The authors have no acknowledgements.

1. 박테리아 서스펜션 준비 : <ol><li> 스트리킹 배양 플레이트로부터, 멸균 무균 접종 루프로서 적절한 성장 배지 (표 1) 100 ㎖을 함유하는 250 ㎖의 멸균 병에 단일 콜로니를 접종한다. </li><li> 정기적으로 성장에 대한 검사 1 ~ 2 일 동안 적절한 조건 (표 1)에서 궤도 진탕 배양기에 병을 놓습니다. 140 rpm으로 진탕 속도를 설정합니다. </li><li> 무균는 23 ℃에서 20 분 동안 3,000 XG에서 두 멸균 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기 튜브에 세균 현탁액을 전송합니다. </li><li> 뜨는을 기음과 멸균 펩톤 물 15 ㎖로 각 박테리아 펠렛을 재현 탁. 소용돌이 필요. 하나의 튜브 / 용기에 중단 박테리아 문화를 결합합니다. </li><li> 주식 문화의 역가를 결정하는 제 4 당 중으로 주식 문화를 역가. </li><li> 냉장 이주까지 4에 대한77; 2 ° C 필요할 때까지. 다시 역가 사용시에 배양 단계 4.8 참조. </li></ol> 2. 혈소판 제품 준비 : <ol><li> 공인 혈액 은행에서 표준 성분 채집 술 인간의 혈소판 제품을 수집합니다. 혈소판 제품은 다음 컬렉션 스펙을 충족해야 90에서 3백60까지 mL의 부피와 -3.8 0.8 × 106 혈소판 / μL 농도. <ol><li> 혈소판 제품이 병원균 감소를위한 사전 처리에 2 시간의 최소 휴식되었는지 확인합니다. 이 2 시간 동안 교반없이 혈소판 인큐베이터에서 22 ± 2 ℃에서 제품을 보관하십시오. 모 ✲가 2 시간 동안 지속 되 혈소판 제품 혈소판 인큐베이터에서 22 ± 2 ℃에서 교반되도록. 최대 22 시간 게시물 컬렉션 제품을 사용합니다. </li></ol></li><li> 3 ㎖ 주사기를 2 mL의 샘플을 사용하여 제거 혈소판 제품의 pH (22C)를 측정한다. 제품을 위해 혈액 가스 분석을 사용하여 pH가&gt; 6.6 갖는다. 혈액 분석기를 사용하여 제품의 혈소판 혈소판 농도를 측정하기 위해 동일한 샘플을 사용한다. 제품이 0.80-3.8 × 106 혈소판 / μL 수집 농도 요구 사항을 만족해야합니다. </li><li> 시각적으로 혈소판 제품의 소용돌이를 평가한다. 생성물이있는 경우 &quot;0&quot;제품이 폐기 될 것이다 소용돌이 친다. </li><li> 직접 백색 광원에서 혈소판 가방을 잡고 짧게 혈소판 가방을 짠다. 시각적 혈소판 샘플의 소용돌이 패턴을 관찰한다. 다음 스케일을 사용하여 제품의 점수. 참고 : 2 - 긍정적 소용돌이 : 강한 콘트라스트 전체 가방을 통해 볼 수 불균일성을 소용돌이. 1 - 중간 소용돌이 : 일부 불균일 볼 수 있지만, 몇 곳에서 가난한 대비. 0 - 음의 소용돌이 : 이전과 혈소판 가방을 압박하고 남은 혼탁 동질성 </li></ol> 3. 리보플라빈과 자외선 프로세스 : <ol><li> 트란멸균 튜브 도킹 장치를 사용 리보플라빈 및 UV 광 조사 및 저장 가방 혈소판 제품 sfer. 