H.C. 개념과 Z. Q. F.; 조사, H. C., 제이 C, 그리고 Z. Q. F; 리소스, Z. Q. F.; 쓰기-원래 초안, I. A. P.; 쓰기-검토 및 편집, I. A. P., J. C., H. C., S. L. T. 그리고 Z. Q. F.; 시각화, H. C.; 감독, Z. Q. F.; 자금 수집, Z. Q. F와 F. Q. l.
사우스 캐롤라이나 개선 교사 품질 등 교육 상태 부여 라는 프로젝트, 강화 중간 학년 과학 교사 ' 지식 공장 과정, 구조 및 기능을 통해 참여 식물 과학 연구 (공장에서 과학)
미국 Sates의 교육부 (CFDA 번호 84.367B)에 의해 수 여 하는 자금
게놈 DNA 샘플 제공에 대 한 플로리다의 대학 박사 Nian 왕 감사 하 고 싶습니다 저자에서 감염 감귤 나무 발렌시아.

1. 격리 Genomic DNA 게놈 추출 키트를 사용 하 여 식물 조직에서
<ol><li>감귤 류의 잎 조직이 절단 전체 신선한 깨끗 한가 위를 사용 하 여 감귤 나무에서 잎 그리고 깨끗 한 플라스틱 샌드위치 봉지에 잎을 배치 하 여 얻을. 참고: 잎 조직이 포함 된 가방 두어야 한다 또는 절연된 용기에 얼음에 4 ° C 냉장고에 변질을 피하기 위해 컬렉션 후 가능한 한 빨리.</li>
	<li>박격포와 유 봉 진정 액체 질소의 작은 금액을 추가 합니다. 그들은 재미는 하는 동안 잎 조직, 약 1 평방 인치 크기에서의 작은 조각을 잘라가 위를 사용 합니다. 장소는 박격포에서 컷된 조직 즉시 동결. 필요한 경우 더 많은 액체 질소를 추가 합니다. 참고: 절연된 장갑 항상 액체 질소를 처리 하는 동안 착용 한다.</li>
	<li>신속 하 게 박격포를 사용 하 여 정밀한 분말으로 식물 조직을 갈아. 액체 질소가 완전히 증발 하 고 좋은 녹색 분말 남아 때까지 연 삭 계속.</li>
	<li>짧게 진정에 대 한 10-15, 액체 질소에 금속 주걱 다음 주걱을 사용 하 여 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 박격포 내부 지상 조직 특 종.</li>
	<li>핵 세포 솔루션의 600 µ L 추가 (참조 테이블의 재료)를 사용 하 여 1000 µ L 플라스틱 및 소용돌이 1-3 s에 대 한 샘플 다음 15 분 동안 65 ° C 물 욕조에 품 어.</li>
	<li>그것을 혼합 하 여 15 분 동안 캐비닛 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어 튜브 2-5 번 반전, lysate 10µL 피 펫 사용을 RNase 솔루션의 3 µ L를 추가 합니다. 참고: 계속 하기 전에 실내 온도에 냉각 하는 혼합물을 허용 한다.</li>
	<li>회사 펠 릿 형태로 13000 x g에 단백질 강 수 솔루션, 고속 20 s, 다음 3 분 동안 원심 분리기에서 소용돌이의 200 µ L를 추가 합니다. 샘플은 centrifuged 되 고, 하는 동안 신선한 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 실 온 소 프로 파 놀의 600 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>1000 µ L 피 펫을 사용 하 여, 조심 스럽게 소 프로 파 놀을 포함 하는 신선한 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 전송 하는 centrifuged 샘플에서는 상쾌한 제거. 펠 릿 지금 삭제 수 있습니다. 참고: 펠 릿 위에 상쾌한의 조금만 금액을 남겨 두어서 단백질으로 상쾌한을 오염 하지 마십시오.</li>
	<li>DNA 가닥 스레드-처럼의 질량으로 표시 될 때까지 튜브를 반전 한 다음 실 온에서 1 분 13000 x g에서 원심.</li>
	<li>상쾌한 가만히 따르다, 펠 릿을 70% 에탄올의 600 µ L를 추가, 여러 번 세척 하는 DNA 고 1 분 13000 x g에서 원심 튜브를 반전.</li>
	<li>조심 스럽게 발음 에탄올, 느슨한 DNA 펠 릿을 떠나 다음 열고 관, 흡수 성 종이 반전. 15 분 동안 실 온에서 건조 공기.</li>
	<li>튜브를 활용 하 여 주기적으로 혼합 하는 동안 1 시간에 대 한 65 ° C 물 욕조에 DNA를 품 어 다음 말린된 DNA 펠 릿을 DNA Rehydration 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>Microcuvette에 순화 된 물의 1 µ L을 놓고 빈으로 사용할 분 광 광도 계에 그것을 삽입 합니다. Microcuvette에 1 µ L의 샘플을 배치 하는 분 광 광도 계에 삽입 하 여 현재의 DNA의 농도 계산 합니다. DNA 농도 (ng / µ L) × (260-320)로 계산 된 희석 요소 × 50 ng / µ L를 될 수 있습니다. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 샘플 4 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
</ol>2. Genomic DNA 견본에 PCR을 수행 합니다.
<ol><li>결합 10 µ L 2 x PCR 마스터 믹스 ( 재료의 표참조), 1 µ L 앞으로 뇌관 (10 오후 / µ L), 1 µ L 반전 뇌관 (10 오후 / µ L) (뇌관 순서 표 2 참조), 100 게놈 DNA의 ng는 샘플에서 추출 하 고 물 (최대 20 µ L 최종 볼륨)에서 정화 한 50 µ L PCR 튜브, 혼합, 영화와 짧게 원심 분리기.</li>
