이 논문에서 설명하는 작업은 패트릭 F. 테일러 재단의 자금에 의해 가능하게되었다.

1. 자기편 세포의 염색체 수확 <ol><li> 표준 프로토콜 <ol><li> 특정 세포 배양 조건에 따라 세포를 성장. 세포가 로그 단계 (80 % 컨 플루)에 도달 한 경우, 세포 배양 플라스크에 Colcemid의 10 μL / ㎖를 추가합니다. 2 × 10 6 세포의 최소 권장합니다. </li><li> 45 분 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어. 멸균 피펫을 사용하여, 15 ML 원뿔 튜브에 세포에서 미디어를 전송할 수 있습니다. 옆으로 설정합니다. </li><li> 조심스럽게 플라스크에 HBSS 버퍼 2 ㎖를 추가하여 세포를 씻으십시오. 소용돌이 버퍼링 한 후 피펫을 사용하여 제거합니다. 폐기하십시오. </li><li> 이 플라스크의 전체 표면을 커버 것을 보장, 트립신 1 ML을 추가합니다. 약 2 분 동안 트립신의 세포를 둡니다. 세포의 대다수가 분리 한 후에 다시 셀에 원추형 튜브 미디어 피펫. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 10 ㎖ 분량 씩에 세포 현탁액을 전송합니다.10 분 200 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 펠렛을 재현 탁. </li><li> 원뿔 튜브에 남아있는 펠릿에 37 ° C에 데워진 된 0.075 M의 KCl 10 ㎖를 추가합니다. 의 KCl과 세포를 혼합하는 중간 속도의 소용돌이 관. </li><li> 10 분 동안 37 ° C에서 세포를 품어. 25 ℃에서 5 분 200 XG에 원심 분리기 과에 resuspend 펠렛 (약 0.5 ml의 유적까지) 뜨는을 제거합니다. </li><li> 소용돌이로 교반하면서 세포 : 조심스럽게 신선한 Carnoy의 정착액 5 ㎖ (빙초산, 메탄올의 비율은 3:1)를 추가합니다. 그런 다음 10 ㎖의 총 텍싱없이 정착보다 5 ㎖를 추가합니다. </li><li> 5 분 200 XG에 원심 분리기. 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 각 튜브에 정착의 5 ML을 추가합니다. </li><li> 5 분 200 XG에 원심 분리기. 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 각 튜브에 정착의 5 ML을 추가합니다. 세포는 지금까지 1 년에 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 의정서 수정 : 염색체 harvesti임파 세포 라인의 NG <ol><li> 특정 세포 배양 조건에 따라 세포를 성장. (사용은 세포가 배양되는 금액에 대해 적절한 플라스크). 세포가 로그 단계 (세포가 분할되어 대략 2 일 후)에 도달하면, 세포 배양 플라스크에 Colcemid의 10 μL / ㎖를 추가합니다. </li></ol></li><li> 의정서 수정 : 전체 혈액에서 염색체 수확 피토 헤 마글 루티 닌 (PHA)는 빨간색 신장 콩에서 유래 된 렉틴은, 인간 T-세포 (16)에 대한 강력한 유사 분열 물질이다. 72 시간 배양에 PHA의 첨가 후, 세포의 약 45 %는 S 단계에있다. 이 피크 유사 분열 활동을 대표하는, 염색체 연구에 수확하는 최적의 지점입니다. B 세포에게 17,18 분석시 등의 pokeweed (1-10 ㎍ / ㎖)와 같은 다른 유사 분열 물질이 사용될 수있다. <ol><li> 녹색 정상 나트륨 헤파린 튜브에 전체 혈액의 적어도 1 ㎖를 수집합니다. 수집 후 3 일 이내에 사용하십시오. RT UN에서 보관 혈액사용할 준비가 나타나기 전까지는. </li><li> 분취 L-글루타민 (20 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % fungizone 및 1 % PHA)를 함유하는 완전 RPMI 매체 10ml에 전혈 0.25 밀리리터. 5 % CO 2와 37 ° C에서 문화. </li></ol></li><li> 의정서 수정 : 골수에서 염색체 수확 염색체 이상 클론의 관찰이 백혈병의 특정 유형에 대한 진단 할 수 있으므로 골수에서 세포 유전 학적 분석은 많은 악성 혈액 질환에 도움이됩니다. 염색체 연구는 또한 폭발의 위기와 치료에 대한 반응의 증상으로 질병의 진행을 평가하는 데 사용됩니다. 골수 세포는 활발하게 분열하고 있기 때문에, 어떠한 미토 겐 자극 9,19 필요 없다. 급성 백혈병의 경우 24, 48 시간 배양도 설정되어 있습니다. <ol><li> 녹색 정상 나트륨 헤파린 관에서 골수의 최소 1 ㎖를 수집합니다. L-글루타민 (2을 함유하는 완전 RPMI 매체 10ml에 골수의 분취 0.25 밀리리터0 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % fungizone). 