전송 후 튜브 실러를 사용하여 빈 혈소판 단위 컬렉션 가방을 제거하고 생물학적 폐기물로 빈 가방을 버리십시오. </li><li> 그 빛 보호 바깥 랩에서 원액을 리보플라빈 500 μM의 35 ml의 주머니를 제거합니다. 멸균 독 처리 및 저장 백의 입구 라인 상 리보플라빈 키트. 내용이 혈소판 단위로 배출 허용합니다. </li><li> 리보플라빈 주머니에서 설정 리보플라빈 파우치 / 처리 및 저장 가방을 끊고 부드럽게 처리 및 저장 가방에서와 리보플라빈의 가방에 잔류 공기를 표현한다. 혈소판 생성물 소량을 보장하는 것이 아니라 혈소판 제품에 잔류하는 린스 리보플라빈 리보플라빈 파우치로 표현된다. 리보플라빈 및 혈소판 용액 처리 및 저장 백에 다시 배출 허용하고 유입 라인 클램프. 빈 리보플라빈 가방 우리를 제거튜브 실러를 보내고 및 생물학적 위험 폐기물로 빈 가방을 버리십시오. </li><li> 무균 독 조명 및 스토리지 가방의 입구 라인 상에 여성 주사기 커넥터 6 &quot;튜브 라인. 여성 주사기 커넥터에 10 ML의 주사기 배럴 (플런저 제거)에 연결합니다. </li><li> 무균 피펫을 통해 주사기 배럴에 재고 박테리아의 5 mL를 추가 할 수 있습니다. 입구 라인에 클램프를 열고 세균이 혈소판 제품에 배출 할 수 있습니다. 일부 제품은 혈소판 10 ㎖ 주사기 배럴로 다시 흐르게하여 시린지 외통을 헹군다. 10 ML의 주사기 배럴을 제거합니다. </li><li> 이 무균 30 ㎖ 주사기를 부착 혈소판 제품 혼입 스톡 박테리아 있도록 유입구 두 번 최소 플러쉬. 제품이 잘 혼합 한 후, 깨끗한 50-10 mL의 주사기를 사용하여 2 ml의 전처리 샘플을 제거한다. 접종 단계에서 도입 된 모든 공기를 보장 새 주사기를 사용하거나 단계를 샘플링이 제거된다. <ol><li> 제 4 항에 따라 전처리 샘플 역가. </li></ol></li><li> 처리 및 보관 가방에서 입구 라인을 제거하고 제품의 무게. </li><li> 조명에 제품을 놓고 표준 혈소판 치료를 시작 화면의 명령을 따르십시오. <ol><li> 운영자 ID를 입력합니다. </li><li> 안전하고 조명기의 플래 튼에 가방을 탑재합니다. </li><li> 바코드 리더 또는 수동 입력 키패드를 사용하여 조명기로 샘플 ID를 입력합니다. </li><li> 스캔 제품 유형. </li><li> 석영 클램프를 닫습니다. </li><li> 조명 장치가 자동으로 에너지의 6.24 J / ㎖를 제공합니다. 일반적인 처리 시간은 5 ~ 10 분 소요됩니다. </li></ol></li><li> 치료 및 스토리지 가방의 샘플 전구 라인 상에 여성 주사기 커넥터 6 &quot;튜브 라인 처리 멸균 독에 따라. 제품이 잘 혼합 확인 후 5 ML의 주사기를 연결하고 2 ㎖의 후 처리 샘플을 제거합니다. <ol><li> 후 처리 샘 역가제 4 당 PLE. </li></ol></li></ol> 4. 