	<li>thermocycler에 PCR 튜브를 삽입 하 고 적절 하 게 실행 ( 표 1참조). 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 필요한 경우, 반응이 완료 된 후 4 ° C에서 예제를 저장 합니다.</li>
</ol>3. electrophorese는 Agarose 젤에 증폭 된 DNA
<ol><li>그리고 무게 0.4 g agarose 분말 1 x TAE 버퍼 함께 깨끗 한 200 mL 삼각 플라스 크, 최대 50 mL 작성에 추가할.</li>
	<li>모든 30 떨고 1.5 분 높은 전자 렌지 s, agarose는 완전히 녹아 때까지. 참고: 절연된 장갑 화상을 방지 하기 위해 액체 agarose를 처리 하는 동안 착용 한다.</li>
	<li>레벨 젤 금형에 액체 agarose 젤을 부 어 다음 액체 agarose를 흔들어 혼합, 10 mg/mL ethidium 평범한 사람의 2.5 µ L를 추가 합니다. 신속 하 게 붓는 후 표준 12-치아 젤 빗을 삽입 합니다.</li>
	<li>실 온에서 20 분을 기다린 다음 제거 젤 빗, 젤 허용 고 젤 수준 젤 상자 1 x TAE 버퍼 가득 합니다.</li>
	<li>웰 스에 총 증폭된 DNA 샘플을 로드 하는 micropipette를 사용 하 여. DNA의 5 µ L 사다리 ( 재료의 표참조)을 샘플에서 별도 잘에서 추가 합니다.</li>
	<li>35 분 90, 상수에 대 한 샘플을 electrophorese 다음 젤을 제거 하 고 UV transilluminator에.</li>
	<li>사진 하 고 302에서 UV transillumination를 사용 하는 동안 패턴 밴딩 젤 분석 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Field Office, F. lorida <a target="_blank" href="http://citrusindustry.net/wp-content/uploads/2016/10/cit1016.pdf">Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size</a>. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).</li>
<li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/2aa9/2db973c8f73893a0799ef82cb8883821127b.pdf">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).</li>
<li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="https://conference.ifas.ufl.edu/citrus12/PDF%20Presentations/Fri-pdf/1045%20Spreen.pdf">The economic impact of HLB on the florida citrus industry</a>. , University of Florida. (2012).</li>
<li>UICEP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pathology%22">Pathology</a>. , (2013).</li>
<li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li>
<li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+%28huanglongbing%29+bacterium+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li>
<li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PDIS-92-11-1547">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li>
<li>Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="https://www.cacitrusmutual.com/wp-content/uploads/2015/12/2015-USDA-Citrus-Fruits-Summary.pdf">Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015)</a>. , (2015).</li>
<li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+%CE%B2+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li>
<li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263(2012).</li>
<li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li>
</ol>

Huan 첸,이 안 아서 팔 머, Jian 첸, 명 장, 스티븐 L. 톰슨, Fengquan Liu와 청 청 푸 관심 없음 충돌 선언합니다.

