장비 <ul><li> 조직 문화와 보육, 37 ° C, 5 % CO 2 </li><li> 원심 분리기 </li><li> micropipettors (100, 100μL)의 설정 </li><li> 워터 목욕 37 ° C </li><li> 물 목욕 90 ° C는 증기 물 원본으로 </li><li> 위상 대조 현미경 </li></ul> 첫 번째 단계 colcemid와 세포 치료 이 절차에서는 20 %의 녹아웃 혈청 교체 (KSR, Gibco) 및 8ng/mL의 보충과 mitomycin C (시그마)와 inactivated과 DMEM/F12 (Invitrogen)에 마우스 배아 섬유아 세포 유지 (mEF)에 교양 hESC 라인 H9를 사용 fibroblast의 성장 인자 (FGF - 2, R &amp; D). metaphases의 확산의 큰 숫자를 얻기 위해서는, 그것은 많은 나누어 세포가있는 높은 mitotic 지수와 문화를 사용하는 것이 좋습니다. <ol><li> 인큐베이터에서 문화 술병을 가지고 있으며, 층류에서 0,1 μg / ML의 최종 농도에 Colcemid 추가할 수 있습니다. </li><li> 인큐베이터에 술병을 반환하고 억제제가 염색체 잘 응축하고 현미경으로 쉽게 시각 수 metaphase에 mitotic의 체포를 일으킬 수 있도록 3 시간 기다립니다. </li></ol> 세포를 고정 <ol start="3"><li> 매체를 가지고 세포의 표면을 커버하기 위해 tripsin / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.05 %가 충분한 추가할 수 있습니다. 세포가 상온에서 5 분 부화 후 혈청을 포함한 배지를 추가하여 또는 세포에 혈청 추가하여 두 효소를 inactivate 수 있습니다. 참고 : 단일 세포 현탁액이 좋은 metaphase의 확산을 얻는 달성되었는지 확인하는 것이 중요합니다. </li><li> 15 ML의 원심 분리기 튜브와 5 분 122g에서 원심 분리기에 세포를 전송합니다. </li><li> 200 ML에 대해 떠나, 표면에 뜨는를 폐기하고, 같은 비디오 같이 튜브를 감청하여 부드럽게 펠렛을 resuspend. 세포가 잘 dissociated되므로,이 솔루션에 대단히 짧은 시간을 시각화 수 있는지 확인하십시오. </li><li> 다음 당신은 hypotonic 솔루션 5 ML (KCl 75mM) 37 미리 예열 ° C, 천천히, 다음 설명에서와 튜브 벽에 의해.를 추가해야합니다 우선 단지 다음 hypotonic 솔루션으로 세포를 섞어 나머지 두 ML을 추가하고 37 보온 ° C를 15 분 동안에 수평 위치로 튜브를 반전, 3 ML를 추가합니다. 참고 :이 시점에서 hypotonic 솔루션은 세포 볼륨에 증가 원인과 염색체를 수습하는 데 도움이 될 것입니다. 부화의 시간은 좋은 염색체 확산을 습득하는 것이 중요합니다. 타이밍이 너무 긴 경우, 세포막 너무 일찍와 염색체가 손실됩니다 버스트 수 있습니다. 너무 짧은 경우, 그것은 세포막이 중단되지 않을 수 있기 때문에 염색체 확산을 얻기 어려울 수 있습니다. </li><li> 정착액 용액 (메탄올 / 빙초산 3시 1분) 3 방울을 추가, 쉬지 않고 5 분 122g의 세포 원심과 정착액 솔루션을 섞어 부드럽게 튜브를 반전. 참고 : 정착액 솔루션 갓하여야한다. 참고 : 자료 손실을 방지, 세포의 마찰을 피하기 위해 쉬지 않고 원심 분리를 사용하는 것이 중요합니다. </li><li> 200 ML에 대해 떠나, 표면에 뜨는를 폐기하고, 튜브의 바닥을 감청하여 부드럽게 펠렛을 resuspend. 참고 : 다시 세포가 잘 dissociated되므로,이 솔루션에 대단히 짧은 시간을 시각화 수 있는지 확인하십시오. </li><li> 당신이 튜브를 회전하는 동안, 튜브 벽에 의해 천천히, 정착액 솔루션의 처음 3 ML을 추가합니다. 그냥 세포를 섞어 다음 세포를 잡으러 튜브 벽에 의해 고정력있는 솔루션의보다이 ML을 추가하는 수평 위치로 튜브를 반전. 4 ° C 하룻밤에 주식. 참고 : 고정 세포는 4 개월 동안 정착액 용액에 저장할 수 있습니다 ° C. 자신의 부푼 상태에서 세포를 보호하는 외에, 정착액 솔루션은 lipids 및 denatures 단백질을 제거합니다. 이러한 이벤트는 결과로, 염색체 쉽게 전파하게, 세포막이 약해하고. </li></ol> 유리 슬라이드 청소 귀하의 염색체 확산은 슬라이드가 깨끗한지 또는 일부 핵을 잃을 수 있으며 metaphases 있는지 확인하고 시작하기 전에. 어떤 하이브리드화 기술 9 시도하려는 경우이 단계 역시 중요합니다. <ol><li> 이곳은 실온에서 최소 3 H에 대한 6M HCL을 포함하는 비커에 슬라이드. </li><li> 이 시간 이후 10 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 증류수에있는 슬라이드를 씻어 실온에서 그들이 말리면. </li><li> 이제 슬라이드가 96 % 에탄올에 저장하여 사용할 수 보푸라기가없는 바로 전에 건조하실 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 현장 하이브리드화 방법의 경우, 슬라이드가 96 % 에탄올에 2 개 이상의 일간 저장되지 않습니다 두 번째 단계 세포를 세척 <ol start="10"><li> 다음날, 쉬지 않고 5 분 122g에 세포를 원심 분리기. </li><li> D200 ML에 대해 떠나는 뜨는을 iscard. 부드럽게 튜브를 회전하는 동안 튜브 그런 다음 튜브 벽에 의해 천천히, 신선한 정착액 솔루션 5 ML (메탄올 / 빙초산 3시 1분)을 추가 flicking하여 펠렛을 Resuspend. 이 세척 세 세척 총 2 번 이상 단계를 반복합니다. 참고 : 정착액 솔루션 갓하여야한다. </li></ol> 슬라이드를 준비 <ol start="12"><li> 마지막으로 원심 분리 단계에서 (그림 1 참조) 셀 펠렛을 균질하고 슬라이드에 세포의 적절한 밀도를 얻기 위해 솔루션의 충분한 양의 두십시오. </li><li> 아주 가까이 그리고 표면에 평행 피펫을 이동하여 깨끗한 마른 슬라이드에 세포 현탁액의 20-30 μL를 추가합니다. 정착액 솔루션 증발, 슬라이드의 표면은 낟알이됩니다. </li><li> 즉시, 전지가 폭발 원인 30 초 동안 온수 (90 °)의 증기로, 슬라이드를 노출까지 얼굴. 참고 :이 시점에서, 증가 초산 농도에서 발생하는 정착액 솔루션 증발에서 메탄올은, 물과 함께하는가 확산 유전자를 자극. </li><li> 농도뿐만 아니라 세포 분포는 (그림 1 참조) 좋은 경우 그냥 확인하고 위상 대조 현미경보세요. </li><li> 이제 슬라이드 G - banding (Giemsa), 생선, 하늘 CGH로 cytogenetics 접근에 의해 염색체의 집합을 확인하는 데 사용할 준비가되었습니다. </li></ol> 중요 힌트 분석에 적절한 metaphase를 어떻게 선택 원형 및 격리 metaphases (그림 2D)을 선택하면 둘 이상의 의해 생성된 염색체의 증가가 함께 혼합하거나 시작 염색체에 의해 생성된 염색체의 손실 확산으로 허위 aneuploidies을 고려하여 피할 수 있습니다. 그래서, 일부 염색체 그들 (그림 2A와 2B)에 의해 숨겨져있을 수 있기 때문에 핵 근처 metaphases을 선택하지 마십시오. 게다가 라운드 metaphases 찾는 및 염색체가 metaphase (그림 2C)에서 분리되었는지 확인합니다. 피더 세포와 hESC의 핵형 피더 세포가 분열 상태 (mitomycin C 또는 방사선에 의해 inactivated)에서되지 않으며 metaphase 인구의 일부가되지 않을 것이기 때문입니다 G - banding과 SKY의 분석을 위해, hESC 문화 피더 세포의 존재가 결과에 영향을주지 않습니다. 그러나, 계면 핵의 물고기 기술의 응용 프로그램에 대한, 그것은 생선 분석 trypsinization하기 전에 수동으로 식민지를 수확하여 피더 세포에서 hESC 인구를 분리하는 것이 좋습니다. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig1tmb.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : 슬라이드에 적절한 셀 밀도를 어떻게 알아. 10X 목적의 위상 대조 현미경 이미지. (A) 세포 밀도가 너무 높습니다. 화살표가 너무 가까이 핵의 확산 metaphase를 가리 킵니다. (B) 좋은 세포 밀도 슬라이드. 동그라미는 핵이나 기타 metaphases에서 고립 metaphases의 확산을 보여줍니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig2tmb.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 : 어떻게 분석하는 적절한 metaphase을 선택할 수 있습니다. 염색체는 DAPI와 100x 목적에 형광 현미경으로 얻은 이미지를 물들일 수 있습니다. (A) (B) 핵 근처 metaphases (화살표로 표시) (C)을하지 않도록하고 현재 염색체는 (동그라미)로 구분되는 둥근하지 metaphases. (D) 원형 metaphase는 분석이 될 수있는 좋은 metaphase입니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