세균 역가 <ol><li> 전처리 및 후 처리 샘플의 역가를 추정하고, 각 샘플의 종점 일련의 희석을 수행하는 데 필요한 5 mL로 희석 튜브의 적절한 수를 준비한다. 무균 펩톤 물 1.8 ml의 필요한 튜브를 입력합니다. </li><li> 역가가 10 배 일련 희석 방식을 사용하여 각 샘플. 무균는 제 희석 관 (10-1)에 희석 시료 0.2 mL를 옮긴다. 이 희석 와류 튜브 및 전송 다음 희석 튜브에 0.2 ml의. 희석의 필요한 수를 통해 일련의 희석을 계속합니다. <ol><li> 무균 전송 각 희석액 100 ㎕은 적절한 한천 판 (표 1)에 도금 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 멸균 셀 스프레더를 사용하여 균등하게 각 한천 플레이트에 샘플을 배포 할 수 있습니다. </li><li> (반전과 적절한 조건에서 판을 품어 <stroNG&gt; 주기적으로 성장 검사 1-2일 표 1). </li><li> 30-300 식민지로 번호판을 계산합니다. 보다 큰 300 식민지를 포함하는 플레이트는 (TNTC)을 계산하는 너무 많은 간주됩니다. 30 개 미만의 식민지가 포함 된 플레이트는 정량 한계 (LOQ) 이하로 간주됩니다. </li><li> 각 시료의 역가를 계산 CFU / ㎖로 결과를 기록한다. <ol><li> CFU / ㎖를 계산하기 위해 다음 식을 사용하여 <img alt="식 (1)" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" /></li><li> 최저 희석 플레이트에는 콜로니가없는 경우, 검출 (LOD)의 한계를 계산하기 위해 다음 식을 사용 <img alt="식 (2)" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" /> 과 <img alt="식 (3)" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" /> 장소 : N은 P 입자 (CFU)의 낮은 수를 =자신감을 검출 할 수는 roduct. 미생물이 발견되지 않은 것이라고 P는 = 확률; 미생물을 검출하는 95 % 신뢰 위해, P는 = .05. 용액에 V = 전체 제품의 부피 판의 V = 부피 도금 (ML) × 희석 수준 </li></ol></li><li> 음성 대조군을 위해, 두 개의 한천 플레이트 각각에 계열 희석에 사용 펩톤 물 0.5 mL로 접시. 샘플을 테스트 할 같은 플레이트 유형을 사용합니다. 반전 1-2 일 정기적으로 성장을 확인하기위한 적절한 조건에서 접시를 품어. <ol><li> 성장은 어느 한천 플레이트에서 관찰되는 경우, 사용 펩톤 물 병은 폐기되어야하며 연구의 결과는 무효화됩니다. </li></ol></li><li> 양성 대조군 재 역가 사용 된 세균 배양 용 스톡. 반전 1-2 일 정기적으로 성장을 확인하기위한 적절한 조건에서 접시를 품어. 역가 기록 CFU / ㎖를 기록 ± 1.0이어야한다연구를위한 에드 재고 역가가 (섹션 1.5 참조) 유효한 것으로 간주합니다. </li></ol>

