이 공동 번역 상 연구 보조금 샌디에고 C3 박찬호 페달에 의해 자금 원인 (#PTC2017) 작동 RRW 지원을 받고 있다.

모든 동물 실험 수행 다음이이 프로토콜 각 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인을 받아야 한다. 여기에서 설명한 모든 절차는 IACUC UCSD에 의해 승인 되었습니다.
1. 조달 받는 동물
참고: KPC 뤽 4580 셀 라인 LSL Kra에서 발생 하는 종양에서 설립 되었다G12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL ROSA26 루크 / + 마우스 (KPC), C57BL/6 배경에 PC의 유전자 조작된 모델입니다. 이 셀 라인의 장점은 그것 constitutively orthotopic 모델에서 종양 모니터링 luciferase 활성화 표현 한다입니다. 그러나, 다른 셀 라인으로 그들은 받는 사람 쥐의 유전 배경와 호환 사용할 수도 있습니다.
<ol><li>사전에 실험 그룹 및 그룹 당 동물의 수를 결정 합니다.</li>
	<li>나이 (6-10 주 오래 된 마우스 권장)을 선택 하 고 섹스 가설 및 셀 선 사용 되는 동물의 사용.</li>
</ol>2. 문화 셀
<ol><li>사용 Dulbecco의 독수리 매체 (DMEM)을 수정: 영양소 혼합 F12 (50: 50) 미디어 KPC 뤽 4580 세포 성장 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% 페니실린 스 항생제 (완전 한 성장 매체).</li>
	<li>동결, 해빙 세포 종양 이식 전에 4 일.</li>
	<li>무 균 조건 하에서 5% CO2 와 95% 습도 37 ° C에서 세포 성장.</li>
	<li>0.25% 셀 trypsinize 37 ° c를 도달 하기 전에 5 분 동안 트립 신 > 80 %confluency 트립 신 완전 한 성장 매체의 볼륨을 두 번 추가 하 여 무력화. 참고: 이러한 셀 할 설정 하지 종양 효율적으로 쥐에 그들은 100 %confluency 사용 하는 경우 또는 그들은 이상 12 회에 대 한 passaged는 경우. 따라서, 그것은 최적의 confluency에서 이전 구절에서 세포를 고정 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 적절 한 숫자는 존재 하는 경우 종양 유도를 진행 (0.5-1 x 106 셀/마우스). 그렇지 않은 경우에 적절 한 세포 수는 때까지 한 더 많은 통로 대 한 셀을 확장.</li>
</ol>3입니다. 평방 종양의 유도
<ol><li>필요한 재료 준비: P1000 및 P100 펫, 팁, 1 mL 주사기 25 G 바늘, 지하실 멤브레인 매트릭스 (BMM) DMEM 기저 미디어, 1.5 mL 튜브 원심. 프로시저의 끝까지 모든 재료 살 균과 감기 (4 ° C)를 유지. 또한 발기를 유지 하 고 알코올 면봉 동물 사용에 대 한 준비.</li>
	<li>Trypsinize (에 의하여 2.4 단계) 하 고 셀, 2 배속 감기 DMEM의 107 셀/mL의 농도에서 그들을 resuspend.</li>
	<li>100%의 동일한 볼륨을 추가 50%에서 최종 세포 현 탁 액을 만들기 위해 BMM BMM. 마지막 볼륨 세포 현 탁 액 요구 각 마우스의 50 µ L를 도달 해야 한다. 주사기에 pipetting 오류에 대 한 죽은 공간에 맞게 초과에서 10%를 준비 합니다.</li>
	<li>Aliquot 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 550 µ L 볼륨에 정지 얼음에 배치.</li>