5 % CO 2와 37 ° C에서 문화. </li></ol></li></ol> 2. 슬라이드 준비 및 고체 염색 한 대표 슬라이드의 신속한 평가는 G-밴딩, FISH, CGH, 또는 SKY로 추가 절차를 계속하기 전에 수확의 품질에 대한 정보를 제공합니다. 일부 연구소는 고체 얼룩에 빠른 수확 및 염색체 평가를위한 세포를 선호합니다. 대안 적으로, 위상차 현미경은이 분석을 위해 사용될 수있다. 슬라이드는 유용한 습도가 약 50 % 일 때 제조 및 주위 온도 (20-25 ℃)된다. <ol><li> 25 ℃에서 5 분 200 XG에서 세포를 원심 분리기 만 0.3 ~ 0.5 ㎖의 유적까지 뜨는을 제거합니다. </li><li> 야간 부드럽게 약 45 °의 각도로 기울어 및 현탁액이 허용되는 슬라이드에 대해 2의 거리에서 세포 현탁액의 펠릿, 피펫 세 방울을 재현 탁슬라이드 가로 질러. 슬라이드에 신선한 Carnoy의 정착액의 하나의 큰 방울을 추가합니다. </li><li> 종이 타월에 슬라이드 뒷면을 건조 후 적어도 10 분 동안 건조 밖으로 슬라이드를 앉아. 슬라이드가 완전히 건조해야한다. </li><li> 신선한 지엠 사 (Giemsa) 염색 솔루션 (Gurr 버퍼와 지엠 사 (Giemsa) 얼룩의 비율은 3:1)를 준비합니다. 염색 랙에 슬라이드를 놓습니다. 지엠 사 (Giemsa) 염색 용액에 슬라이드 전체를 커버. 슬라이드가 5 분 동안 염색 용액에 남아 보자. 증류수로 슬라이드를 씻어 흘려 공기 건조 할 수 있습니다. </li><li> 4 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입 방울과 슬라이드 커버 슬립을 추가합니다. 확실히 커버 슬립 아래에 기포가 없는지 확인합니다. 초과 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입는 종이 타월로 제거 할 수 있습니다. </li><li> 10X 및 100X 확대에 따라 광학 현미경으로 세포를 분석 할 수 있습니다. 중기 세포가 풍부하고 잘 확산되는 경우에, 나머지 슬라이드는 다른 실험 절차를 위해 사용될 수있다. </li></ol> 3. G-밴딩 트립신과 지엠 사 (Giemsa) (GTG)를 사용하여 &lt;P&gt; 트립신 높은 전사 활동의 결과로 DNA의 지역에서 실 염색질 (euchromatin) 히스톤을 변성 단백질 분해 효소이다. 지엠 사 (Giemsa) 염색 후,이 지역은 빛 밴드로 나타납니다. 거의 또는 전혀 전사 활동 (이질)와 매우 응축 된 염색질은 트립신 보호의 히스톤의 큰 부분이있을 것이다, 따라서 지엠 사 (Giemsa) 염색 다음 어둡게 얼룩 것입니다. 그것은 처음에 G-밴드 하나의 슬라이드에 조건을 모니터링하고 필요한 경우 후속 슬라이드의 트립신의 타이밍을 조절하는 것이 필수적입니다. <ol><li> 4 코 플린 단지에 다음과 같은 솔루션을 추가합니다. 항아리 # 1 1X HBSS의 = 30 ㎖ 및 10 배 트립신 4 ㎖ (0.5 %) 1X HBSS의 항아리 # 2 = 50 ㎖ 항아리 # 3 = 1X HBSS 45 ㎖ 및 소 태아 혈청 5 ㎖ 1X HBSS의 항아리 # 4 = 50 ㎖ </li><li> 5 초 동안 단지 1 위의 각 슬라이드, 항아리 # 2의 빠른 헹굼을 담가, 적어도 30 초 동안 항아리 # 3 항아리 # 4 빠른 헹굼을 각 슬라이드를 떠나 다음 슬라이드를 건조 할 수 있습니다. </li><li> 청정제를 준비H 지엠 사 (Giemsa) 염색 솔루션 (Gurr 버퍼와 지엠 사 (Giemsa) 얼룩의 비율은 3:1). 염색 랙에 슬라이드를 놓습니다. 지엠 사 (Giemsa) 염색 용액에 슬라이드 전체를 커버. 슬라이드가 5 분 동안 염색 용액에 남아 보자. </li><li> 그들은 더러워졌다 동일한 순서로 증류수에 슬라이드를 헹군다. 슬라이드를 약 10 분 동안 건조하도록 허용합니다. 슬라이드가 완전히 건조해야한다. </li><li> 4 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입 방울과 슬라이드 커버 슬립을 추가합니다. 확실히 커버 슬립 아래에 기포가 없는지 확인합니다. 초과 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입는 종이 타월로 제거 할 수 있습니다. </li><li> 10X 및 100X 확대에 따라 광학 현미경으로 세포를 분석 할 수 있습니다. 첫 번째 슬라이드의 결과에 기초하여 슬라이드의 나머지의 트립신 타이밍을 조정한다. </li></ol>