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이 논문의 모든 저자는 현재 데루 BCT, 미라 솔 PRT 시스템의 개발 및 제조 업체에 의해 사용된다. 이 비디오 기사에 대한 출판 비용은 데루의 BCT가 지불되었다.

세균 검사는 혈액 금융 기관에서 일반적인 관행이되었다 많은 위치에 대한이 세균 오염 된 혈소판의 수혈을 방지하기 위해 기본 방법 역할을합니다. 세균의 스크리닝은 일반적 S. 같은 빠른 성장 그람 음성 박테리아의 대부분을 interdicts 있지만 티아 균, E. 대장균 및 E. 박터 클로 아카에 균, 이는 S. 같은 느리게 성장하는 그람 양성 세균을 검출하기 위해 분투 구균, 연쇄상 구균 SPP. 및 S. 표피 8. 불행히도, 이러한 세 그람 양성 세균은 환자 사망률 1 이끌었다 오염 된 혈소판이 세 단위를 함유하는 유기체 혈소판 수혈 제품의 50 %의 위쪽에 연루되어있다. 적어도 하나의 유기체가 전형적인 4-8 ml의 선별 시료 내에 포함되도록 세균의 스크리닝에 충분히 높은 것으로 혈소판 생성물 세균 역가에 의존. 세균은 4-8 ㎖의 샘플 볼륨에 캡처하는 세균 역가가 충분히 높지 않으면, 장치는 잘못 부정적인 것으로 플래그되며 이것은 수혈을 위해 해제된다. 세균 검사에 대한 대안 접근 방식은 모든 혈소판 단위에서 수행 할 수 있으며, 그 이외의 기능과 오염 생물을 렌더링 할 수있는 능동적 인 프로세스를 사용하는 것이 될 수있다. 본 연구에서는, 박테리아의 높은 역가 의도적 리보플라빈 및 UV 광 병원체 환원 공정의 총 용량을 감소 테스트 유닛 혈소판에 첨가 하였다. 박테리아 하중이 본 연구에서 테스트되었지만까지 정상적으로 기부시 혈액 제제에서 발견 초과, 본 연구는 리보플라빈 및 UV 광 프로세스가 대폭으로 오염 된 혈소판 부에서 생균의 역가를 감소시킬 수 있음을 입증하는 데 도움 5.4 로그 (세균 오염의 99.7-99.9996 % 감소) (그림 2) 2.6. ACCURA를 얻으려면TE 대수 감소 값은, 그 세균 역가 단계를 수행 할 때 작업자가 정밀 피펫 기술과 함께 양호한 무균 기술을하는 것이 중요하다. 연속 희석을 수행 부정확 한 피펫 오류의 축적, 따라서 부정확 한 역가 측정 될 수 있습니다. 본 연구에서 수집 된 데이터는 낮은 수준의, 임상 적으로 관련 균혈증 (&lt;20 CFU / 단위)에 대해 시스템을 도전 리보플라빈 및 UV 빛과 이전 작업을 지원합니다. 이전의 연구는 실제 임상 오염 이벤트를 모방하도록 설계 결과 리보플라빈 보여 UV 광은 7 일 혈소판 저장 기간 동안 박테리아의 성장을 방지하는데 효과적이었다. 선행 연구로부터의 데이터에 기초하여 모델링 혈소판 제품의 세균 오염의 현재 위험 추정치는 현재 수준에서 8만큼 98 %까지 감소 될 수 있음을 시사한다. 리보플라빈 및 자외선 공정은 세균 화면에 호의적으로 비교유일한 임상 적 세균로드 8 도전 때 혈소판 단위 세균 오염 물질을 검출하기 위해 66 %의 효과를 입증 ING. 모든 기술과 같이, 혈소판의 제품 PRT 치료는 세균 오염 혈소판 유닛으로 한계를 가지고 연관된 합병증을 방지 할 수있다. PRT 시스템은 박테리아 포자에 대해 유효하지 않으며 PRT 시스템이 여전히 남아있는 독소 수신자에 혈성 쇼크를 유발할 수 그람 음성 세균의 높은 역가를 비활성화 할 수 있더라도 따라서, 엔도톡신을 불 활성화하지 않는다. 박테리아가 높은 역가에 전파하기 전에 PRT 가장 잘 보관시 초기에 수행된다. 이 두 연구의 조합에 의해 입증 된 바와 같이 결론적으로, 리보플라빈과 자외선 과정은 모두 그람 음과 그람 양성균의 세균 부하를 감소 시키는데 효과적이며, 세균 검사에 대한 대안을 제공 할 수 있습니다. 정기적으로 가공용리보플라빈 및 UV 빛 G 혈소판 제품은 바이러스 및 기생충과 같은 다른 혈액 매개 에이전트의 잠재적 인 전송을 줄일 수 있다는 이점이 있습니다.