	<li>동물 (6 주 오래 된 남성 C57BL/6 쥐)는 restrainer를 사용 하 여 억제 또는 수동으로. 참고: 또는, 쥐 수 수 anaesthetized 2.5 %isoflurane 정밀 기화 기를 사용 하 여 2 L/min의 유량에서 산소 가스에서와 함께.</li>
	<li>면도 선호 다리 위에 측면에 사용 하는 어 선 주사의 사이트. 알코올 면봉을 사용 하 여 두 번 주사의 사이트를 청소.</li>
	<li>감기 1 mL 주사기에 107 셀/mL x 1-2의 최종 농도에 세포 현 탁 액의 250 µ L 그리고 피스톤을 아래로 이동 하 여 모든 기포를 제거. 주사기에 25g 바늘을 연결 하 고 바늘 내 공간을 채우기 위해 확인 한다.</li>
	<li>조심 스럽게 옆구리, 복 막 구멍 또는 사지의 근육 바늘 피어스 하지 않습니다 확인 하 고 근처 시체에 30 ° 각도로 피부 밑에 바늘을 삽입 합니다.</li>
	<li>평행 본문, 바늘을 평평 하 게 피부에 주름을 평평 하 게. 세포 현 탁 액의 50 µ L를 천천히 주사. 10에 대 한 주입의 위치에 바늘을 잡고 어떤 누설을 방지 하기 위해 응고 BMM 있도록 s.</li>
	<li>천천히 그것을 유지 하는 어떤 측면 운동 없이 병렬 바늘 철회. 부드럽게 알코올 면봉과 주사의 사이트를 청소 하 고 그 주택에 마우스를 놓습니다. 참고: 마우스는 절차 동안 마 취를 하는 경우 그것은 righting 반사를 차릴 때까지 동물을 모니터링 합니다.</li>
	<li>직경에서 5mm를 도달할 때까지 정기적으로 캘리퍼스를 사용 하 여 종양의 성장을 모니터링 합니다.</li>
</ol>4입니다. 유도 Orthotopic 종양의
<ol><li>필요한 재료를 준비 합니다. 오토 클레이 브는 수술 도구 등 지적 scalpels, 바늘 드라이버가 위 및 평면 밀고 집게. 편리한 무 균 봉합 (흡수 6-0 및 비 흡수 4-0), 알코올 면봉, 헤어 클리퍼 스, depilatory 크림, 눈 윤 활 유, 면화 거 즈, 10 %povidone 요오드 솔루션, 수술 커튼, 난방 패드, buprenorphine, 및 마 취 에이전트 유지.</li>
	<li>(되도록이면 같은 배경 orthotopic 모델에 필요한)의 기증자 마우스를 안락사 느린 채우기 CO2 챔버를 사용 하 여 SQ KPC 종양을 들고. 소독 집게와 곧 orthotopic 이식 전에 microscissors를 사용 하 여 BSL-2 후드에서 무 균 조건 하에서 신중 하 게 평방 종양 삭제하시오 종양 절제 동안 복 막 구멍 찌를 세척 살 균 PBS의 2 교류와 즉시 종양을 주의.</li>
	<li>살 균 scalpels를 사용 하 여 1 m m3 조각으로 삭제 종양을 말하다, 그들 감기 균 DMEM 기저 미디어를 포함 하는 배양 접시에 놓고 이식까지 얼음에 저장.</li>
	<li>관리 받는 사람 마우스 0.05-1 mg/kg buprenorphine 진통제 SQ, 수술 전에 30 분.</li>
	<li>정밀 기화 기 (또는 다른 마 취 에이전트)를 사용 하 여 산소 (2 L/min)에서 2-3 %isoflurane 받는 사람 마우스 anesthetize 프로시저의 전체에 대 한 패드를가 열 하는 37 ° C에 마우스를 유지. 건조를 방지 하기 위해 눈에 윤활제를 적용 합니다. 놀라운 반사 처음의 부족에 의해 마 취의 깊이 테스트 하 고 부드러운 발가락 핀치에 페달 반사의 부족에 의해 외과 비행기 마 취를 확인 합니다. 전체 수술 중 마 취를 유지 합니다.</li>
	<li>그것의 뒤에 마우스를 놓고 부드럽게 복 부의 왼쪽 노출 되도록 그것의 오른쪽으로 설정 합니다. Depilatory 크림을 사용 하 여 마우스의 복 부를 제거 하 고 무료로 머리카락 복 부 게시물 절 개 입력 되도록 거 즈로 청소. 피부 소독에 알코올 잎사귀 뒤 10 %povidone 요오드의 3 주기를 사용 하 여 수술에 대 한 왼쪽된 복 부를 준비 합니다.</li>