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우리는 다양한 인간에서 얻은 세포 유형, 붉은 털 원숭이, 쥐, 생쥐 11,20-22 등 다양한 생물의 세포에서 염색체 분리를위한 본 절차를 이용했다. 표준 프로토콜은 제공되지만, 특정 주요 단계와 변수는 세포의 이러한 다양한 유형의 조정해야 할 수도 있습니다. 몇몇 특정 단계 염색체 제제 및 결과의 최상의 품질을 보장​​하기 위해 G-밴딩 모두에 중요하다. 분석에 영향을 미칠 수있는 변?...

염색체 분석은 염색체 불안정성과 유전 질환 및 악성 종양의 1,2,8,9로 이어지는 재 배열을 진단하기 위해 전 세계적으로 이용되는 기존의 기술입니다. 또한, 헌법과 암 획득 유전자 이상을 진단 및 연구에 대한 높은 해상도는 형광 제자리 교잡 (FISH)와 같은 고전적인 세포 유전 학적 절차 및 분자 유전 학적 방법의 조합, 비교 게놈 교잡 (CGH)을 달성 할 수 있습니다 그리고 스펙트럼의 핵형 분석 (SKY) 14, 15. 더 최근에, 이러한 기술은 줄기 세포 연구와 관련된 염색체 불안정성의 평가에 이용되어왔다. 이러한 장기 배양 된 배아 세포 (ES)와 다양한 생물의 성체 줄기 세포의 이수성으로 핵형 이상은 여러 실험실에서보고되었다. 최근의 증거는 어떤 세포주가 본질적으로 염색체 instabi하는 경향 것을 지원에 관계없이 배양 조건의 품 질. 확립 및 / 또는 인간, 마우스 또는 히말라야 줄기 세포주를 유지하면 이러한 이유로, 염색체 분석 품질 관리 프로세스의 일부로서 추천. 많은 보고서 배양 10-13 줄기 세포 및 악성 세포 또는 다양한 유기체의 염색체 안정성을 모니터링 루틴 세포 유전학 및 분자의 사용에 대한 관심의 증가를 설명한다. 이러한 프로토콜은 점점 그 배양 세포 (13)의 급속한 염색체 평가에 비유 전적 연구소에서 사용되고있다. 우리는 다양한 유기체에서 파생 된 임상 및 연구 목적으로 세포 모두에 적용 할 수있는 다양한 종류의 세포에서 염색체 준비를위한 우리의 기본적인 절차를 제시한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">KaryoMAX Colcemid</td>
			<td style="width:213px;">Gibco</td>
			<td style="width:145px;">15212-012</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin EDTA 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Tablets &#34;GURR&#34;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10580-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Geimsa Stain</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3250-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>6700130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Krackeler Scientific Inc.&#160;</td>
			<td>11-9508-05</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromosome preparation from cultured cells

