 흐름 챔버와 주사기 펌프로 이동을 볼되면 제일 먼저 처리 해달 흐름 챔버 사용할 준비가되었습니다. 이 설정은 최대 각 셀에 입력 실행 및 필요한 각 새 접시에 대해 반복됩니다. </li></ol> 4. NIS 요소를 사용하여 백혈구 롤링 이벤트 캡처 <ol><li> 바탕 화면에 열려 NIS 요소. </li><li> 보도 라이브 이미지에 대한 아이콘을 &quot;놀이&quot;. 자동 노출은 지금은 접시보다 쉽게​​ 볼 수 있도록하고 초점에 중요합니다. </li><li> 현미경은 세포 monolayer에 제대로 초점을 맞추고 있는지 확인합니다. </li><li> 현미경 1 프레임 / 초 및 조정 불빛에 일단 초점을 맞추고, 다시 설정 노출. 이미지가 컴퓨터에 표시하고 더 이상 낮은 조명 레벨로 인해 현미경 뷰파인더에서 확인할 수 없습니다. 라이트 히스토그램 그러면 광고 수배경 노출을 제거하거나 셀 선명도를 개선하기 justed. </li><li> 동영상 캡쳐에 이상적입니다 그림을 얻기 위해 2X2 빈 또는 라이브 빈 클릭하십시오 </li><li> 메뉴 표시줄에서 &quot;매크로&quot;을 클릭하고 &quot;포트에 쓰기&quot;를 선택, 선택 포트 &quot;com3,&quot;와 &quot;개방&quot;. (이것은 주사기 펌프와 협력하기 위해 포트를 엽니다. </li><li> 다음 피펫 입력 튜브 라인 근처 5ml 테스트 튜브에 KG1a의 세포 현탁액의 1mL 및 테스트 튜브의 맨 아래에 입력 튜브 라인을 넣으십시오. </li><li> 메뉴 표시줄로 이동은 &quot;캡처&quot;를 클릭, &quot;시간 저속 수집.&quot; </li><li> 새 메뉴가 나타납니다. 프로토콜 지속 2백10초을 선택하고,이 HBMEC - 60 세포 압연에 대한 프로그램의 길이입니다. (각 단계는 그림에게 펌프 프로토콜의 기간 동안 매초마다을하는 프로그램입니다. 또한 펌프를 시작합니다 com3 포트를 통해 명령을 보내도록 설정되어 있습니다.) 시간이 경과가 중단되면 펌프가 멈추지 않을거야 자체 및 재설정해야합니다. 이미지를 라이브로 돌아가려면 취소를 누릅니다. </li><li> 사용 설명서에 따라 &quot;프로그램 모드&quot;로 주사기 펌프를 설정합니다. (프로그램 모드가 특정 흐름 속도 (즉, 전단 응력 수준) 챔버 내에 이수하고 HBMEC - 60 세포 monolayer 이상 KG1a 세포 상호 작용을 지시하는 수동으로 프로그래밍 가능합니다.) hBMEC 세포에서 압연 KG1a 세포에 대한 설정했던 것은 같은 4.2 다인즈을 따릅니다 / 45 S에 대한 cm 2, 0.3 다인즈 / 60 s에 대한 cm 2, stepwise 증가 매 15의 4.2 다인즈 / cm 2 최대 </li><li> 챔버 벽의 전단 응력 (W 일)은 다음 등식에 따라 계산 : W ST / ML의 체적 유량입니다 Q μ는 매체의 예상 점도 (0.0076 P)입니다 = 6μQ / 2 B, S는이 cm에서 채널 높이 (가스켓 두께) (0.03 ㎝)이고, B는 cm (0.5 cm)의 채널 폭입니다. 유량은 주사기 펌프의 프로그램 모드를 사용하여 규제되었습니다. </li><li> 현미경과 컴퓨터는 이제 시간 저속도 촬영을 캡처하는 준비가되어 있습니다. 보도 자료를 획득 시작 컴퓨터에서 &quot;실행 시작&quot;. 프로그램을 실행하는 동안 (기포가가 없는지 확인) 매체의 입 / 출력 튜브가 가득 유지하기 위해 KG1a 세포가 들어있는 시험관에 미디어를 추가하십시오. </li></ol> 5. 