The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, "Artificial immune reactions," "Camelid antibodies," and "Antibody technologies." We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.

포츠담 대학 (포츠담, 독일)에서 우리의 사육 식민지에서 BALB / C 또는 NMRI 마우스 (뮤스의 musculus)는 단일 클론 항체의 생산을 위해 사용되었다. 동물 연구는 관련 국가 및 국제 가이드 라인에 따라 실시 하였다. 이 연구는 환경, 보건 브란덴부르크 정부 및 소비자 보호 (참조 번호 V3-2347 - A16-4-2012)에 의해 승인되었다. 면역 접합체의 1. 준비 <ol><li> 담체에 항원을 결합하는, 아미노 통해 표준 커플 링 프로토콜을 사용하여 글루 타르 알데히드, N에 의해 같은 카복시 또는 설포 기, - (3- 디메틸 아미노 프로필) - N의 다이이 미드 (EDC) 또는 N - [Y 말레이 미도 ] 숙신이 미드 에스테르 (설포 GMBS). </li><li> : 1 비율 (글루 타르 알데하이드와 예) 커플 링 (13), 1에서 표적 단백질 또는 펩티드와 캐리어 (난 알부민, 소 혈청 알부민 또는 키홀 삿갓 조개 헤 모시)를 사용한다. 대상 홍보를 희석otein 또는 인산 완충 용액 (PBS), 50 mM의 NaHCO3을 버퍼 캐리어 단백질의 펩티드. 볼륨 및 예방 접종을 위해 필요한 양의 농도를 적응. <ol><li> 두 솔루션을 혼합하고 1.25 %의 글루 타르 알데히드를 추가합니다. 혼합하고 실온에서 4 시간 (RT) 동안 시료를 배양한다. 하이 브리 도마 세포를 선택하기 위해, 동일한 면역을하지만, 다른 담체와 순서 비특이적 담체 결합제의 선택을 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> (예를 들어, 세파 덱스 G25) 상업적 거친 수지 빠르고 투석을 행하여 커플 링 샘플을 투석. <ol><li> 중공 바늘 1.5 mL의 반응 바이알의 저부를 관통하고, 15 ㎖의 튜브에 배치. 밀봉 바닥에 유리 섬유를 넣고 (0.5 mL를 교정 마크) 조 수지의 300 밀리그램으로 커버. </li><li> 조심스럽게, 1.5 mL의 반응 관에 1 mL의 PBS의 적가를 넣고 유리 울 여전히 구멍을 밀봉되어 있는지 확인합니다. 거친 수지의하자잘 원심 분리기 2 분 500 XG에 열. 이러한 하나의 열은 커플 링 200 μL 샘플을 투석하기 위해 사용될 수있다. 높은 볼륨의 경우, 더 많은 열을 확인합니다. </li><li> 튜브를 변경하고 팽창 거친 수지 상에 커플 링 솔루션을 놓습니다. 원심 분리기 다시 2 분 동안 500 XG에. 튜브에서 전개 용매를 제거하고 예방 접종을 위해 사용합니다. </li></ol></li></ol> 동물의 2. 예방 접종 <ol><li> 예방 접종에 대한 두 개 또는 세 개의 6 ~ 12 주령의 Balb / c 마우스를 선택합니다. </li><li> PBS 200 μL의 면역 접합체의 200 μg의 완전한 Freund&#39;s 보조제의 100 μL (CFA)와 함께 혼합 - 한 동물의 경우, (150)을 준비합니다. 1 ML의 주사기에 솔루션을 짧고가는 바늘로 3 회 (0.6 mm 직경)를 섞는다. 마우스에 복강 내 용액을 주입한다. </li><li> 육주 후 면역 접합체의 같은 양의 부스터 주사를 부여하지만, CFA없이. 합니다 (안와 동 만점) 칠일 후에 혈액과 처리장을실온에서 4 시간 (RT) - (3)에 대해 혈액을 배양하여 혈청 재. <ol><li> 5 분 동안 3,000 XG에서 혼합물을 원심 분리기. 