그것은 중요 한 최적의 실험 조건 달성 하기 위해 정확 하 게 모든 단계는 따 랐 다입니다. 전체 잎 조직;이 데모 중에 사용 된 그러나, 이론적으로 식물 조직의 모든 종류를 포함 하는 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 이전, 연구 전체 잎 조직, 보다는 오히려 잎 정 맥 조직이, genomic DNA를 추출 있고 비슷한 결과11를 달성. 감귤 류의 FBOX 유전자에 해당 하는 밴드를 하지 못하?...

감귤 류 녹화, 일컬어 huanglongbing, 감귤 나무의 상당한 손실이 발생 했습니다. 한 대표적인 케이스는 플로리다, 질병을 70% 감소를 플로리다 오렌지 박스의 생산에 244 백만 상자에서 1997-1998 시즌에 2016-2017 시즌1월 70 백만 상자 전망 이다. 플로리다에서 감귤 나무의 90% 이상 감염된2, 고 플로리다 감귤 산업 손실 약 1 십억 달러 감귤 류 녹화3중요 한 역할 담당 하는 점에서 감귤 류의 질병으로 인해 매년 추정 된다. 감귤 류 녹화 침략 적 아시아 감귤 류 psyllid Diaphorina citri 에 의해 주로 전염 됩니다 그러나 또한 감염 된 조직. 의 접목 하 여 확산 될 수 있습니다. 질병 정 맥, 비대칭 노란 잎 mottling, 조 defoliation, 나뭇가지 dieback, 루트 부패 및 식물의 죽음의 황 변 발생 합니다. 중요 한 것은, 질병 거의 과일을 생산 하는 시즌에서 꽃을 생산 하는 감귤 류 식물을 발생 합니다. 감염 된 감귤 류 식물에 의해 생산 되는 과일은 미 숙, 녹색, 및 쓴 맛4.
이 방법의 목적은 정확 하 게 하는 것입니다 하 고 정확 하 게 운동 박테리아 Candidatus liberibacter 종, 감귤 류 녹화, 감염 된 감귤 나무5의 체 관 부 내 생활의 원인이 되는 에이전트를 식별 합니다. 게놈 DNA는 살아있는 박테리아를 포함 하는 전체 잎 조직에서 추출 됩니다. 이 추출 된 게놈 DNA oligonucleotides 세균의 16S rDNA 시퀀스에 보완를이 순서를 증폭 하는 데 사용 됩니다 기존의 PCR에 대 한 템플릿으로 사용 됩니다. 감귤 류의 FBOX 유전자 보완 oligonucleotides 내부 증폭 컨트롤로 사용 됩니다. 우리는 이전 연구6에서 성공 하려면 입증 되었습니다 때문에이 방법을 사용 하 여 선택 했습니다.
이 메서드는 간단 하 고, 상대적으로 저렴 한, 어떤 일반적으로 갖춘된 생화학 실험실에서 수행할 수 있는 명확한 이점이 있다. 또한, PCR이 병원 체7, 그리고 생존과 이내 asymptomatic 호스트8년 재현 병원 체의 능력 배양의 어려움으로 인해이 병원 체를 탐지 하기 위한 가장 정확 하 고 정확한 방법에 남아 있다. 많은 다른 전문 PCR 분석 실험 성공적으로;이 병원 체를 검출 하는 데 사용 되었습니다. 그러나, 기존의 PCR 무 증상 호스트8내 특히 정확 하 고 특정 검색에 대 한 간단한 분석 결과 남아 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td>Air Products</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler pro with control panel</td><td>Eppendorf</td><td>6321000019</td><td></td></tr><tr><td>1250 W Microwave</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5424 table top centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-93</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 digital water bath</td><td>Fisher scientific</td><td>15-462-15Q</td><td></td></tr><tr><td>Metal spatula</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z283274</td><td></td></tr><tr><td>Mortar and pestle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247464</td><td></td></tr><tr><td>LSE Vortex Mixer</td><td>Corning</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 10 &amp;mu;L tips</td><td>TipOne</td><td>1161-3730</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 200 &amp;mu;L tips</td><td>TipOne</td><td>1163-1730</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1250 &amp;mu;L tips</td><td>TipOne</td><td>1161-1750</td><td></td></tr><tr><td>Variable Volume Pipettor Kit</td><td>VWR</td><td>75788-460</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70041</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17892</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;cuvette</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td></td></tr><tr><td>Stackable casting tray and combs</td><td>Carolina</td><td>213655</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT System</td><td>Bio-Rad</td><td>1704487EDU</td><td></td></tr><tr><td>Biospectrometer basic</td><td>Eppendorf</td><td>6135000009</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tubes</td><td>Fisher scientific</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3439</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Green PCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Water, PCR grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3315953001</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc XR+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>1 KB+ DNA ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td></td></tr></tbody></table>