터미널 Sialylation 및 E - selectin - 중재 KG1a 전지 5 표면 당단백질의 의존성. (; 5.1-5.5의 비디오 클립 그림 2) 롤링 <ol><li> 에 압연 KG1a 세포의 시금 비 자극 HBMEC - 60 세포. (대조군) KG1a 세포가 준비 이상 흐름 챔버에 주입되었다 라이브가 아닌 IL - 1β 자극 HBMEC - 60 위에서 설명한. </li><li> HBMEC - 60 세포를 IL - 1β와 사전 처리의 롤링 KG1a 세포의 시금. (E - selectin - 의존도 제어) KG1a 세포가 이상 흐름 챔버로 준비하고 주입되었다 라이브 IL - 1β 자극 위에서 설명한 HBMEC - 60. </li><li> IL - 1β 그리고 중화 방지 인간 E - selectin 모압. (E - selectin - 의존도 제어) KG1a 세포가 라이브를 통해 흐름 챔버로 준비하고 주입되었다 IL - 사전 처리 HBMEC - 60 세포에서 압연 KG1a 세포의 시금 위에서 설명한 안티 - 인간의 E - selectin 모압을 무효화와 1β 자극 HBMEC - 60 pretreated. </li><li> IL - 1β 자극 HBMEC - 60의 롤링 sialidase - 소화 KG1a 세포의 시금. 37 1 시간에 대한 neuraminidase 0.1U/ml 장염 Cholerae ° C와 pretreated KG1a 세포가 이상 흐름 챔버로 준비하고 주입했다 IL - 1β 라이브 자극 위에서 설명한 HBMEC - 60. </li><li> IL - 1β 자극 HBMEC - 60의 롤링 프로 테아제 - 소화 KG1a 세포의 시금. 단백 분해 효소와 pretreated KG1a 세포는, 37에서 1 시간에 대한 0.2U/ml의 브로 멜 라인 ° C가 넘는 흐름 챔버로 준비하고 주입했다 IL - 1β 라이브 자극 위에서 설명한 HBMEC - 60. </li></ol> 6. NIS - 요소 - 캡처된 KG1a 세포의 KG1a 셀 및 그래프 롤링 데이터의 분석 <ol><li> 시간 순서가 취득 후 데이터를 저장합니다. </li><li> 메뉴 표시줄에서 &quot;측정&quot;탭으로 이동을 선택하십시오 &quot;임계값을 정의합니다.&quot; 원하는 세포가 붉은 색 있도록 막대를 이동합니다. &quot;모든 이미지&quot;다음 &quot;자&quot;를 선택하십시오. 전체 시간 경과 순서는 현재 보이는 붉은 구름 전지 수정해야합니다. </li><li> &quot;측정&quot;을 선택 이동 &quot;제한.&quot; (제한 사항은 사용자가 압연 세포를 대변하지 않습니다 thresholded 개체를 제외하실 수 있습니다. 이것은 주로 HBMEC - 60 monolayer 만든 배경입니다.) &quot;지역&quot;과 압연 세포에 대한 지역에 대한 입력 분 및 최대 값을 선택합니다. &quot;신장&quot;과이 단계를 반복합니다 &quot;순환성합니다.&quot; </li><li> &quot;측정&quot;을 선택하고 &quot;제한을 사용하여 바이너리를 생성&quot;을 선택하고, HBMEC - 60 세포 monolayer에 압연 세포의 NIS - 요소 소프트웨어 인식을 최적화하기 위해 제한 값을 설정합니다. </li><li> &quot;측정&quot;, &quot;필드 데이터&quot;를 선택한 다음 &quot;초기화 데이터&quot;를 선택으로 돌아갑니다. 