	<li>살 균 메스를 사용 하 여 만들 1.5 c m 가로 또는 경사 절 개 피부, 흉 곽, 아래 중간의 왼쪽에 1 cm에서에서 비장을 약간 중간. 그런 다음, 복 부 근육, 미러링 overlying 표면 절 개를 통해 절 개를 확장 합니다.</li>
	<li>평면을 사용 하 여 비장 집게를 밀고 찾아서 부드럽게 복 부 구멍에서 그것을 외부화. 메 마른 면 주걱을 사용 하 여 비장을 철회 하 고 비장의 하단에 부착 된 췌 장의 꼬리를 찾을.</li>
	<li>평면 밀고 집게를 사용 하 여, 췌 장의 꼬리 옆으로 철회.</li>
	<li>소독 집게를 사용 하 여 위치를 벌금 (6-0) 살 균 suturing 바늘의 팁과 기증자 마우스에서 하나의 잘게 다진된 종양 조각 들고.</li>
	<li>동안 부드럽게 췌 장의 꼬리/몸 옆으로 축소, 췌 장의 꼬리에 종양 조각 포함 된 봉합 바늘을 삽입 합니다. 천천히 들고 췌 장 꼬리를 접촉 하 여 종양 조직을 통해 봉합을 전달 합니다. 조직에 관하여 단편의 방향에 따라 하나 또는 두 개의 추가 봉합을 적용 합니다.</li>
	<li>조직에서 바늘을 완전히 제거 하 고 췌 장/비장 추가 60 externalized 계속 출혈 또는 누출의 어떤 표시 든 지를 검사 하는 동안 s. 무딘 집게를 사용 하 여 복 부 구멍으로 그들을 부드럽게 internalize 다음.</li>
	<li>복 부 근육으로 6-0 흡수 봉합 사를 사용 하 여 연속 또는 중단 스티치 닫고 overlying 피부는 3-0 6-0 비 흡수 중단된 봉합 사를 사용 하 여 닫습니다. 이 시점에서 마 취를 중단 합니다.</li>
	<li>마우스와 음식 및 물의 홈 장에 복구를 허용 합니다. 회복을 촉진 하는 생리대에 케이지를 놓습니다. 복구 프로세스 동안 관류 등, 호흡 등 생체 신호를 모니터링 합니다.</li>
	<li>일단 마우스를 복구, 그리고 다음 반환 케이지 일반 주택 수 있는 반사를 righting의 징후를 확인 합니다.</li>
	<li>Buprenorphine 0.05-0.1 mg/kg를 관리, 수술 후 8-12 h 그리고 고통의 표시를 위해 필요에 따라 절차 후 모든 8-12 h.</li>
	<li>종양의 성장은 vivo에서 생물 발광 이미징 시스템을 사용 하 여 모니터링 ( 재료의 표참조).<ol>
<li>이미징 orthotopic 이식 후 4 일에 시작 하 여 종양의 성장에 따라 고 이미징 일주일에 두 번 수행 합니다.</li>
		<li>화상의 날 (복 주입) 관리 D-소는 마 취에 30 mg/kg (산소 (2 L/min)에서 2-3 %isoflurane) 받는 사람 마우스 이미징 하기 전에 10 분.</li>
		<li>5 s 노출 자동 형광 무료 열띤된 무대와 쥐에 대 한 마 취 유지 하면서 발광 영상에서의 최소 배출 필터 없이 발광 설정을 사용 하 여 luciferase 활동에 대 한 이미지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. SQ 종양의 분노
<ol><li>필요한 재료 준비: 정사각형 웨이브 electroporator, 안전 발 스위치, 전극 (족집게 trode 대 바늘 배열), 및 어댑터. 무 균 봉합 (비 흡수 4-0), 알코올 면봉, 헤어 클리퍼 스, depilatory 크림, 눈 윤 활 유, 면화 거 즈, buprenorphine, 및 마 취약 또한 근처.</li>
	<li>족집게를 소독 하거나 살 균 가스를 사용 하 여 배열 전극 바늘. 압력가 마로 소독을 권장 하지 않습니다. 유리 구슬 소독 기를 사용 하 여 동물 사이의 전극 소독.</li>
	<li>관리 buprenorphine 0.05-0.1 mg/Kg는 종양 방위 쥐 절차 전에 30 분.</li>