혈청 상층 액을 새로운 튜브로 전송할 수 있습니다. -20 ° C에서 보관합니다. 펠렛을 폐기하십시오. </li></ol></li><li> ELISA를 통해 혈청을 분석, 융합을 위해 3 단계에 설명 된대로, 가장 높은 혈청 역가와 마우스를 선택합니다. </li><li> 단지 4 일 융합 전에 보조없이 PBS 300 μL의 면역 접합체의 200 μg의 - 세포 융합에 대비하여, (150)와 마우스를 향상. </li></ol> 3. ELISA <ol><li> PBS에서 5 μg의 / ㎖ 농도의 항원 용액을 조제하고, 96 웰 플레이트의 각 웰에 50 μL ELISA 옮긴다. </li><li> 37 ° C 또는 밤새 습기 챔버 4 ° C에서 2 시간 동안 접시를 품어. </li><li> 수돗물로 플레이트를 3 회 반복한다. 습기 채널에 실온에서 1 시간 동안 잘 당 PBS / 5 % 신생아 혈청 80 μL (NCS)와 우물을 차단호박색. 1시 50분로 시작하는 5 시리즈 : 1의 혈청 희석을 준비합니다. 세포 배양 분석의 경우, 희석 배양 상등액을 사용한다. </li><li> 수돗물로 플레이트를 3 회 반복한다. 피펫 (50)도 당 샘플의 μL 및 습기 챔버에서 실온에서 1 시간 동안 배양. 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)에 접합 염소 항 - 마우스 IgG 항체의 5,000 희석 : 1의 이차 항체 솔루션을 준비합니다. </li><li> 수돗물로 판을 3 회 세척하고 잘 당 이차 항체 용액 50 μL를 추가합니다. 습기 챔버에서 실온에서 45 분 동안 품어. </li><li> 신선한 기질 용액을 준비합니다. 0.1 M의 NaH 2 PO 4, 0.1 % 과산화수소의 스톡 용액을 만든다. 5 중량 부에 NaH 2 PO 4, 4 부 과산화수소 및 신선한 기질 용액 1 부 테트라 메틸 벤지딘을 가지고. <ol><li> 수돗물로 판 10 회 반복한다. 피펫 (50) 우물에 신선한 기질 용액 μL 5 부화 - 10 분어두운. </li></ol></li><li> 50 μL 1 MH이 아니라 당 SO 4로 반응을 중지합니다. 플레이트 판독기를 사용하여 630 nm에서 기준 파장 450 nm에서의 광학 밀도를 측정한다. </li></ol> 골수종 세포 배양 4. 준비 <ol><li> 지금부터, 멸균 조건에서 모든 작업을 수행합니다. </li><li> 세포 배양을위한 새로운 배지를 준비합니다. 10 % 소 태아 혈청 (50 ㎖), 2 mM L- 글루타민 (5 ㎖) 및 50 μM의 메르 캅토 에탄올 (5 mL)로 RPMI1640 500㎖의 보조 식품. 매 7 일 글루타민을 대체합니다. </li><li> 따뜻한 물에 쥐 SP2 / 0 세포의 병을 해동. 200 x g에서 10 분 동안 신선한 배양액을 원심 분리로 10 mL의 세포 용액을 전송. 뜨는을 취소하고 신선한 배양액 1 mL에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 25 cm 2 플라스크에서 세포를 옮기고 항온 CO 2, 37 ° C에서 그들을 부화 5 %. 이 75 m에 세포를 확장 2 플라스크 BEF광석 융합. 단계 7에 기재된 바와 같이, 장기간의 저장을 위해 분취 량을 절약. </li></ol> 피더 세포의 5. 준비 <ol><li> (; 예를 들면, CO 2 흡입 국가 및 기관의 지침에 따라) 12 주령 NMRI 마우스를 희생. 모피를 제거하고 70 % 에탄올로 복부를 청소하십시오. </li><li> 복부에 얼음 차가운 RPMI 배지 5 mL를 주입 트위터와 복부를 마사지하고, 피더 세포 현탁액을 대기음. 빈 50 ML의 튜브에 세포를 놓습니다. 다시 한 번이 단계를 수행합니다. 