이 메뉴를 닫습니다. </li><li> &quot;측정&quot;과 SE (으)로 돌아가기&quot;스캔 필드를&quot;lect. </li><li> 열기 &quot;법안&quot;은, &quot;필드 데이터&quot;, &quot;숫자 또는 개체&quot;를 선택하고 &quot;모든 필드&quot;를 선택하고 Microsoft Excel로 데이터를 내보낼 수 있습니다. </li><li> 다음 데이터 수집을위한 NIS - 요소 세포 인수를 준비하는 &quot;명확한 데이터&quot;를 선택하십시오. </li></ol> 결과 : <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_8/1009_figure3.png" alt="그림 3" width="600" height="382" /> 그림 3. KG1a 셀에서 E - selectin 바인딩 활동 병렬 플레이트 흐름 회의소 분석. sialidase이나 단백 분해 효소로 처리 KG1a 세포는 HBMEC - 60 세포를 IL - 1β와 사전 처리의 monolayers에 대한 효율성을 압연에 대해 분석했다. 실험 롤링 대조군도 아닌 IL - 1β 자극 HBMEC -60 세포 또는 압연 KG1a 세포 분석을 실시했다 IL - 1β 자극 반 인간 E - selectin 모아브 (5D11)을 중화 취급 HBMEC - 60 세포. 세포 회전 주파수는 세중의에서 수행하고 NIS - 요소 소프트웨어로 분석했다. (* 통계 의미, P는 &lt;0.001) physiologic 전단 응력 조건 하에서 내피 세포의 상호 작용 -이 비디오 기반의 보고서에서, 우리는 백혈구를 분석하는 방법에 대한 시각적 묘사를 제공했습니다. 백혈구 tethering을 중재하고, 같은 integrins 및 hyaluronan 수용체와 같은 수용체를 통해 중등 더 안정적인 구속력이 활동의​​ 노력에 필요한 접착제 행동을 압연에서 E - selectin 리간드 - 특히, 우리는 E - selectin의 역할을 분석. 거꾸로 현미경, 하버드 주사기 펌프, 비디오 카메라와 컴퓨터 / 셀 수집 하드웨어와 함께 사용하기위한 적응 병렬 플레이트 흐름 챔버를 사용하여, 우리는 실험 E - selectin 리간드 궁극적으로 실시 + KG1a 세포는 우리의 백혈구 모델과 hBMEC 세포로 사용되었다 (HBMEC - 프로 염증성 시토킨, IL - 1β로 자극 60), 우리 E - selectin + 인간 내피 세포 모델 (1-6)로 사용되었습니다. 이전에보고, 우리는에서 압연 강력한 KG1a 세포를 관찰 IL - 1β 자극 HBMEC - 60 E - selectin에 의존 방식으로 (그림 3) (KG1a 세포가 압연에 비해 통계적으로 중요한 차이 전단 응력 수준의 범위에서 셀 비 IL - 1β 자극 HBMEC - 60 세포). 비 IL - 1β 자극 HBMEC - 60 세포에서 또는 압연 KG1a 세포로 구성되어 부정적인 컨트롤, IL - 1β 자극 반 인간 E - selectin mAb와 HBEMC - 60 세포 pretreated, 의존을 설명하기 위해 병렬로 진행되었다 롤링 활동 시토킨 자극과 E - selectin 표현 (그림 3). 비브리오 cholerae와 pretreated KG1a 세포뿐만 아니라, 압연 분석 neuraminidase (sialidase) 또는 브로 멜 라인, 표면 E - selectin 당단백질의 리간드를 소화 알려져 아닌 특정 프로 테아제와가 E - selectin 리간드에 대한 터미널 sialic 산성 잔류물 및 표면 당단백질의 중요성을 강조 활동 (2,3).