<ol>
	<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).</li><li>Draper, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+gain+of+chromosomes+17q+and+12+in+cultured+human+embryonic+stem+cells.">Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).</li><li>Maitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+alterations+in+cultured+human+embryonic+stem+cells.">Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Genet. 37 (10), 1099-1099 (2005).</li><li>Mitalipova, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells.">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-19 (2005).</li><li>Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotype+of+human+ES+cells+during+extended+culture.">Karyotype of human ES cells during extended culture.</a> Nat Biotechnol. 22 (4), 381-381 (2004).</li><li>Caisander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+integrity+maintained+in+five+human+embryonic+stem+cell+lines+after+prolonged+in+vitro+culture.">Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture.</a> Chromosome Res. 14 (2), 131-131 (2006).</li><li>Imreh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+conditions+favoring+selection+of+chromosomal+abnormalities+in+human+ES+cells.">In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells.</a> J Cell Biochem. 99 (2), 508-508 (2006).</li><li>Robin-Wesselschmidt, J. L., Loring, J. F., Robin-Wesselschmidt, J. L., Robin-Wesselschmidt, S. c. h. w. a. r. t. z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Stem Cell Manual. , 59-59 (2007).</li><li>Rooney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cytogenetics. , (2001).</li><li>Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T., Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical in situ hybridization. , 51-51 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