염색체 (염색체) 분석에 널리 염색체 불안정성의 검출에 사용된다. G-밴딩과 같은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광 등의 분자 기술에 의해 다음 경우,이 분석은 하나 이상의 염색체를 포함하는 게놈 재 배열 부분의 이익 또는 손실을 포함 수차에 대한 개별 세포를 분석 할 수있는 강력한 기능을 가지고 있습니다. 인간의 염색체 이상이 약 1 160 명당 1, 2, 모든 유산 60 ~ 80 %가 발생하는 3,4, 사산의 10 % 2,5, 선천성 심장 질환 6 3-6 %를 개인의 13 % 불임의 경우 2, 발달 지연과 출생 결함 (7)을 가진 많은 환자에서. 클론 염색체 이상을 관찰 모두 진단 및 예후 중요성 8,9이 표시되었습니다로 악성 종양의 세포 유전 학적 분석은 정기적으로, 연구자와 임상의에 의해 사용된다.60, 염색체 분리는 유전자 치료에 대한 소중하고 인간이 아닌 영장류와 설치류 10-13를 포함하여 생물의 줄기 세포 연구. 염색체는 혈액 림프구, 피부 섬유 아세포, amniocytes, 태반, 골수, 종양 표본을 포함한 살아있는 조직의 세포로부터 단리 할 수​​있다. 그들이 가장 응축 때문에 더 명확하게 볼 수 있습니다 때 염색체는 유사 분열의 중기 단계에서 분석된다. 염색체 분리 기술의 첫번째 단계는 후속 anaphase 단계로 진행하는 세포를 방지하기 Colcemid 함께 인큐베이션 스핀들 섬유의 파괴를 수반한다. 세포는 그 다음 저장성 용액으로 처리하고 Carnoy의 고착성과의 팽윤 상태로 보존된다. 세포는 그 다음 슬라이드에 떨어 된 후 다양한 절차에 이용 될 수있다. G-밴딩이 특징 빛과 어둠 밴드를 만들 지엠 사 (Giemsa)로 염색 한 다음 트립신 처리를 포함한다. 같은 홍보염색체를 분리 ocedure는 원위치 혼성화 (FISH) 형광, 비교 게놈 혼성화 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 (SKY) 14,15 같은 절차에 대한 세포의 제조에 사용될 수있다.

고품질 중기 스프레드 염색체 분석을 위해 필수적입니다. 성공적인 분석이 잘 확산 적합한 염색체 형태의있다 염색체를 얻을 수 있습니다. 제대로 G-밴드 염색체는 특성 밝은 부분과 어두운 줄무늬 패턴이 포함되어 있습니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1.jpg" /> 그...

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Chromosome Preparation From Cultured Cells

염색체는 림프구 나 피부 섬유 아 세포 등 살아있는 세포에서 분리하고, 인간이나 쥐 등의 유기체에서 할 수있다. 이러한 염색체의 준비는 더 일상 G 밴딩과 같은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광, 비교 게놈 교잡 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 분석 (SKY) 등의 분자 세포 유전 학적 과정에 활용 될 수있다.

배양 세포에서 염색체 준비

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

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Research

JoVE Journal

Biology

80.7K 조회수.  Louisiana State University Health Science Center.  염색체는 림프구 나 피부 섬유 아 세포 등 살아있는 세포에서 분리하고, 인간이나 쥐 등의 유기체에서 할 수있다. 이러한 염색체의 준비는 더 일상 G 밴딩과 같은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광, 비교 게놈 교잡 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 분석 (SKY) 등의 분자 세포 유전 학적 과정에 활용 될 수있다. 

비디오: Chromosome Preparation From Cultured Cells

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

카운팅 및 교양 세포의 생존을 결정

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

연구

생물학

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually scattered cells and small cell groups. This technique uses HistoGel (Thermo Scientific) with conventional laboratory equipment.
The use of cell block sections is a valuable ancillary tool for evaluation of non-gynecologic cytology. They enable the cytopathologist to study additional morphologic specimen detail including the architecture of the lesion. Most importantly, they allow for the evaluation of ancillary studies such as immunocytochemistry, in-situ hybridization tests (FISH/CISH) and in-situ polymerase chain reaction (PCR). Traditional cell block preparation techniques have mostly been applied to non-gynecologic cytology specimens, typically for body fluid effusions and fine needle aspiration biopsies.
Liquid based cervicovaginal specimens are relatively less cellular than their non-gynecologic counterparts with many individual scattered cells. Because of this, adequate cellularity within the cell block sections is difficult to achieve. In addition, the histotechnologist sectioning the block cannot visualize the level at which the cells are at the highest concentration. Therefore, it is difficult to monitor the appropriate level at which sections can be selected to be transferred to the glass slides for testing. As a result, the area of the cell block with the cells of interest may be missed, either by cutting past or not cutting deep enough. Current protocol for Shidham's method addresses these issues. Although this protocol is standardized and reported for gynecologic liquid based cytology specimens, it can also be applied to non-gynecologic specimens such as effusion fluids, FNA, brushings, cyst contents etc for improved quality of diagnostic material in cell block sections.

Shidham's method for preparation of cell blocks with AV-marker from cytology specimens containing individually scattered cells and small cell groups.

개별적으로 흩어져 셀의 우위와 세포학 표본에서 셀 블록 준비

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

항체 라벨링에 대한 Drosophila Polytene의 염색체 Squashes의 준비

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

배양 된 포유 동물 세포에서 대규모 병렬 리포터 분석 실험

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

식물에서 물고기에 적합한 빠른 공기 건조 떨어 뜨리 염색체 제조 방법

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

Meiotic 염색체의 준비에서 마우스 Spermatocytes 확산

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...