<ol>
	<li>Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukocytic+migration+to+inflamed+skin+with+a+novel+fluorosugar+modifier+of+cutaneous+lymphocyte-associated+antigen.">Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen.</a> J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 .</li><li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin.">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li><li>Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leukocyte+E-selectin+ligands,+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+and+E-selectin+ligand-1,+on+human+metastatic+prostate+tumor+cells.">Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells.</a> Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).</li><li>Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ameliorating+Skin-Homing+Receptors+on+Malignant+T+cells+with+a+Fluorosugar+Analog+of+N-acetylglucosamine:+P-selectin+Ligand+is+a+More+Sensitive+Target+than+E-selectin+Ligand.">Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand.</a> J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).</li><li>Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-homing+receptors+on+effector+leukocytes+are+differentially+sensitive+to+glyco-metabolic+antagonism+in+allergic+contact+dermatitis.">Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis.</a> J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).</li><li>Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+human+bone+marrow+endothelial+cells:+characterisation+of+new+cell+lines.">Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines.</a> Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).</li></ol>

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병렬 플레이트 흐름 챔버 분석 백혈구를 공부에 사용되는 시험 관내 분석 시스템의 전문입니다 - 유사한 전단 응력 조건 하에서 내피 접착 상호 작용 후 모세관 venule의 표면에 이수 사람. 백혈구 tethering을 중재하고 활성화 microvascular의 내피의 표면에 압연에서 E - selectin 리간드 - 여기로 우리의 시각적인 표현에 묘사된, 우리는 E - selectin의 역할을 조사하는이 시스템의 가치를 보여줍니다. 우리는 또한 프로 테아제, glycosidase이 시스템에서 E - selectin과 리간드의 역할을 elucidating에 대한 차단 항체 치료의 응용 프로그램을 공개. 이러한 분석은 매우 재현성 있으며, E - selectin 연구를위한 실험적인 근거 형태 도움말 - 생체내에서 E - selectin 리간드 기능을. 시토킨 - 활성 microvascular 내피 세포 (hBMEC 또는 인간 제대 정맥이나 피부 microvascular 내피 세포)의 monolayers와 세포 부착을 공부 이외에 assays은 기판으로 재조합 E - selectin 인간 또는 E - selectin - IG 키메라 분자를 정화 사용하여 수행할 수 세포 접착하십시오. 기타 접착제 상호 작용은 백혈구 (P) (L -) - selectin 및 혈소판 - selectin은 또한 병렬 플레이트 흐름 챔버 기술을 사용하여 assayed 수 있습니다 통해 중재. 세포 monolayer / 단백질 기판의 종류를 변화하거나 입력 백혈구 / selectin - transfectant 세포 모델의 조사는 physiologic 전단 응력 조건 하에서 이러한 상호 작용의 역할을 공부할 수 있습니다.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F6178-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5 M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15575-038</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parallel-Plate Flow Chamber Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GlycoTech</td>
<td>31-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PHD2000 Programmable Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PHD 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35x10mm Tissue Culture Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD FALCON</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fibronectin , from human plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>86088-83-7 F2006-2MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Interleukin-1_, Human; Recombinant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>I9401-5UG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS (Hank s Buffered Saline Solution)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Medium 199 w/ HEPES & Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12320-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Innovative Research, Inc.</td>
<td>IPLA-SER1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abraxis Pharmaceutical Products</td>
<td>504011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant human fibroblast growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&D Systems</td>
<td>233-FB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic Test tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>352008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&D Systems	</td>
<td>BBA16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromelain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>B-4882</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
				 	