피더 세포 현탁액의 7 ~ 10 mL를 검색 할 수 있습니다. </li><li> 전체 세포 배양 배지 90 ㎖ (RPMI 1640, 10 % 소 태아 혈청 및 2 mM 글루타민, 50 μM 머 캅토 에탄올)을 첨가하여 100 mL의 피더 세포 현탁액을 준비한다. 그것을 혼합하고 10 × 96 웰 세포 배양 플레이트에 웰 100 μL / 옮긴다. 하룻밤 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO 2의 접시를 품어. </li></ol> 6. 셀 퓨전<ol><li> 자궁 경부 전위 또는 CO 2 흡입하여 예방 접종을 마우스를 희생하고 비장 (14)를 절제. 엘리사의 양성 대조군으로, 단계 2.3에 설명 된대로, 마음에서 추가 혈액을 타고 혈청을 준비합니다. </li><li> 셀 스트레이너를 통해 비장을 눌러 비장 세포 현탁액을 제조. 전체 세포 배양 배지 20 ㎖까지 입력합니다. 원심 분리에 의해 50 ㎖의 튜브에 세포를 수확 (200 XG, 10 분, 4 ℃). 상층 액을 버린다. </li><li> 세포 배양 플라스크를 씻어 원심 분리하여 골수종 세포를 수확 (200 XG, 10 분, 4 ° C) 및 상층 액을 버린다. </li><li> 20 평형 염 완충액 ㎖ (BSS)에서 세포 펠렛을 재현 탁 (125 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을 4 mM의 CaCl2를 2.5 밀리미터의 MgCl 2, 5 mM 트리스 - 염산, pH를 7.4), 원심 분리를 다시. 세탁 세 번 단계를 반복합니다. </li><li> 비장 조정 : 골수종 세포 비, 눈에 의해 제 2 세정 단계 후에 세포를 카운트ST는 BSS 완충액 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 1:10 희석을 확인하고 셀 카운팅 챔버에 10 μL를 전송합니다. 세포를 세어 한 용액으로 세포 농도를 결정한다. </li><li> 1 ㎖의 최종 부피로 세 부품 비장 한 부분 골수종 세포에 BSS 버퍼 내의 세포 수를 조정한다. 세포 현탁액의 200 μL를 가지고 PEG8000 200 μL (BSS 버퍼의 4 ㎖의 1g)와 함께 섞는다. 2mm 직경의 전기 천공 큐벳에 400 μL 전송 펄스 세트 (600-650 V, 25 밀리 초). <ol><li> 펄스 후에 큐벳에서 3 분 동안 실온에서 세포를 배양한다. 세포를 제거하고이를 HAT 보통 100 ㎖ (RPMI 1640, 10 % FCS, 2 mM의 글루타민, 50 μM의 머 캅토 에탄올, 100 μM의 히 포크 산틴, 5.8 μM 아자 세린, 16 μM 티미 딘)와 함께 삼각 플라스크에 적가. </li><li> 1 mL의 배치가 소비 될 때까지 융합 4 번 반복합니다. 37 ° C, 5 % CO 2에서 3 시간 동안 삼각 플라스크를 인큐베이션인큐베이터한다. </li></ol></li><li> 피더 층 세포 도금 전에 하이포크 산틴, 아자 세린 및 티미 딘 다시 세포 현탁액을 보완. 피더 층 플레이트에 웰 당 세포 현탁액 100 μL를 추가하고 37 ° C, 5 % (인큐베이터)에서 CO 2의 접시를 품어. 잘 내에서 최종 농도는 100 μM의 하이포크 산틴, 5.8 μM 아자 세린, 16 μM의 티미 딘을해야합니다. </li><li> 우물은 모노 또는 폴리 클로 날 있는지 확인하기 위해 7 일 후 플레이트의 각 웰에 클론 성장 : 현미경 분석 (10X 대물 렌즈, 10 배 눈 조각 확대)을 수행합니다. 단일 클론 세포는 단일 세포에서 유래 한 세포의 클러스터이다. 폴리 클로 날 세포는 잘 하나의 셀의 다수의 클러스터이다. 7 일 후 전체 미디어를 변경하고 HAT 배지에서 7 일간 다시 품어. </li><li> 모자 매체를 변경하고 전체 세포 배양 배지에서 세포를 배양. 