specific and accurate detection of the citrus greening pathogen candidatus liberibacter spp. using conventional pcr on citrus leaf tissue samples

감귤 류 녹화, 일컬어 huanglongbing, 세계적으로 감귤 류 농장을 ravaging 파괴적인 감귤 류의 질병 이다. 이 질병 원인과 비대칭 노란 잎 mottling, 정 맥 yellowing, defoliation, 루트 부패, 궁극적으로, 감귤 류 식물의 죽음. 감염, 감귤 류 식물 성장 저하는 고 시즌에서 꽃을 생산. 이 꽃 거의 항복 과일, 그리고 그 작은, 쓴, 불규칙 모양의 감귤 항복 할 바람직하지 않다. 이 질병은 감염 된 감귤 직물의 접목 하 여 아시아 감귤 류 psyllid, Diaphorina citri에 의해 확산. 병원 체는 감귤 류 식물 내에서 길고 가변 인큐베이션 기간-가끔 년 전에 증상이 나타납니다. 이 병원 균에서 체 외에서 배양 하려고 낮은으로 인해 성공 했습니다 하 고 내 병원 체의 고르지 못한 농도 감귤 류 조직, 감염 또는 환경 복제 하기 어렵기 때문에 조건의 성장에 도움이 병원 체입니다. 전에 그것은, 그것의 긴 잠복기와 병원 체 문화 연구원 못하는 질병을 식별 하기 위해 매우 어렵습니다. 그 결과, 질병만 된다 명백한 후 갑자기 감귤 류의 농부의 전체 수율을 파괴. 여기에 제시 된 감귤 류 녹화 병원 체, 게놈 DNA 추출 키트 및 PCR를 사용 하 여 Candidatus liberibacter 종의 정확 하 고 구체적인 검색 방법이입니다. 이 메서드는 간단 하 고, 효율적, 비용 효과, 고 정량 분석에 대 한 적응. 이 메서드는 모든 감귤 류의 조직;에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 잠재적으로 조직에 병원 체의 양에 의해 제한 됩니다. 그럼에도 불구 하 고,이 메서드 이전, 감염 된 감귤 류 식물을 식별 하는 감귤 류의 농민을 허용 하 고 더욱 확산 될 수 있습니다 전에이 파괴적인 질병의 확산을 억제.

긍정적인 결과 수익률 500 해당 고유 밴드 Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, 및/또는 독특한 밴드 700 해당 bp bp Laa2/Laj5, 16S ribosomal β에 삽입에 대 한 오 페론9. 내부 증폭 제어 밴드 또한 400에 표시 되어야 합니다 혈압. 이 밴드는 감귤 류의 FBOX 유전자10, 증폭에 해당 하며 유효 하기 결과...