	<li>단계 4.4-4.5 평방 종양 이식 5 m m 직경에 도달 하면 성공적으로 마우스 마 취를 유도 합니다.</li>
	<li>측면에 평방 종양에 액세스 하는 측면에 마 취 마우스를 놓습니다. 머리 깍 고 알코올 면봉을 사용 하 여 깨끗 한 피부를 사용 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>평방 종양 2 바늘 배열 전극 사용 하 여. 집게를 사용 하 여 종양 사이트 바로 아래 피부를 상승 하 고 복 막 구멍을 침투 하지 않는 다는 것을 확인 하는 신체에 평행 하 게 피부를 통해 전극을 삽입. 일단 피부를 통해 그들은 종양 대괄호 같은 방법으로 전극 위치.</li>
	<li>100 µs 펄스 150 펄스의 총 1500 V/cm에서 1 Hz의 주파수에 전달 하기 위해 electroporator 프로그램. 발 페달을 사용 하 여 펄스를 제공 합니다. 10 10 펄스의 각 집합을 별도 s, 방열에 대 한 허용 하 고 전극의 올바른 위치를 확인. 참고: 마비 에이전트를 사용 하지 않고 마우스는 수동으로 확보 하지 않는 한 전극의 변위를 일으킬 수 있는 분노와 근육 수축 발생 합니다.</li>
	<li>electroporator에 표시 되는 실제 전압 전달, 200 미 레코드를 초과 하지 않아야 완전 한 주입 후 전극을 제거 합니다. 수 단계 4.14-4.16 당 분노를 다음 복구 하 쥐.</li>
</ol>6입니다. Orthotopic 종양의 분노
참고: orthotopic 종양의 분노는 따라서 시작 하기 전에 현지 IACUC에서 특별 한 승인 요구 같은 마우스에 두 번째 생존 수술을 포함 한다.
<ol><li>필요한 재료 준비: 압력솥 scalpels,가 위, 바늘 드라이버, 수술 도구 겸 자, 그리고 평면 집게를 밀고. 뿐만 아니라 인근 다음 유지: 무 균 봉합 (흡수 6-0 및 비 흡수 4-0), 알코올 면봉, 헤어 클리퍼 스, depilatory 크림, 눈 윤 활 유, 면화 거 즈, 10 %povidone 요오드 솔루션, 수술 커튼, 난방 패드, 구형 파 electroporator 안전 발 스위치, 전극 및 그들의 어댑터, buprenorphine, 및 마 취약.</li>
	<li>Vivo에서 화상 진 찰에 의해 orthotopic 종양 성장 위한 쥐를 평가 (단계 4.17 참조) intraperitoneally D 소의 30 mg/kg을 주입 하 여. 참고: orthotopic 종양 종양 췌 장에 Luciferase 발광 이미지 ( 대표 결과참조)에서 볼 수 명확 하 게 표시 하 고 여전히 제한 된 때 분노 치료 8 ~ 10 일 포스트 주입에 이상적입니다.</li>
	<li>단계 4.4-4.9, 이식된 종양을 찾으려고 합니다. 종양 쉽게 찾을 하지 않으면 무딘 코 집게를 사용 하 여 위장과 비장 종양 식별을 부드럽게 이동.</li>
	<li>무딘 코 집게와 종양을 외부화 하 고 족집게 trode의 백 금 전극으로 단단히 종양. 단계 10 펄스 발 스위치에 의해 제어의 세트에서 구형 파 electroporator를 사용 하 여 5.7에서에서 프로그래밍 electroporation 펄스를 제공 합니다.</li>
	<li>적어도 60 s 게시물 출혈의 어떤 표시 든 지에 대 한 모니터링을 분노 externalized 종양을 유지. 기술된 이전 (단계 4.13-4.16)로 절 개 종양 복 부 구멍에 다시 삽입 닫고 복구 될 때까지 마우스를 모니터링 합니다.</li>
	<li>단계 4.17에 의하여 luciferase 이미징 vivo에서 를 사용 하 여 종양의 성장에 분노의 효과 모니터링 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 아무 관련 재정 공개를 있다.