	

		</div>

analysis of physiologic e-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium

E - selectin은 피부, 뼈 및 염증 조직에 leukocytes 순환 모집을 시작하는 데 도움이 microvascular 내피 세포에 종류 - 1 막 단백질이다. E - selectin의 표현이 피부와 뼈가 microvessels에 제정되고 같은 염증 조직에서 IL - 1α 및 / TNF - α, microvessels 등 프로 염증 크린 시토킨에 의해 inducible 있습니다. 이 렉틴과 수용체는 mediates 특성 회전 동작의 결과를 순환 leukocytes에 탄수화물 카운터 - 수용체의 리간드와 상호 작용을 약한 구속력. 이러한 상호 작용은보다 안정 접착제 이벤트 및 diapedesis 활동, 백혈구 압연 활동의 특성화 및 백혈구 E - selectin의 리간드의 신분을 앞에 있기 때문에 백혈구 인신 매매 및 염증의 연구 및 안티 - 염증성 치료제의 개발 (1-5)의 주요 목표를했습니다 . 이 보고서의 목적은 physiologic 혈액 흐름 조건 E - selectin E - selectin의 리간드 상호 작용을 연구에 가장 널리 사용되는 기술의 시각, 포괄적인 설명을 제공하는 것입니다. 하버드 피부 질환 연구 센터와 함께 우리 연구실은 디지털 시각화하고 새 레코딩 소프트웨어, NIS - 요소와 함께 최첨단가 병렬 플레이트 흐름 챔버 장치를 사용합니다. 이 기술은 우리가 화면의 시각화뿐만 아니라 비디오 형식으로 기록 롤링 활동을 실시간으로 접착 이벤트를 분석할 수 있습니다. 같은 주파수, 전단 저항을 압연 및 바인딩 / 효율성을 tethering 같은 세포 접착 매개 변수, Excel 스프레드 시트에 수출 및 통계 분석의 대상, NIS - 요소 소프트웨어로 계산됩니다. 데모 여기에 제시, 우리는 살고 인간 골수 내피 세포 (hBMEC)에서 E - selectin에 의존 백혈구 압연 활동을 조사하기 위해 병렬 플레이트 흐름 챔버를 채용. 불후의 hBMEC 세포 라인, HBMEC - 60 세포, 우리의 내피 세포 모델 (6)로 사용하는 동안 E - selectin 리간드의 높은 수준을 표현하는 인간의 조혈 전구 KG1a 세포는, 우리 백혈구 모델로 사용되었습니다. 유도 및 시뮬레이션 네이티브 E - selectin 표현 흐름 챔버에서 HBMEC - 60 세포를 처음 IL - 1이 활성화되었습니다.하려면 우리의 비디오 프레 젠 테이션은 병렬 플레이트 흐름 분석 프로 테아제 또는 glycosidase을 구현하여 ascertained 수있는 흐름 챔버에 physiologic E - selectin - 중재 백혈구 압연 활동 및 백혈구 E - selectin 리간드 (S)의 기능 특성을 공부에 적합한 방법입니다했다 digestions.

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Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

이 보고서는 physiologic 전단 응력 하에서 백혈구 내피 상호 작용을 공부를위한 병렬 플레이트 흐름 챔버 분석의 시각적 묘사를 제공합니다. 이 방법은 트리거 백혈구가 내피 세포 표면에 롤링되는 내피 (E) - selectin과 E - selectin 백혈구 리간드의 역할을 조사에 특히 유용합니다.

Microvascular 내피에 Physiologic E - Selectin - 중재 백혈구의 롤링 분석

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.0K 조회수.  Brigham and Women's Hospital. 이 보고서는 physiologic 전단 응력 하에서 백혈구 내피 상호 작용을 공부를위한 병렬 플레이트 흐름 챔버 분석의 시각적 묘사를 제공합니다. 이 방법은 트리거 백혈구가 내피 세포 표면에 롤링되는 내피 (E) - selectin과 E - selectin 백혈구 리간드의 역할을 조사에 특히 유용합니다.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

연구

생물학

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

Immunodeficient 마우스의 생체 공학 인간 Microvascular 네트워크

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-seq의 트롬빈 - 처리의 Transcriptomes 분석 및 제어 인간 폐 Microvascular 내피 세포

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

마우스 저항 동맥의 미세 혈관 내피 튜브의 분리

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

세포 외 산 생산의 측정 및 분석은 당분 속도를 확인하는

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

사이트별 단백질 Lysine Acetylation 및 Succinylation 산출할 데이터 독립적인 수집 질량 분석을 사용 하 여 정량화

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

Murine 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포에 형광 성 융해 단백질의 표정

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.