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Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

감귤 류 녹화는 세계적으로 감귤 류 작물에 영향을 미치는 특히 파괴적인 질병 이다. 여기에 제시 된 간단한 방법을 사용 하는 PCR 및 감귤 잎 조직이의 게놈 DNA 추출 감귤 류 녹화 병원 체, Candidatus liberibacter 종의 정확 하 고 정확한 식별에 대 한

특정 및 감귤 류 녹화 병원 체 Candidatus liberibacter 종 감귤 잎 조직 샘플에서 사용 하 여 기존의 PCR의 정확한 검출

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

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Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

7.6K 조회수.  University of South Carolina. 감귤 류 녹화는 세계적으로 감귤 류 작물에 영향을 미치는 특히 파괴적인 질병 이다. 여기에 제시 된 간단한 방법을 사용 하는 PCR 및 감귤 잎 조직이의 게놈 DNA 추출 감귤 류 녹화 병원 체, Candidatus liberibacter 종의 정확 하 고 정확한 식별에 대 한

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Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of agricultural waters. Here, water is filtered through sterile Modified Moore Swabs (MMS), which consist&#160;of a simple gauze filter enclosed in a plastic cartridge, to concentrate bacteria. Following filtration, non-selective or selective enrichments for the target bacteria are performed in the MMS. For colorimetric detection of the target bacteria, the enrichments are then assayed using paper-based analytical devices (&#181;PADs) embedded with bacteria-indicative substrates. Each substrate reacts with target-indicative bacterial enzymes, generating colored products that can be detected visually (qualitative detection) on the &#181;PAD. Alternatively, digital images of the reacted &#181;PADs can be generated with common scanning or photographic devices and analyzed using ImageJ software, allowing for more objective and standardized interpretation of results. Although the biochemical screening procedures are designed to identify the aforementioned bacterial pathogens, in some cases enzymes produced by background microbiota or the degradation of the colorimetric substrates may produce a false positive. Therefore, confirmation using a more discriminatory diagnostic is needed. Nonetheless, this bacterial concentration and detection platform is inexpensive, sensitive (0.1 CFU/ml detection limit), easy to perform, and rapid (concentration, enrichment, and detection are performed within approximately 24&#160;hr), justifying its use as an initial screening method for the microbiological quality of agricultural water.

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (&#181;PAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

색도계 탐지의 종이 기반의<em&gt; 대장균</em&gt;<em&gt; 살모넬라</em&gt; SPP., 그리고<em&gt; 리스테리아</em&gt; 농업 다량의 물에서

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

연구

환경과학

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

동시 정량을위한 이중 디지털 PCR 분석<em&gt; 엔테로 종.</em&gt;과 바다에서 인간 방패 관련 HF183 마커

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management strategies that reduce the impact of the disease. Presently in many diagnostic laboratories, the polymerase chain reaction (PCR), particularly real-time PCR, is considered the most sensitive and accurate method for plant pathogen detection. However, laboratory-based PCRs typically require expensive laboratory equipment and skilled personnel. In this study, soil-borne pathogens of potato are used to demonstrate the potential for on-site molecular detection. This was achieved using a rapid and simple protocol comprising of magnetic bead-based nucleic acid extraction, portable real-time PCR (fluorogenic probe-based assay). The portable real-time PCR approach compared favorably with a laboratory-based system, detecting as few as 100 copies of DNA from Spongospora subterranea. The portable real-time PCR method developed here can serve as an alternative to laboratory-based approaches and a useful on-site tool for pathogen diagnosis.

Rapid and accurate detection of plant pathogens on-site, especially soil-borne pathogens, is crucial to prevent further inoculum production and proliferation of plant diseases in the field. The method developed here using a portable real-time PCR detection system enables on-site diagnosis under field conditions.

휴대용 실시간 PCR 시스템을 사용 하 여 토양 품 어진 Phytopathogens의 현장 분자 검출

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran insects account for a number of economically substantial pests of plants that cause damage to crops by feeding on phloem sap. The brown marmorated stink bug (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) and the Asian citrus psyllid (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) are hemipteran insect pests introduced in North America, where they are an invasive agricultural pest of high-value specialty, row, and staple crops and citrus fruits, as well as a nuisance pest when they aggregate indoors. Insecticide resistance in many species has led to the development of alternate methods of pest management strategies. Double-stranded RNA (dsRNA)-mediated RNA interference (RNAi) is a gene silencing mechanism for functional genomic studies that has potential applications as a tool for the management of insect pests. Exogenously synthesized dsRNA or small interfering RNA (siRNA) can trigger highly efficient gene silencing through the degradation of endogenous RNA, which is homologous to that presented. Effective and environmental use of RNAi as molecular biopesticides for biocontrol of hemipteran insects requires the in vivo delivery of dsRNAs through feeding. Here we demonstrate methods for delivery of dsRNA to insects: loading of dsRNA into green beans by immersion, and absorbing of gene-specific dsRNA with oral delivery through ingestion. We have also outlined non-transgenic plant delivery approaches using foliar sprays, root drench, trunk injections as well as clay granules, all of which may be essential for sustained release of dsRNA. Efficient delivery by orally ingested dsRNA was confirmed as an effective dosage to induce a significant decrease in expression of targeted genes, such as juvenile hormone acid O-methyltransferase (JHAMT) and vitellogenin (Vg). These innovative methods represent strategies for delivery of dsRNA to use in crop protection and overcome environmental challenges for pest management.