전자를 수행하는 상층 액을 사용하여단계에 기재된 리사 3. 양성 하이 브리 도마 세포는 특이 적 항체의 생산에 대한 시험에있어서, 24 웰 플레이트에서 팽창되어야한다. 세포 클론 인 경우 제한 희석 (단계 8에서 설명 됨)을 수행해야한다. </li></ol> 하이 브리 도마의 7 Cryoconservation <ol><li> 장기 보관 용 포지티브 및 모노 클론 된 하이 브리 도마를 Cryoconserve. 원심 분리에 의해&gt; 60 % 합류로 24- 웰 플레이트로부터의 세포를 수확 (200 XG, 10 분, 4 ℃). </li><li> 전체 세포 배양액 500 μL에 펠렛을 재현 탁하고 cryotube로 옮긴다. 동결 매체의 500 μL (RPMI 1640, 20 % FCS, 15 %의 디메틸 설폭 시드)를 추가로 혼합하고, 스티로폼 상자 또는 특수 냉동 상자에 넣어. 3 일간 -80 ° C에서 보관. 삼일 후 cryotube 장기 저장을 위해 액체 질소로 전송 될 수있다. </li></ol> 8. 폴리 클로 날 하이 브리 도마의 희석을 제한 <ol><li> 막개 세포층 문화, 단계 7.1에 설명 된 단계 5에 수확 긍정적 인 클론 세포를 설명한대로. 단계 6.5에 기재된 바와 같이 세포 수를 계산하고, 96 웰 플레이트 10 ㎖의 최종 부피로 10 세포 / ㎖로 세포 수를 조정한다. 100 μL / 웰 상에 공급 층을 추가합니다. </li><li> 37 ℃에서 7 일간 배양 및 현미경 (배율 : 10 배 대물 렌즈, 10 배 눈 조각) 클론 성장을 분석 할 수 있습니다. 단계 3에서 설명한 바와 같이, 배양 상청액의 ELISA를 확인하고, 대량 배양에 적합한 하이 브리 도마 클론을 확인한다. </li></ol> 9. 대중 문화와 단일 클론 항체의 정제 <ol><li> 이 25cm 또는 75cm이 플라스크에 적절한 ELISA 신호로 하이 브리 도마 클론을 전송하고, 배양 상청액 500 ㎖까지 모은다. 특정 항체의 생산을위한 배양 주간 테스트 3 절약 - 단계 7에 기재된 바와 같이, 장기간의 저장을 위해, 하이 브리 도마 당 5 분취한다. </li><li&gt; 원심 배양 상청액 4900 XG에서 15 분 동안 4 ℃ 및 0.45 μm의 필터를 통해 필터링. : 1 비율로 3 버퍼 (4 M NaCl을 2 M 글리신의 NaOH, pH를 8.9) 바인딩 뜨는을 섞는다. </li><li> (: DH 2 O 3 바인딩 버퍼 1 희석) 세척 완충액으로 세척하여 단백질을 열 준비. 칼럼을 통해 단계 9.2에서 뜨는을 전달하고 플로우를 통해 수집합니다. 0.1 M 시트 레이트, pH를 3.5으로 결합 된 항체를 용출 및 트리스 - 염산 500 μL, pH가 9.0 즉시 pH를 중화. </li><li> SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 및 ELISA에 의해 용출 된 항체의 특성, 최종 응용 프로그램을 확인합니다. <ol><li> 5 μL 배 SDS 샘플 로딩 버퍼 (8 % SDS, 20 % 2- 머 캅토 에탄올, 40 %의 글리세린, 0.015의 추가, 레인 (20 μL 샘플) 당 정제 된 항체 용액의 5 μg의 - SDS 페이지의 경우, 3을 % 브로 모 페놀, 감소)을 5 분 동안 95 ℃에서 프로브를 가열한다. 대조군으로, 정제 된과 동일한 샘플을 사용하여같은 이소하지만 관련이없는 특이성 ntibody. </li><li> , 12.5 % SDS 겔에 샘플을로드 추가 차선에서 흠없는 단백질 사다리의 5 μL를 배치하고, 전기 영동으로 구분합니다. 쿠마 브릴리언트 블루와 젤을 얼룩하고 그 결과를 문서화합니다. 기본 SDS 프로토콜은 1970 15 램 믈리에 의해 설립되었습니다. </li></ol></li></ol>