염색체 확산의 준비 G - banding과 같은 물고기, 하늘과 CGH와 같은보다 정교한 기술로 일상적 방법으로 배아 줄기 세포의 유전자 상태의 성공적인 분석을 위해 매우 중요한 단계입니다. 이 절차는 세포주기의 길이에 따라 다릅니다 colcemid 부화의 기간을 변화하여 많은 세포 유형에 적용할 수 있습니다. embryoid 시체 (EB)이 시간이 최대 6 시간 수 있지만 배아 줄기 세포의 식민지 위...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>15 ml centrifuge tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TPP</td>
<td>91015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Colcemid Karyo MAX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15212-012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofar</td>
<td>721</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glacial acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofar</td>
<td>100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofar</td>
<td>208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>104.931.000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioslide</td>
<td>7105-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tripsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>T4799</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chromosomal spread preparation of human embryonic stem cells for karyotyping

인간 배아 줄기 세포 (hESC) 안정 diploid의 핵형 1 현재까지 표시되어 있지만, 많은 연구가 문화 조건에 따라 그러한 전체의 추가 또는 염색체의 일부로 염색체 이상이 취득하는 경향이 될 것으로보고있다. 효소 또는 화학적 분리가 2,3,4를 사용하는 경우 passaging에 대한 식민지의 수동 절개는 안정적인 핵형 5 유지하면서 실제로 장기적인 문화 중, karyotypic 변경이 관찰됩니다. 게다가, 피더 세포의 제거 등 환경의 변화는 hESC 3,6의 유전자 무결성을 손상하는 것 같습니다. 일단 염색체 변경은 중요한 고려 hESC는 embryogenesis 연구 및 약물 검사에 필수적인 도구로, 체외에서 hESC의 유전자 무결성의 특성을 세포 생리입니다 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 미래의 치료 목적으로 염색체 변화는 그것이 자주 carcinogenesis에 관련된로서 정말 걱정입니다. 여기 우리는 G - banding, 물고기, 하늘 CGH 기법 7,8으로 설정 염색체의 후속 분석을 위해 고품질의 염색체 확산을 얻을 수있는 간단하고 유용한 방법을 보여줍니다. 우리는 translocations과 aneuploidies의 모양을 모니터하기 위해 5 구절의 간격으로 정기적으로 염색체 상태를 확인하는 것이 좋습니다 Priscila Britto과 Rafaela Sartore이 종이에 똑같이 기여.

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Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Karyotyping 널리 유전 변경을 검출에 사용되는 간단하고 유용한 기술입니다. 우리가 문화의 유지 이러한 세포의 염색체 상태를 감시하기위한 인간 배아 줄기 세포의 염색체 보급 준비 단계 프로토콜에 의해 단계를 설명합니다.

Karyotyping를위한 인간 배아 줄기 세포의 염색체 확산 준비

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

chromosomal-spread-preparation-human-embryonic-stem-cells-for

Research

JoVE Journal

Biology

48.5K 조회수.  Federal University of Rio De Janeiro-UFRJ. Karyotyping 널리 유전 변경을 검출에 사용되는 간단하고 유용한 기술입니다. 우리가 문화의 유지 이러한 세포의 염색체 상태를 감시하기위한 인간 배아 줄기 세포의 염색체 보급 준비 단계 프로토콜에 의해 단계를 설명합니다.

비디오: Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

인간의 배아 줄기 (ES) 세포의 전파

연구

생물학

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Immunosurgery에 의해 인간 배아 줄기 세포의 유도

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

자기 공명 영상을위한 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨에

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

인간 배아 줄기 세포의 문화 및 유지 관리

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

인간 배아 줄기 세포를 동결 융해

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.