This article demonstrates novel techniques developed for oral delivery of double-stranded RNA (dsRNA) through the vascular tissues of plants for RNA interference (RNAi) in phloem sap feeding insects.

체 관 부 식물 수액 공급 Hemipteran 곤충에 RNA 간섭을 유도 하 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in vegetable production annually. Phytophthora capsici is soil-borne and a persistent problem in vegetable fields due to its long-lived survival structures (oospores and chlamydospores) that resist weathering and degradation. The main method of dispersal is through the production of zoospores, which are single-celled, flagellated spores that can swim through thin films of water present on surfaces or in water-filled soil pores and can accumulate in puddles and ponds. Therefore, irrigation ponds can be a source of the pathogen and initial points of disease outbreaks. Detection of P. capsici in irrigation water is difficult using traditional culture-based methods because other microorganisms present in the environment, such as Pythium spp., usually overgrow P. capsici making it undetectable. To determine the presence of P. capsici spores in water sources (irrigation water, runoff, etc.), we developed a hand pump-based filter paper (8-10 &#181;m) method that captures the pathogen&#8217;s spores (zoospores) and is later used to amplify the pathogen&#8217;s DNA through a novel loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay designed for the specific amplification of P. capsici. This method can amplify and detect DNA from a concentration as low as 1.2 x 102 zoospores/mL, which is 40 times more sensitive than conventional PCR. No cross-amplification was obtained when testing closely related species. LAMP was also performed using a colorimetric LAMP master mix dye, displaying results that could be read with the naked eye for on-site rapid detection. This protocol could be adapted to other pathogens that reside, accumulate, or are dispersed via contaminated irrigation systems.

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

We developed a method to detect Phytophthora capsici zoospores in water sources using a filter paper DNA extraction method coupled with a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay that can be analyzed in the field or in the lab.

루프 매개 이소르말 증폭을 사용하여 관개물에서 피토프토라 캡시 검출

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

면역학 및 감염병학

Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering

Graft-transmissible, phloem-limited pathogens of citrus such as viruses, viroids, and bacteria are responsible for devastating epidemics and serious economic losses worldwide. For example, the citrus tristeza virus killed over 100 million citrus trees globally, while &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; has cost Florida $9 billion. The use of pathogen-tested citrus budwood for tree propagation is key for the management of such pathogens. The Citrus Clonal Protection Program (CCPP) at the University of California, Riverside, uses polymerase chain reaction (PCR) assays to test thousands of samples from citrus budwood source trees every year to protect California&#39;s citrus and to provide clean propagation units to the National Clean Plant Network. A severe bottleneck in the high-throughput molecular detection of citrus viruses and viroids is the plant tissue processing step.
Proper tissue preparation is critical for the extraction of quality nucleic acids and downstream use in PCR assays. Plant tissue chopping, weighing, freeze-drying, grinding, and centrifugation at low temperatures to avoid nucleic acid degradation is time-intensive and labor-intensive and requires expensive and specialized laboratory equipment. This paper presents the validation of a specialized instrument engineered to rapidly process phloem-rich bark tissues from citrus budwood, named the budwood tissue extractor (BTE). The BTE increases sample throughput by 100% compared to current methods. In addition, it decreases labor and the cost of equipment. In this work, the BTE samples had a DNA yield (80.25 ng/&#181;L) that was comparable with the CCPP&#39;s hand-chopping protocol (77.84 ng/&#181;L). This instrument and the rapid plant tissue processing protocol can benefit several citrus diagnostic laboratories and programs in California and become a model system for tissue processing for other woody perennial crops worldwide.