이 연구에서 우리가 종양 성장에 분노의 효과 연구 하는 데 사용할 수 있는 PC에 대 한 immunocompetent 마우스 모델을 증명 하고있다. 현재, 분노 먼 질병의 수술 치료의 달 후에 진행 하지 않은 매우 선택한 로컬 고급 PC 환자에만 비 열 제거 기법으로 사용 됩니다. 그것의 사용 그러므로 제한 되었습니다 로컬 고급 PC 가진 대부분의 환자는 먼 전이성 질환20를 개발 하기 때문에. 이 모?...

췌 장 ductal 선 암 (PC) 20201주위 미국에서 암 사망의 두 번째 주요 원인이 될 전망 이다. PC 진단 환자의 대부분은 먼 전이성 질환2에서 결국 죽을 것 이다. PC microenvironment는 악명 높게 면역 및 chemoresistant. 그것의 desmoplastic 기질 포함 이펙터 (안티 종양) T 세포의 부족 및 종양 관련 된 대 식 세포 (Tam)을 포함 한 면역 백혈구의 굴지, 골수성 파생된 억제기 세포 (MDSCs), 및 규제 T 세포 (Tregs)3 . 이 microenvironment의 이러한 효과 중화 하는 복합 전략을 개발할 필요가 기반이 됩니다.
분노는 종양 절제의 비 열 방법으로 개발 되었습니다. 열 제거 기술, 달리 분노 빠른 coagulative 괴 사를 발생 하지 않습니다 있지만 대신 점진적 apoptotic 세포 죽음4에 결과. 중요 한 것은 췌 장 종양에 대 한 분노는 "열 싱크" 효과에 취약 하 고 혈관5옆 바로 수행할 수 있습니다. 이 기술은6 FDA 510(k) 허가 있으며 현재 사용 되 고 임상, 선택한 로컬 고급 또는 경계선 불과하다 췌장암 환자. 가장 큰 출판된 시리즈에서 분노의 PC7대, 분노를 받은 환자의 평균 생존 약 두 번 절제8,9없이 혼자 현대 화학 요법으로 치료 하는 환자의 생존이 했다.
몇몇 학문은 그 열 제거 (검토 추 외 에 다른 종양 유형에서 조직의 면역 반응 유도 설명 했다 10). 고주파 제거 (RFA) 동물 종양 모델 리드 증가 T 세포에에서 침투11,12, 간세포 암 환자13, 활성화 된 자연 킬러 (NK) 세포에 있는 증가 포함 하 여 14, 그리고 면역 Tregs 폐 암 환자15감소. 연구의 많은 더 작은 수는 면역, microenvironmental, 그리고 부상 응답 분노16을 시험 했다. 분노는 보조 (contralateral) 신장 세포 이식의 성장 또는 감소 했다 2 주 기본 종양의 분노를 예방할 immunocompetent 마우스 모델에서 조직의 면역 반응을 자극 하 표시 되었습니다 이전17. 그들은 또한 immunocompetent 쥐 immunocompromised 쥐 보다 완벽 한 회귀에 대 한 더 적은 전압 필요한 관찰. 그것은 분노의 열 제거, coagulative 괴에 비해 향상 된 항 원 프레 젠 테이 션 될 수 있습니다 하지만이 특별히 공부 하지는 가설 되어 있다.
KPC-뤽 4580 셀 선 (제이 예치 노스캐롤라이나 대학에서에서 선물), 남성 LSL Kra 개발한 종양에서 파생 되었다에서 PC의 syngeneic 마우스 모델 개발 했습니다G12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL ROSA26 루크 / + 마우스, 분노18,19의 지역 및 조직의 효과 공부 하. 이 luciferase 표현 셀 라인 면역성 이며 또한 immunocompetent C57BL/6 쥐에 tumorigenic SQ orthotopically를 주입 하 고 안정적으로 생산 하는 간 전이 비장에 주입 했을 때. 우리 두 바늘 배열 조사 (5 m m 구분) 또는 광장 또는 orthotopic 종양, 플래티넘 트위터-trodes를 사용 하 여 1500 V/cm의 비 전압/거리에 전기의 100 µs 펄스를 제공 하는 프로그래밍 가능 구형 파 펄스 발생기 활용에서 각각, 작은 동물에 분노의 효과 모델링 하 쥐.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 square wave electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BTX # 45-0002 ( 58018-004 )</td><td></td></tr><tr><td>2 needle array electrode</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0167</td><td></td></tr><tr><td>Safety foot switch</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Tweezer-trode</td><td>Harvard Apparatus</td><td>&amp;nbsp;45-0486</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 media</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Lacrilube</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>19090646</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>NC1292810</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferrin</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&amp;nbsp; Spectrum In Vivo Imaging System</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Mouse strain C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>000664/Black 6</td><td></td></tr><tr><td>Cell line (KPC-Luc 4580)</td><td>J.J. Yeh Lab at University of North Carolina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide syringe needles</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>Z192406</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Swab(70% isopropyl alcohol )</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Digital calipers</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpels, Sterile</td><td>VWR</td><td>21909</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicators</td><td>VWR</td><td>89198</td><td></td></tr><tr><td>Suture Needle, 45 cm, Size 6-0</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-3308</td><td></td></tr><tr><td>Suture Needle, 45 cm, Size 4-0</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-3314</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-iodine 10%</td><td>BD</td><td>29900-404</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Warming Pad&amp;nbsp;</td><td>KENT SCIENTIFIC CORP.</td><td>TP-3E</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Hair Clipper</td><td>KENT SCIENTIFIC CORP.</td><td>CL8787</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Drape</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-7421</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr></tbody></table>