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The authors Pamela Holzl&#246;hner and Katja Hanack are the co-founders of new/era/mabs GmbH, a company that offers the customized generation of monoclonal antibodies.

하이 브리 도마 기술에 의해 모노클로 날 항체의 생성은 항체가 대상을 인식해야 할 때, 특히 최종 애플리케이션에 대하여, 강한 상세한 에피토프 분석을 요구한다. 이것은 종종 사용자가 과소 평가 약한 공연 항체에 이르게된다. 융합 프로세스는 특정 하이 브리 도마의 결과가이 시점에서 셀 비율과 활력에 크게 의존하는 것을 의미하는, 항상 랜덤이다. 제한 희석 한 후, 셀은 매우 불안정하며, ?...

이 프로토콜에 제시된 하이 브리 도마 기술은 처음 쾰러와 1975 년 밀스타인 (1)에 의해 설명하고, 몇 가지 기술적 인 개선을 제외하고 주요 절차는 지난 40 년 2 동안 크게 변경되지 않았습니다. 이 프로토콜의 목적은보다 적절한 면역화 전략, 모노클로 날 항체의 생성 표준 방법 및 검증 방법 (ELISA)에 대한 예를 설명한다. 항체는 놀라운 도구 질병 모니터링 및 처리 3에 대한 진단 및 치료 옵션뿐만 아니라 이러한 유세포 자기 세포 분류, 또는 면역 같은 기술적 접근법 광범위한 기여한다. 원하는 목표에 대한 단일 클론 항체의 상용화는 항체 또는 항체 관련 제품 (4)의 거의 셀 수없이 많은 수량 24 개 이상의 서로 다른 웹 데이터베이스의 존재에 의해 설명된다. 2015에서,ntibody 분자 인해 적절한 검증 및 상업적으로 이용 가능한 항체의 특성에 심각한 문제로 국제 논의 5-7의 일부. 표적 항원에 특이적인 항체를 찾기 어렵고 고가 일 수 있고, 종종, 이들은 친 화성 또는 특이성은 필요 없다. 항체를 생성하는 것은 아직 시간이 많이 걸리는이며, 수도 더 나은 하나를 구입하는 것보다 개별적으로 항체를 생산, 개발 및 항체를 확인하는 숙련 된 인력이 필요하지만. 인해 항체 생산은 시간 소모적이며, 경험을 필요로한다는 사실에 결합 분자의 제조를위한 다른 방법은 이러한 문제를 극복하기 위해 개발되었다. 가장 일반적으로 사용되는 다른 방법은 파지 디스플레이를 통해 단일 쇄 항체의 재조합 생성한다. 가변 결합 영역의 유전자는 세포로부터 추출하고, 파지의 코트 단백질과 결합된다. 의 S화롯불 체인은 박테리오파지의 표면에 발현 여러 패닝 단계 8에서 상영된다. 단일 사슬 항체의 생산은 다소 빠르지 만 또한 숙련 된 실험자를 필요로한다. 일부 재조합 단일 사슬 항체의 단점은 가난한 안정성 및 체외 진단을위한 적합성의 부족이다. 대부분의 진단 시험에서 검출을위한 된 Fc 수용체 나중에 재조합 단일 쇄 항체에 추가 될 필요가있는 것이 필요하다. 또한, 이것은 시간을 소모하고, 하이 브리 도마 기술보다 훨씬 더 복잡하다. 체외 진단에서 전체 길이 단일 클론 마우스와 토끼 항체는 최선의 선택이 될 입증되었습니다. 면역 접합체의 설계 : 실험실 작업을 시작하기 전에 단일 클론 항체를 생성하는 주요 단계 중 하나는 수행되어야한다. 해결해야 할 질문은 다음과 같습니다 최종 응용 제품에서 대상의 물리적 조성은 무엇입니까이온 및 존재하는 행렬? 대상은 응용 프로그램에서 어떤 농도가 있습니까? 최종 응용 프로그램은 무엇이며, 항체가 충족해야하는 요구 사항은 무엇입니까? 항상 선형 펩티드 단편을 사용하는 경우, 또한 원하는 대상의 최종 선형 에피토프되어야한다는 고려; 그렇지 않은 경우, 항체에 결합하지 않을 것이다. 물론, 스크리닝 방법과 무관하게 항체는 서로 다른 애플리케이션의 서로 다른 형식의 항원을 인식하도록 선택 될 수 있지만, 이것은 매우 정밀하게 검증되어야한다. 이러한 항체 개발 및 유효성 검사는 야심 찬 프로세스입니다 이유입니다. 면역 항원에 대한 포맷의 선택은 항체 개발을위한 기본이며,이 방법의 성공 또는 실패를 결정한다. 생쥐가 중요한 항체를 발현하면, 비장 세포를 분리하여 골수종 세포와 융합된다. 가장 일반적인 골수종 세포주쥐의 모노클로 날 항체 개발은 X63-의 Ag 8.653 (9) 및을 Balb / C 마우스 변형에서 Sp2을 / 0의 Ag (14) (10)이다. 세포는 악성 B 세포 림프종의 자손 그들 자신의 중량 또는 경쇄 중 어느 분비하지 않기 때문에 선택되었다. 1 (골수종 세포 대 비장) 세포를 1:10 내지 10의 비율로 구성 될 수있다. Stoicheva 및 귀 (11)에있어서, (1) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 전기 융합하여 융합이 프로토콜에서, 세포는 3의 비율로 적응시켰다. B 세포와 골수종 세포의 융합은 임의의 공정이다. 따라서, 두 개의 B 림프구 또는 골수종 세포의 하이브리드를 생성 할 수 있지만, 이러한 하이브리드 배양 장기간 생존 할 수 없다. 세포는 하이 브리 도마 세포 융합 의한 피리 미딘 합성 새로이 경로를 사용할 수있는 가능성에 견딜 수있는하여 하이포크 산틴, 아미 노프 테린 및 티미 딘 (HAT)을 둘러 거칠. 월의 생성oclonal 항체, 한 머더 세포 유래 세포주를 얻기 위해 필요하다. monoclonality는 희석 기술 및 세포 증식의 현미경 분석을 제한함으로써 보장된다. 하이 브리 도마 배양 상청액은 ELISA에 의해 주로, 특이 적 항체 생산에 대해 스크리닝 또는 유동 세포 계측법 및 가장 바인더가 선택된다. 대량 배양 및 정제 한 후, 항체 분자는 마침내 특성화 될 수 있으며, 원하는 애플리케이션에 대한 검증.