We engineered, fabricated, and validated an instrument that rapidly processes phloem-rich bark citrus budwood tissues. Compared to current methods, the budwood tissue extractor (BTE) has increased sample throughput and decreased the required labor and equipment costs.

기기 엔지니어링을 통한 다운스트림 병원균 검출을 위한 Citrus Budwood 가공 자동화

Graft-transmissible, phloem-limited pathogens of citrus such as viruses, viroids, and bacteria are responsible for devastating epidemics and serious ...

생체공학

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A simple method for rapid and portable Huanglongbing (HLB) diagnosis is presented here that combines recombinase polymerase amplification and a fluorescent reporter utilizing the nuclease activity of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a) system. The sensitivity of this technique is much higher than PCR. Furthermore, this method showed similar results to qPCR when leaf samples were used. Compared with conventional CLas detection methods, the detection method presented here can be completed in 90 min and works in an isothermal condition that does not require the use of PCR machines. In addition, the results can be visualized through a handheld fluorescent detection device in the field.

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

In this work, a rapid, sensitive, and portable detection method for Candidatus Liberibacter asiaticus based on recombinase polymerase amplification combined with CRISPR-Cas12a was developed.

CRISPR-Cas12a와 결합된 재조합 중합효소 증폭을 사용한 현장 배치 가능 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 검출

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

생물학

Direct Infusion Device를 사용한 식물의 분자 전달

Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but have drawbacks, including variable uptake and the environmental breakdown of tested molecules. Trunk injection of trees is well-established, but most methods for this require expensive, proprietary equipment. To screen various treatments for Huanglongbing, a simple, low-cost method to deliver these compounds to the vascular tissue of small greenhouse-grown citrus trees infected with the phloem-limited bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) or infested with the phloem-feeding CLas insect vector Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) is needed.
To meet these screening requirements, a direct plant infusion (DPI) device was designed that connects to the plant&#39;s trunk. The device is made using a nylon-based 3D-printing system and easily obtainable auxiliary components. The compound uptake efficacy of this device was tested in citrus plants using the fluorescent marker 5,6-carboxyfluorescein-diacetate. Uniform compound distribution of the marker throughout the plants was routinely observed.
Furthermore, this device was used to deliver antimicrobial and insecticidal molecules to determine their effects on CLas and D. citri respectively. The aminoglycoside antibiotic streptomycin was delivered into CLas-infected citrus plants using the device, which resulted in a reduction in the CLas titer from 2 weeks to 4 weeks post treatment. Delivering the neonicotinoid insecticide imidacloprid into D. citri-infested citrus plants resulted in a significant increase in psyllid mortality after 7 days. These results suggest that this DPI device represents a useful system for delivering molecules into plants for&#160;testing and facilitate research and screening purposes.

저자 스포트라이트: 식물의 분자 전달을 위한 직접 주입 장치  

This manuscript describes a novel direct plant infusion device for screening the effectiveness of molecules against the bacteria (Candidatus Liberibacter asiaticus) or its insect vector (Diaphorina citri, Kuwayama) that, in combination, are associated with Huanglongbing citrus disease.

식물의 분자 전달을 위한 직접 주입 장치

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but ...

특정 및 감귤 류 녹화 병원 체 Candidatus liberibacter 종 감귤 잎 조직 샘플에서 사용 하 여 기존의 PCR의 정확한 검출

요약

더 많은 비디오 탐색

색도계 탐지의 종이 기반의

동시 정량을위한 이중 디지털 PCR 분석

휴대용 실시간 PCR 시스템을 사용 하 여 토양 품 어진 Phytopathogens의 현장 분자 검출

체 관 부 식물 수액 공급 Hemipteran 곤충에 RNA 간섭을 유도 하 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법

루프 매개 이소르말 증폭을 사용하여 관개물에서 피토프토라 캡시 검출

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석

기기 엔지니어링을 통한 다운스트림 병원균 검출을 위한 Citrus Budwood 가공 자동화

CRISPR-Cas12a와 결합된 재조합 중합효소 증폭을 사용한 현장 배치 가능 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 검출

식물의 분자 전달을 위한 직접 주입 장치

식물의 분자 전달을 위한 직접 주입 장치