혈소판 수혈, 혈장, 적혈구 및 포장 전혈 제품은 현대 의학에서 주요 역할을하고, 각종 질환을 치료하는 중요한 유체를 교체하고 궁극적으로 생명을 구하기 위해 사용될 수있다. 혈소판은 하나 전혈에서 분리 및 풀링 transfusable 용량으로 또는 혈소판 성분 채집 술의 과정을 통해 수집되는 셀룰러 제품입니다. 몸에있는 혈소판의 주요 역할은 상처 부위에서 출혈을 멈추게하고 지혈을 유지하는 데 도움이하는 것입니다. 낮은 혈소판 세포 수 (혈소판 감소증)을 앓고있는 환자는 자발적 출혈 사건에 취약 그들의 혈소판 세포가 정상 범위로 다시 카운트 가지고 혈소판 수혈된다. 수집 된 혈소판 5-7 일까지 동안 저장되고있는 동안 일정한 교반하에 22 ± 2 ℃에서 보관된다. 혈소판 수혈의 속성을 저장 수명이 때문에 공동으로 수혈받는 사람에게 약간의 위험을 유지에도 불구하고기생충, 박테리아와 바이러스 11에 의한 이러한 제품의 ntamination. 바이러스 핵산 테스팅의 구현 (NAT)이 간염 C 바이러스 (HCV), 간염 B 바이러스 (HBV) 및 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)와 같은 주요 혈액 매개 제제의 바이러스 전달의 위험을 상당히 감소하고있다 (5). 이러한 에이전트는 HIV 1 8,000,000 당 기부금, HCV 1 6,700,000 당 기부금 및 B 형 간염 바이러스 (15) 1 1,700,000 당 기부를하기 위해서는 캐나다 혈액 서비스에서 최근 출판은 잔여 위험을 추정하고있다. 혈소판 제품의 수백만 매년 수혈 때문에 많은받는 사람이 잠재적으로 생명을 위협하는 합병증에 노출 된 1,000 7 : 박테리아는 일반적으로 일반 대중에 덜 관심을 가너 있지만, 혈소판 제품의 세균 오염의 빈도가 높은 1로로 추정하고있다 패혈증 (6) 등을들 수있다. 연구는 시간에 그 세균 부하를 제안한다오염이 낮은으로, &lt;100 콜로니 형성 단위 (CFU) / 제품 2.16 그러나 영양이 풍부한 환경 상온 저장 전에 수혈에 위험 높은 역가에 증식하는 세균 오염 허용한다. 현재, 혈소판받는 도달 세균 오염을 방지하는 제품을 사용할 수있는 유일한 방법은 배양 승인 기반의 시스템과 치료의 신속한 테스트 포인트의 사용을 통해서이다. 요약하면, 배양 기반 시스템 혈소판 제품 4-8 ml의 샘플 병에 혈소판 생성물로부터 제거 접종이되는 세균이 제품에 증식 할 수 있도록 12 ~ 24 시간, 22 ℃에서 교반에 저장된 영양 배지를 포함. 병은 세균의 성장을위한 병을 모니터링하는 기기에 배치됩니다. 악기가 병에 박테리아의 성장을 감지하면이를 신고하고 해당 혈소판 유닛은 폐기된다. 이 과정은 빠른 촉진제를 검출하기에 합리적으로 성공하지만날개 생물, 느린 성장 종의 많은 따라서 수혈 7,12,14,16,22에 대한 발표 될 위음성 단위의 가능성을 만들어 감지 할 수있을만큼 충분히 높은 역가에 성장하지 않습니다. 세균 부하가 상당히 증가되면 배양 기반 탐지 시스템과 달리, 케어 테스트 포인트는 통상적으로 신속한 혈소판 저장 기간에서 나중에 수행된다. 높은 역가가 관리 시험의 포인트는 문화 기반 시스템보다 덜 민감하기 때문에 필요하고, 그들이 역가 ≥1 × 103 CFU / ㎖ (17)에 도달하면 만 안정적으로 박테리아를 검출한다. 그러나 이러한 테스트는 샘플링 1 시간 이내에 결과를 제공 할 수 있습니다. 이러한 테스트의 성능에 변동성은받는 사람 9 치명적인 패혈증 반응을 일으키는, 허위 부정 제품의 방출을 주도했다. 혈소판 제품의 세균 오염의 문제에 대처하기 위해 다른 방법은 병원체 환원 PROC 루틴의 사용을 통해 인오염 된 세균을 비활성화하는 대신 그들을 감지하는 시도 할 수 있습니다 ESS. UV 광과 함께, 광 증감 제로서 사용 리보플라빈, 리보플라빈 및 박테리아 3,4,8,10,19-21 UV의 국지적 인 사용을 포함한, 혈액 유래 병원균 오염 물질의 넓은 범위의 감염을 감소시키는 것으로 나타났다 병원체 환원 광 비 독성 및 비 돌연변이 유발하며, 리보플라빈 및 UV 광 처리 된 성분은 수혈 수신자뿐 아니라 혈액 제품 (18)을 처리 대 그 안전한 것으로 밝혀졌다. 간단히, 리보플라빈 분자는 박테리아, 기생충, 바이러스, 모든 유핵 세포 (예 백혈구)의 핵산 (DNA 및 RNA)와 연결할 수있다. UV 광에 노출 따라서 핵산의 복제 및 / 또는 전사를 방지하고, 13 비활성화 유기체 떠나는 핵산 (주로 구아닌 염기)의 작용기에 화학적 변화를 일으키는, 리보플라빈 활성화한다. 판 같은 Anucleated 세포수 및 적혈구 인해 핵산의 부족 리보플라빈 화학에 의해 영향을받지 않는다. 리보플라빈과 자외선 기술 이전 작업은 임상 적으로 세균 부하 (&lt;20 CFU / 제품) (8)에 오염 된 혈소판 제품을 모방하기위한 실험 설계를 사용하여 박테리아의 선택 그룹을 평가 하였다. 