<table><tbody><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(3-dimethylaminopropyl)-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-ethylcarbodiimide (EDC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-GMBS</td><td>Perbio Science Germany</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>ovalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>keyhole limpet hemocyanin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8283</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91015</td><td></td></tr><tr><td>reaction vials, 1.5 mL</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>CNT2.1</td><td></td></tr><tr><td>hollow needle</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>glass wool</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>6574.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 coarse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GE-17-0034-02</td><td></td></tr><tr><td>Freund&amp;acute;s adjuvant, complete</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F5881-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ELISA plates, 96 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>neonatal calf serum</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S1025</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Tips 1,000 &amp;micro;L</td><td>Starlab</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips 200 &amp;micro;L</td><td>Greiner bio-one</td><td>739291</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td><td>Dianova</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>tetramethylbenzidine</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>6350.2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>peroxide/urea</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sulphuric acid</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>4623.3</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies GmbH</td><td>31870074</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>HN08.2</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>TC-flask 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V025</td><td></td></tr><tr><td>TC-flask 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V075</td><td></td></tr><tr><td>ethanol, 96%</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>P075.1</td><td></td></tr><tr><td>cell strainer</td><td>VWR international</td><td>734-0002</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 50 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91050</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>electroporation cuvette, 2 mm</td><td>Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K.</td><td>EKL2,25</td><td></td></tr><tr><td>hypoxanthine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9636-25G</td><td></td></tr><tr><td>azaserine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4142</td><td></td></tr><tr><td>thymidine</td><td>USB Europa GmbH</td><td>22305 1 GM</td><td></td></tr><tr><td>TC-plates 96 well</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92696</td><td></td></tr><tr><td>TC-plates 24 well</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92424</td><td></td></tr><tr><td>cryotubes, 1 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V7384-1CS</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>protein A sepharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3391-1G</td><td></td></tr><tr><td>SDS sample loading buffer, Roti-Load 1</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>unstained protein ladder</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0363</td><td></td></tr><tr><td>comassie brilliant blue R-250</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0406</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of murine monoclonal antibodies by hybridoma technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

도 1은 실험실에서 수행 한 면역 용 항원 특이 혈청 역가의 예를 도시한다. 순진한 마우스의 혈청과 비교 5,000,000이 도면에서, 면역 혈청 A 및 B 1:50 내지 1에서 적정 하였다. 항원은 고체 상에 도포하고, 특정의 항체는 POD - 공액 된 염소 항 - 마우스 IG 항체로 검출 하였다. 면역화 된 마우스의 혈청 모두는 나이브 마우스에 비해 상당히 높은 항원 특이 역가를 나?...

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Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

하이 브리 도마 기술에 의해 쥐 단일 클론 항체의 생성

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

41.6K 조회수.  University of Potsdam. An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening. 

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Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating histoplasmosis caused by the fungus Histoplasma capsulatum and 2) to examine the role of virulence factors as target for therapy. To generate mAbs, mice are immunized, the immune responses are assessed using a solid phase ELISA system developed in our laboratory, and the best responder mice are selected for isolation of splenocytes for fusion with hybridoma cells. C57BL/6 mice have been extensively used to study H. capsulatum pathogenesis and provide the best model for obtaining the data required. In order to assess the role of the mAbs in infection, mice are intraperitoneally administered with either mAb to H. capsulatum or isotype matched control mAb and then infected by either intravenous (i.v.), intraperitoneal (i.p.), or intranasal (i.n.) routes. In the scientific literature, efficacy of mAbs for fungal infections in mice relies on mortality as an end point, in conjunction with colony formin units (CFU) assessments at earlier time points. Survival (time to death) studies are necessary as they best represent human disease. Thus, efficacy of our intervention would not adequately be established without survival curves. This is also true for establishing efficacy of vaccine or testing of mutants for virulence. With histoplasmosis, the mice often go from being energetic to dead over several hours. The capacity of an intervention such as the administration of a mAb may initially protect an animal from disease, but the disease can relapse which would not be realized in short CFU experiments. In addition to survival and fungal burden assays, we examine the inflammatory responses to infection (histology, cellular recruitment, cytokine responses). For survival/time to death experiments, the mice are infected and monitored at least twice daily for signs of morbidity. To assess fungal burden, histopathology, and cytokine responses, the mice are euthanized at various times after infection. Animal experiments are performed according to the guidelines of the Institute for Animal Studies of the Albert Einstein College of Medicine.