a syngeneic pancreatic cancer mouse model to study the effects of irreversible electroporation

췌장암 (PC), 미국에서 약 40000 환자 년 죽이 질병은 성공적으로 유망한 immunotherapeutic 전략을 포함 한 여러 치료 접근을 피할 수 있습니다. 돌이킬 수 없는 electroporation (분노) 따라서 종양 혈관 가까이 매우에 수행 하는 절차를 사용 하면 인접 한 collagenous 구조의 파괴 없이 종양 세포 죽음을 유도 하는 비 열 제거 기술 이다. 열 제거 기술, 달리 분노 유발 즉시 제거 괴 사, 함께 점진적 apoptotic 세포 죽음에 결과 이며 현재 로컬 고급 PC 선택 된 환자에 대 한 임상 사용. 융 제, 분노 같은 비 대상 특정 절차 종양 microenvironment에 반응의 무수 한을 유도할 수 있다. 몇 가지 연구는 다른 종양 유형, 종양 성장에 분노의 영향을 해결 하지만 아무도 PC에 집중 했다. 우리는 다양 한 경도 연구 포스트 절차를 용이 하 게 높은 통제 속에서 분노와 피하 (SQ)와 orthotopic 종양 대우 될 수 있다 성공적으로 PC의 syngeneic 마우스 모델을 개발 했습니다. 이 동물 모델 분노와 분노의 임상 효능을 개선 하는 방법의 효과 연구 하는 강력한 시스템 역할을 합니다.

우리는 절차를 따라 위에서 설명한 고 5-6 주 오래 된 야생 타입 C57BL/6 쥐 50 %1 x 106 세포 주사에 평방 종양 생성 BMM. 종양 크기 직경에서 5-6 m m에 도달 하면 쥐의 몇 가지 했다 안락사, 그들의 종양 excised 했다 orthotopically 받는 사람 C57BL/6 쥐에 이식. 그림 1에 타임 라인에 같이 분노 수행된 10 일 게시물을 이식 했다. 분노는 베어링 평방 종양 나머?...

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A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

돌이킬 수 없는 Electroporation의 효과 공부 하는 Syngeneic 췌 장 암 마우스 모델

돌이킬 수 없는 electroporation (분노) 로컬 고급 췌장암의 치료에 사용 하는 비 열 제거 기술입니다. 비교적 새로운 기술 이기 때문에, 종양 성장에 분노의 효과 제대로 이해 된다. 췌장암에 대 한 분노의 효과 공부 하 고 용이 하 게 syngeneic 마우스 모델을 개발 했습니다.