이 연구의 목적은 높은 역가 세균 오염에 대해 리보플라빈 및 UV 광 처리를 평가 하였다 (&gt; 1.0 × 105 CFU / ㎖) 시스템의 총 세균 환원 능력을 측정하기 플라즈마 처리 혈소판 제품. hemovigilance 연구 (1)로부터 수집 된 데이터에 기초하여, 일반적으로 발생하는 그람 음성 및 그람 양성균의 패널을 대상으로 평가를 위해 선택되고 다음 종 포함 하였다 : 표피 포도 구균, 황색 포도상 구균, 스트렙토 mitis가 각각 1 주 씩으로, 스트렙토 오게 네스, 세라 티아 균, 예 르시 니아 enterocolitica을 ,브루셀라 neotomae, 바실러스 세레 우스 (식물 양식), Esherichia 대장균, 녹농균과 폐렴 간균. B를 제외한 모든 생물, 세레 우스는 ATCC로부터 수득하고, 우선 혈액 성분으로부터 분리되는 것으로서 식별되었던 균주를 얻기에 넣었다. B. 세레 우스는이 연구에서 테스트하는 것은 오염 된 혈소판 제품에서 내부적으로 고립 된 임상 균주이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mirasol Illuminator</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirasol Treatment/Storage Bag</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Analyzer</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>Ac&#8226;T diff&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Analyzer</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidLab 1265&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Docking Device</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>TSCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Incubator</td>
			<td>Helmer</td>
			<td>PC2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Incubator Shaker</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td align="right">4628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Iso-temp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo-forma</td>
			<td align="right">1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Sealer</td>
			<td>Sebra</td>
			<td>Smart Sealer II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Centra GP8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Dilution Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>R-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">4780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mL 500 &#181;M Riboflavin</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>35 mL 500 &#181;M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brucella Agar with 5% Horse Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td align="right">221547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>B9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Water</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">257087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">299113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Remel</td>
			<td>R01917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">26050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