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

C57BL/6 mice have been used to study Hc pathogenesis and provide the best model. We are exploring the potential benefits of humoral immunity against this fungus and generated several mAbs [to histone H2B and a heat shock protein 60kDa] that we tested for their protective efficacy after intraperitoneal administration.

반대 단클론 항체의 수동적 관리 H. capsulatum 및 기타 곰팡이 병원균을

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

연구

면역학 및 감염병학

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response without any interference such as low protein expression, enzyme inactivity, or structural changes. This makes APN an attractive candidate in the development of vaccines that selectively target the mucosal epithelium. Previous studies have shown that APN is a receptor protein for both enterotoxigenic Escherichia coli (E. coli) F4 and transmissible gastroenteritis virus. Thus, APN shows promise in the development of antibody-drug conjugates or novel vaccines based on APN-specific antibodies. In this study, we compared production of APN-specific monoclonal antibodies (mAbs) using traditional hybridoma technology and recombinant antibody expression method. We also established a stably transfected Chinese hamster ovary (CHO) cell line using pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN and an E. coli expression BL21(DE3) strain harboring the pET28a (+)-rAbs-APN vector. The results show that antibodies expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and mAbs produced using hybridomas could recognize and bind to the APN protein. This provides the basis for further elucidation of the APN receptor function for the development of therapeutics targeting different APN-specific epitopes.

The recombinant antibody protein expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and monoclonal antibodies produced using traditional hybridoma technology can recognize and bind to the porcine aminopeptidase N (APN) protein.

돼지 장 점막 상피에서 아미노펩티다아제 N을 표적으로 하는 단클론 항체 생산

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Polyclonal antibodies are defined as a collection of antibodies directed against different antigenic determinants of an antigen or several antigens (1). While polyclonal antibodies are powerful tools for identifying biological molecules, there is one important limitation - they are unable to distinguish between antigens that share antigenic determinants. For example, when bovine serum albumin is used to immunize an animal, B cells with different surface Ig will respond to different antigenic determinants on bovine serum albumin. The result is a mixture of antibodies in the antiserum. Because bovine serum albumin shares some epitopes with human serum albumin in evolutionarily conserved regions of the protein, this anti-bovine serum albumin antiserum will also react with human serum albumin. Therefore, this antiserum will not be useful for distinguishing between bovine and human serum albumins.
Several approaches have been taken to overcome the specificity issue of polyclonal antisera. One is by absorbing the unwanted antibodies by passing the antiserum through a chromatography column of immobilized antigens (2). This method is tedious and frequently unable to completely remove the unwanted antibodies. Another approach is to isolate individual antibody-producing B cells and expand them in culture. However, like most normal untransformed cells, B cells do not survive in long-term culture.
To overcome the inability of B cells to survive in culture, one approach is to prepare a myeloma-B cell hybridoma. In 1847, Henry Bence-Jones discovered that patients with multiple myeloma, a lymphoid tumor, produced a large quantity of antibodies (3). B cells in these patients have become malignant and grow uncontrollably. Since the malignant B cells are derived from a single clone, they are identical and produce only a single type of antibody (i.e., a monoclonal antibody, or mAb). However, most of these myeloma cells produce antibodies of unknown specificities. In 1975, by fusing a myeloma cell to a B cell, Cesar Milstein and Georges Kohler succeeded in producing a hybridoma that can be cultured indefinitely in vitro and produces an unlimited number of monoclonal antibodies of known antigenic specificity (4). The rationale behind their approach is to combine the immortal properties of the myeloma cell and the antibody producing properties of the B cell. Their technique revolutionized antibody production and provides a powerful means for identification and purification of biological molecules using monoclonal antibodies.
Generally, preparing a monoclonal antibody requires several months. The general procedure includes the following steps:
<ol>
	<li>Immunization and screening of antibody titer</li>
	<li>Fusion of antibody-producing B cells and myeloma cells</li>
	<li>Selective growth of the hybridoma</li>
	<li>Screening the hybridomas for producing the desired monoclonal antibody</li>
	<li>Cloning by limiting dilution - a process whereby cells are diluted to a concentration to statistically allow for less than 1 cell to be added to the wells of a 96-well plate. Some wells will end up with 0 cells and some will have 1 cell. The wells with seeded with 1 cell will eventually grow into a monoclonal population of cells.</li>
	<li>Growth of the hybridoma and preparation of monoclonal antibody</li>
</ol>
This protocol focuses on the last step - growth of the hybridoma and preparation of the monoclonal antibody. The antibody is purified from the culture supernatant by ammonium sulfate precipitation (often referred to as salting out) - a commonly used method of removing proteins from a solution. Proteins in solution form hydrogen bonds, along with other hydrophilic interactions, with water through their exposed polar and ionic groups. When concentrations of small, highly charged ions (such as ammonium or sulfate) are added, these groups compete with the proteins for binding to water. This removes the water molecules from the protein and decreases its solubility, resulting in precipitation of the protein.

Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

항체 생성: 융합 세포를 사용한 단일 클론 항체 생성

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

교육

JoVE Science Education

심화생물학

면역학

Generating Recombinant Monoclonal Antibodies From Mammalian Cell Cultures

Source: Nogales-Gadea, G. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52830">Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015)
This video demonstrates a method of antibody generation from mammalian cells by introducing plasmid vectors with heavy and light chain genes. These vectors interact with polyethylenimine and enter the cells by forming polyplexes; later, they are translated into individual proteins and assembled into complete antibodies, which are secreted into the extracellular medium.

포유류 세포 배양에서 재조합 단클론 항체 생성

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Isolation of Peripheral Blood ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Production and Purification

A Hybridoma Technology for Producing Monoclonal Antibodies against a Metallopeptidase

Source: Xia, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62437">Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an assay to produce monoclonal antibodies against porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase, using a traditional hybridoma technology. Upon immunizing a mouse with APN, the spleen cells are harvested and fused with immortal myeloma cells to produce hybridomas. The hybridomas are then selected and proliferated using the HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) medium to produce monoclonal antibodies specific to different APN epitopes.

메탈로펩티다아제에 대한 단클론 항체를 생산하기 위한 하이브리도마 기술

All animal model procedures have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Animal ...

A Technique to Generate Monoclonal Antibodies from Antigen-Specific B Cells

Source: Devilder, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56508">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.</a> J. Vis. Exp. (2018).
The video demonstrates a technique for generating monoclonal antibodies from antigen-specific B cells. Eukaryotic expression vectors encoding the heavy and light chains of antibodies, cloned from isolated antigen-specific B cells, are introduced into mammalian cells using polyplexes. Once inside the cells, these vectors undergo translation, and the resulting heavy and light chain peptides assemble into antibodies, which are subsequently secreted by the cells.

항원 특이적 B 세포에서 단클론 항체를 생성하는 기술

1. Production of mAbs

	The day before the transfection, seed 15,000 Human embryonic kidney 293A (HEK 293A) cells in 200 &#181;L of Dulbecco&#39;s ...

Hybridoma Technology

Hybridoma technology is used for the large-scale production of monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies bind to only a single antigenic determinant or epitope. Such antibodies are used in research, diagnostics, and disease therapy. The hybridoma technology established in 1975 by Georges K&#246;hler and Cesar Milstein was awarded the Nobel Prize in Medicine in 1984 for revolutionizing research and therapy.
Hybridoma Selection
Commonly used fusion techniques &#8212; electroporation, polyethylene glycol (PEG) mediated fusion, and the use of fusogenic viruses &#8212; generally produce hybridomas at a very low frequency. Fusion products thus have a high ratio of self-fused B-cells and myeloma cells, or unfused cells, with a low number of hybrid cells.
The hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium is used to select hybridomas by selectively allowing their growth. The aminopterin blocks the default nucleotide synthesis in cells. However, cells can utilize hypoxanthine and thymidine from the medium to synthesize nucleotides via the salvage pathway.
Myeloma cells deficient in the HGPRT enzyme cannot synthesize nucleotides via this pathway and thus, do not grow in HAT medium. Although B-cells produce functional HGPRT enzymes, they cannot divide indefinitely. Thus, only the hybrid cells with functional HGPT from the B-cells and immortality from the myeloma line can grow on the HAT selection medium. Such a culture of hybrid cells is called a hybridoma, which can be screened for monoclonal antibody production.
Hybridoma Screening
Hybridoma cultures from the HAT selection are plated onto a 96-well plate; each well containing only one cell. Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), each cell is screened for the production of antibodies specific to the epitope of interest. Cells that test positive are then selected and grown in a larger culture vessel to establish hybridoma cell lines. These cell lines are a permanent source of unlimited monoclonal antibodies. Thus hybridoma technology is a convenient and cost-effective method for mass production of monoclonal antibodies.

하이브리도마 기술

Hybridoma technology is used for the large-scale production of monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies bind to only a single antigenic determinant or ...