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.4K 조회수.  University California San Diego. 돌이킬 수 없는 electroporation (분노) 로컬 고급 췌장암의 치료에 사용 하는 비 열 제거 기술입니다. 비교적 새로운 기술 이기 때문에, 종양 성장에 분노의 효과 제대로 이해 된다. 췌장암에 대 한 분노의 효과 공부 하 고 용이 하 게 syngeneic 마우스 모델을 개발 했습니다.

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Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will survive longer than five years. In order to understand and mimic the microenvironment of pancreatic tumors, we utilized a murine orthotopic model of pancreatic cancer that allows non-invasive imaging of tumor progression in real time. Pancreatic cancer cells expressing green fluorescent protein (PANC-1 GFP) were suspended in basement membrane matrix, high concentration, (e.g., Matrigel HC) with serum-free media and then injected into the tail of the pancreas via laparotomy. The cell suspension in the high concentration basement membrane matrix becomes a gel-like substance once it reaches room temperature; therefore, it gels when it comes in contact with the pancreas, creating a seal at the injection site and preventing any cell leakage. Tumor growth and metastasis to other organs are monitored in live animals by using fluorescence. It is critical to use the appropriate filters for excitation and emission of GFP. The steps for the orthotopic implantation are detailed in this article so researchers can easily replicate the procedure in nude mice. The main steps of this protocol are preparation of the cell suspension, surgical implantation, and whole body fluorescent in vivo imaging. This orthotopic model is designed to investigate the efficacy of novel therapeutics on primary and metastatic tumors.

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

췌장암의 형광 동소 이식 마우스 모델

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

연구

암 연구학

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel therapies in pancreatic cancer. Tumor onset is variable in the KPC model between 8 weeks and several months. Therefore, non-invasive imaging tools are required to screen for tumor onset and monitor for response to treatment. To address this issue, different approaches have emerged over the last years. High resolution ultrasound has major advantages such as non-invasiveness, fast session times and a high image resolution without radiation exposure. However, ultrasound in mice is not trivial and sufficient anatomical knowledge and practical skills are required to successfully perform high resolution ultrasound in preclinical pancreatic cancer models. With the following article, a detailed hands-on guide for abdominal ultrasound in murine models with a particular focus on endogenous pancreatic cancer models is presented. Furthermore, a summary of common mistakes and how to avoid them is provided.

This article describes the utilization of high-resolution ultrasound in genetically engineered pancreatic cancer mice. The primary aim is to provide a detailed instruction for detection and evaluation of endogenous pancreatic tumors.

고해상도 초음파 모니터 종양 발병 및 성장 췌장암 유전자 조작된 모델에서을 활용 하 여

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

뮤린 췌장 연성 선암의 초음파 유도 정형 외 이식

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer (PC). To address this deficiency, we describe a mouse model involving orthotopic implantation of PC followed by distal pancreatectomy and splenectomy. The model has been demonstrated to be safe and suitably flexible for the study of various therapeutic approaches in adjuvant and neo adjuvant settings.
In this model, a pancreatic tumor is first generated by implanting a mixture of human pancreatic cancer cells (luciferase-tagged AsPC-1) and human cancer associated pancreatic stellate cells into the distal pancreas of Balb/c athymic nude mice. After three weeks, the cancer is resected by re-laparotomy, distal pancreatectomy and splenectomy. In this model, bioluminescence imaging can be used to follow the progress of cancer development and effects of resection/treatments. Following resection, adjuvant therapy can be given. Alternatively, neoadjuvant treatment can be given prior to resection.
Representative data from 45 mice are presented. All mice underwent successful distal pancreatectomy/splenectomy with no issues of hemostasis. A macroscopic proximal pancreatic margin greater than 5 mm was achieved in 43 (96%) mice. The technical success rate of pancreatic resection was 100%, with 0% early mortality and morbidity. None of the animals died during the week after resection.
In summary, we describe a robust and reproducible technique for a surgical resection model of pancreatic cancer in mice which mimics the clinical scenario. The model may be useful for the testing of both adjuvant and neoadjuvant treatments.

In the clinical context, patients with localized pancreatic cancer will undergo pancreatectomy followed by adjuvant treatment. This protocol reported here aims to establish a safe and effective method of modelling this clinical scenario in nude mice, through orthotopic implantation of pancreatic cancer followed by distal pancreatectomy and splenectomy.