treatment of platelet products with riboflavin and uv light: effectiveness against high titer bacterial contamination

세균에 의한 혈소판 단위의 오염은 오랫동안 그들의 포스트 기부의 보관 조건에 크게 수혈 위험으로 인정되고있다. 제품은 정기적으로, 교반 진탕 기에서 22 ℃에서 박테리아의 성장을 촉진 할 수있는 조건을 저장됩니다. 혈소판 제품에 도입 될 것으로 박테리아의 총 수는 매우 낮지 만, 이들 박테리아는 잠재적으로 심각한 부작용을 초래하는 매우 높은 역가 이전 수혈로 곱할 수있다. 본 연구의 목적은 혈소판 제품의 일반적인 오염 물질로 확인 된 박테리아의 패널에 대하여 리보플라빈 기반 병원체 환원 공정을 평가하는 것이었다. 이 패널은 다음과 같은 유기체를 포함 : S.을 표피, 황색 포도상 구균, S. mitis가 각각 1 주 씩으로, S. pyogenes의, S. 티아 균, Y. enterocolitica, B. neotomae, 나 세레 우스, 대장균, 녹농균 및 K. 폐렴. 각 유닛은 혈소판 높은 세균 부하를 접종하고, 시료 b를 제거한전과 치료 후 OTH. 콜로니 형성 분석을 종점 희석 방식을 사용하여이 전처리와 후 처리 세균 역가를 결정하는 데 사용되었다. log 감소는 전처리 역가에서 후 처리 역가를 감산하여 계산 하였다. 다음 로그 감소가 관찰되었다 : S. 표피 4.7 로그 (99.998 %), 황색 포도상 구균 4.8 로그 (99.998 %), S. 3.7 로그 (99.98 %) mitis가 각각 1 주 씩으로, S. pyogenes의 2.6 로그 (99.7 %), S. 티아 균 4.0 로그 (99.99 %), Y. enterocolitica 3.3 로그 (99.95 %), B. neotomae 5.4 로그 (99.9996 %), B. 세레 우스 2.6 로그 (99.7 %), 대장균 ≥5.4 로그 (99.9996 %), 녹농균 4.7 로그 (99.998 %)과 K . 폐렴 2.8 로그 (99.8 %). 이러한 연구 결과는 박테리아 오염 프로세스와 관련된 심각한 부작용 수혈 사건의 위험을 낮출 수 도움 제안한다.

열한 다른 세균 종의 감소는 리보플라빈 및 UV 광 PRT 기반 프로세스를 사용하여 평가 하였다. 이러한 에이전트는 혈소판 제품의 일반적인 오염 물질의 일부​​를 표현하고 긍정적 인 다섯 그람 여섯 그람 음성균을 포함한다. 적어도 6 혈소판 제품은 생물체마다 평가하고, 각 제품은 혈소판 제품에 박테리아의&gt; 1.0 × 105 CFU / ml의 최종 역가를 수득 충분히 균을 접종 하였다. 처리 전 샘플 혈소판 생성물을 신속히 리보플라빈 및 UV 공정으로 처리하고, 그 후에 전처리 역가를 측정하기 위해 제거 하였다. 다음 로그 감소가 관찰되었다 혈소판 제품의 처리를 다음을 S. 표피 4.7 로그 (99.998 %), 황색 포도상 구균 4.8 로그 (99.998 %), S. 3.7 로그 (99.98 %) mitis가 각각 1 주 씩으로, S. pyogenes의 2.6 로그 (99.7 %), S. 티아 균 4.0 로그 (99.99 %), Y. enterocolitica 3.3 로그 (99.95 %), B.neotomae 5.4 로그 (99.9996 %), B. 세레 우스 2.6 로그 (99.7 %), E. 콜라이 ≥ 5.4 로그 (99.9996 %), P. 녹농균 4.7 로그 (99.998 %), K. 뉴 모니 및 2.8 로그 (99.8 %) (도 2). 리보플라빈 및 UV 처리에 대해 전술 한 바와 같이 모든 장치들은 시스템 사양을 충족. 추가의 환원 시험을 행 하였다 S. 버피 코트 유래 혈소판을 사용하여 화농. 큰 차이는 S.의 감소는 관찰되지 않았다 혈소판 성분 채집 대 버피 코트 유도 혈소판에 오게 네스 (데이터는 미도시). <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" /> 표 1 : 리보플라빈과 UV 광을 사용하여 평가 박테리아 종의 성장 조건. 혈소판 제품을 오염시키는 것으로 나타났다 모두 그람 양성균과 그람의 패널을 본 연구를 위해 선별 하였다. 성장 전파 할 조건 (온도 및 미디어 유형) 및 Tite의R 생물이 표시됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" /> 그림 1 : 리보플라빈 및 UV 빛의 병원균 감소 처리. 리보플라빈은 500 μM의 농도에서 공칭 0.9 % 식염수에 용해시켰다. 액 상체는 각 제품에 접속되어 방전 멸균 하였다. 박테리아는 혈소판 각 유닛에 무균 첨가 한 다음 UV 에너지 (약 6-10 분) 6.2 J / ㎖로 처리 하였다. 이 시험 관내에서 처리 후 혈소판 부는 최종 세균 역가를 결정하는 샘플링 공부. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" /> 그림 2. 리보플라빈 및 UV 광으로 처리 리보플라빈 및 UV 광이 혈소판 제품의 일반 세균 오염 박테리아 하중을 감소시키기 위해 사용 된 다른 세균 종의 감소. 로그 감소 10 차이다평균 전처리 역가 평균 후 처리 역가 사이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

리보플라빈과 혈소판 제품 및 자외선 치료 : 높은 역가 세균 오염에 대해 효과

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

treatment-platelet-products-with-riboflavin-uv-light-effectiveness

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K 조회수.  Scientific Affairs. The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

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Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

세포내 세균성 병원균과 Zebrafish 태아의 감염

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

연구

면역학 및 감염병학

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

세포에 붙어 Antileishmanial 검사에 대한 기생충 구조 및 변화 분석<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 인간 급성 백혈병 Monocytic 셀 라인에서&gt; Amastigotes

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Lentiviral vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types of cells. Because of safety concerns associated with these HIV-1 derived vectors, producing large quantities of LVs is challenging. In this paper, we report a method for producing high titers of self-inactivating LVs. We retrovirally transduce the tet-off stable producer cell line GPR to generate a cell line, GPRS, which can express all the viral components, including a dendritic cell-specific glycoprotein, SVGmu. Then, we use concatemeric DNA transfection to transfect the LV transfer plasmid encoding a reporter gene GFP in combination with a selectable marker. Several of the resulting clones can produce LV at a titer 10-fold greater than what we achieve with transient transfection. Plus, these viruses efficiently transduce dendritic cells in vitro and generate a strong T cell immune response to our reporter antigen. This method may be a good option for producing strong LV-based vaccines for clinical studies of cancer or infectious diseases.

Here, we use retroviral transduction and concatemeric transfection to create a cell line that can express the components of a lentiviral vector (LV) in the absence of tetracycline. This LV encodes GFP and is pseudotyped with a glycoprotein, SVGmu, which is specific for a receptor on dendritic cells.

항생 물질 규제 세포주 특히 수지상 세포를 대상으로 높은 titer의 렌티 바이러스 벡터를 생성

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

높은 처리량 Shigella-특정 살 균 시험

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

기능 리포터 시스템으로 특정 진 균의 오 번역 비율 측정

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

고병원성 H5N1 및 조류 H7N9 바이러스의 엔벨로프 당단백질을 가진 고적퇴력 감염성 인플루엔자 슈도타입 입자 의 생산

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to animal infections in vivo. The existing in vitro tests typically overestimate antimicrobial efficacy as the presence of host tissue as a diffusion barrier is not accounted for. To overcome this bottleneck, we have developed an ex vivo porcine corneal model of bacterial keratitis using Pseudomonas aeruginosa as a prototypic organism. This article describes the preparation of the porcine cornea and protocol for establishment of the infection. Bespoke glass molds enable straightforward setup of the cornea for infection studies. The model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue. Establishment of infection is verified as an increase in the number of colony forming units assessed via viable plate counts. The results demonstrate that infection can be established in a highly reproducible fashion in the ex vivo corneas using the method described here. The model can be extended in the future to mimic keratitis caused by microorganisms other than P. aeruginosa. The ultimate aim of the model is to investigate the effect of antimicrobial chemotherapy on the progress of bacterial infection in a scenario more representative of in vivo infections. In so doing, the model described here will reduce the use of animals for testing, improve success rates in clinical trials and ultimately enable rapid translation of novel antimicrobials to the clinic.

This article describes a step-by-step protocol to set up an ex vivo porcine model of bacterial keratitis. Pseudomonas aeruginosa is used as a prototypic organism. This innovative model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue.

세균성 각막염에 대하여 약 처리를 공부하기 위한 돼지 Ex Vivo Cornea 모형 을 설치합니다

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...

Methods Article

리보플라빈과 혈소판 제품 및 자외선 치료 : 높은 역가 세균 오염에 대해 효과