췌장암의 정형소 절제술 마우스 모델

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Syngeneic Mouse Orthotopic Allografts to Model Pancreatic Cancer

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a very complex disease characterized by a heterogeneous tumor microenvironment made up of a diverse stroma, immune cells, vessels, nerves, and extracellular matrix components. Over the years, different mouse models of PDAC have been developed to address the challenges posed by its progression, metastatic potential, and phenotypic heterogeneity. Immunocompetent mouse orthotopic allografts of PDAC have shown good promise owing to their fast and reproducible tumor progression in comparison to genetically engineered mouse models. Moreover, combined with their ability to mimic the biological features observed in autochthonous PDAC, cell line-based orthotopic allograft mouse models enable large-scale in vivo experiments. Thus, these models are widely used in preclinical studies for rapid genotype-phenotype and drug-response analyses. The aim of this protocol is to provide a reproducible and robust approach to successfully inject primary mouse PDAC cell cultures into the pancreas of syngeneic recipient mice. In addition to the technical details, important information is given that must be considered before performing these experiments.

Syngeneic mouse orthotopic allografts of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) recapitulate the biology, phenotypes, and therapeutic responses of disease subtypes. Owing to their fast, reproducible tumor progression, they are widely used in preclinical studies. Here, we show common practices to generate these models, injecting syngeneic murine PDAC cultures into the pancreas.

췌장암을 모델링하기 위한 Syngeneic Mouse Orthotopic Allografts

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a very complex disease characterized by a heterogeneous tumor microenvironment made up of a diverse stroma, ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

간 전이의 전임상 쥐과 모델

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

의학

Dynamic Contrast Enhanced Magnetic Resonance Imaging of an Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe respiratory motion artifact in the abdominal area. Orthotopic tumor models offer advantages over subcutaneous ones, because those can reflect the primary tumor microenvironment affecting blood supply, neovascularization, and tumor cell invasion. We have recently established a protocol of DCE-MRI of orthotopic pancreatic tumor xenografts in mouse models by securing tumors with an orthogonally bent plastic board to prevent motion transfer from the chest region during imaging. The pressure by this board was localized on the abdominal area, and has not resulted in respiratory difficulty of the animals. This article demonstrates the detailed procedure of orthotopic pancreatic tumor modeling using small animals and DCE-MRI of the tumor xenografts. Quantification method of pharmacokinetic parameters in DCE-MRI is also introduced. The procedure described in this article will assist investigators to apply DCE-MRI for orthotopic gastrointestinal cancer mouse models.

The goal of this protocol is to apply dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) for orthotopic pancreatic tumor xenografts in mice. DCE-MRI is a non-invasive method to analyze microvasculature in a target tissue, and useful to assess vascular response in a tumor following a novel therapy.

동소 이식 췌장 암 마우스 모델의 동적 대비 강화 된 자기 공명 영상

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe ...

Bioluminescent Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model: A Non-invasive Technique to Monitor Cancer Progression in Mice

Source: Chai, M. G., et al. <a href="https://www.jove.com/v/50395/" target="_blank">Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2013).
This video demonstrates an orthotopic model of pancreatic cancer that utilizes Matrigel for localized cell delivery and&#160;in vivo&#160;bioluminescence imaging for non-invasive monitoring of tumor progression. The orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and could be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

생물 발광 직소성 췌장암 마우스 모델: 마우스의 암 진행을 모니터링하기 위한 비침습적 기술

Source: Chai, M. G., et al. Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2013).
This video demonstrates an ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Pancreatic Cancer

Assays & techniques

Orthotopic Homograft Tumor Transplantation: A Technique to Generate Pancreatic Tumor Mouse Models

Source: An, X. et al.&#160;<a href="https://www.jove.com/v/57460/" target="_blank">Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry</a>. J. Vis. Exp. (2018)
The video explains a stepwise surgical method for orthotopic implantation of a tumor fragment from a cancerous donor to the pancreas of a non-cancerous recipient mice for development of pancreatic cancer. Orthotopically implanted PDAC could recapture the tissue microenvironment of human pancreatic cancers than conventional subcutaneous (SC) models more accurately.

정소성 동종이식 종양 이식: 췌장 종양 마우스 모델을 생성하는 기술

Source: An, X. et al.&#160;Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry. ...