이 프로토콜은 유전자형, 표현형 및 약물 반응 연구에 적합한 재현 가능하고 면역적격한 PDAC 생체 내 모델을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 실험의 재현성을 유지하면서 동계 생물학적 종양 미세 환경으로 종양 진행을 조사하는 데 도움이 되는 능력입니다. 절차를 시연하는 것은 Stefanie Barthel과 Chiara Falcomata가 될 것이며, 둘 다 우리 실험실에서 왔습니다.
T75 배양 플라스크에서 성장한 췌관 선암종 또는 PDAC 세포를 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 세척하여 종양 세포의 준비를 시작합니다. 그런 다음 0.5 밀리리터의 트립신을 5-10 분 동안 첨가하여 플라스크에서 분리합니다. 세포 현탁액을 15밀리리터 튜브로 옮기기 전에 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 0.1% 페니실린 스트렙토마이신을 사용하여 10밀리리터의 DMEM에 분리된 세포를 다시 현탁합니다.
세포 현탁액을 200G에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 주입을 위해 필요한 세포의 최종 농도를 기준으로 첨가제 없이 DMEM에서 세포 펠릿을 재현탁합니다. Neubauer Chamber를 사용하여 10 마이크로리터의 세포 현탁액에서 세포를 계수하고 사용 가능한 세포 수를 계산합니다.
희석된 현탁액 1밀리리터를 최종 요구 농도에 따라 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 세포 응집을 방지하기 위해 이식될 때까지 회전자에 튜브를 놓습니다. PDAC 세포의 동소 이식을 위해 마우스가 잠자는 동안 진통을 받은 마우스에 아이 크림을 바릅니다.
진통을 제거한 마우스의 왼쪽 측면 복부 옆구리를 면도하기 전에 충분한 진통 작용을 확인하십시오. 오른쪽에 누워있는 마우스를 멸균 가열 매트 위에 놓고 다리를 표면에 테이프로 붙입니다. 새 장갑을 착용하고 소독하십시오.
수술 용 가위를 사용하여 비장이 돌출 된 왼쪽 옆구리의 피부와 피하 지방 조직을 세로로 약 1cm 잘라냅니다. 가위와 집게를 사용하여 복막에서 피부를 분리하여 복막에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 1 센티미터 세로 절단으로 비장 위치에서 복막을 열기 전에 가위를 변경하십시오.
뭉툭하고 끝이 가는 집게를 사용하여 비장과 부착된 췌장을 움직이는 동안 장기가 다른 조직에 부착되지 않도록 합니다. 또한 췌장을 다룰 때 혈관이나 주변 조직이 손상되지 않도록 공급 혈관을 확인하십시오. 절개 부위에서 췌장을 조심스럽게 당겨 장기의 꼬리에 쉽게 접근할 수 있도록 하고 췌장을 따라 비장을 관찰합니다.
주사 중에 장기가 접히지 않도록 하고 엎지르지 않도록 바늘 관통 부위에서 장기의 캡슐을 장력으로 유지합니다. 눈에 보이는 혈관 사이에 췌장 조직 조각을 조준하여 혈관에 구멍을 뚫거나 주사할 위험을 최소화합니다. 주로 사용하는 손을 사용하여 장기의 세로축을 따라 27 게이지 캐뉼라와 50 마이크로 리터 주사기로 장기의 캡슐을 조심스럽게 관통합니다.
2, 500 개의 세포를 함유 한 20 마이크로 리터의 현탁액을 췌장의 꼬리 부위에 주입 한 후 종양 세포가 엎질러지지 않도록 췌장과 주사기를 약 1 분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 주사 부위에서 바늘을 제거합니다. 다음으로, 세포가 쏟아지지 않도록 조직을 손상시키지 않고 복부 내부의 장기를 조심스럽게 재배열합니다.
장기에 0.9% 염화나트륨 1밀리리터를 부어 장기 유착을 피하십시오. 간단한 중단 봉합 기술을 사용하여 복막을 봉합 한 후 2-3 개의 9 밀리미터 스테인리스 스틸 상처 클립을 사용하여 피부를 닫습니다. 그런 다음 미다졸람, 메데토마딘, 펜타닐 또는 MMF로 진통을 길항하여 마우스의 체중에 따라 AFN을 피하 주사합니다.
완료되면 마우스가 깨어나고 완전히 활성화될 때까지 섭씨 37도의 가열된 챔버에 마우스를 놓습니다. 활성 마우스를 원래 케이지에 다시 넣고 털, 피부색 및 활동을 확인하여 마우스의 건강 상태를 모니터링하고 수술 후 3-4 시간 후에 반복합니다. 이식된 마우스의 MRI에서, PDAC 세포의 생착은 주입된 세포 수 및 접종된 세포주의 공격성 및 성장 특성에 따라 수술 후 약 7일에 가장 빨리 복부 촉진되었다.
생성된 이식된 마우스의 생존율은 세포주의 종양 세포 고유 특징에 따라 다양하였다. 성공적인 췌장 내 주사는 마우스 췌장에서 본격적인 종양으로 이어졌습니다. 대조적으로, 실패한 이식은 생존 불가능한 세포의 주입, 이식된 세포의 거부 또는 불충분한 수의 세포 주입으로 인해 췌장 종양이 없는 결과를 낳았습니다.
주사 중 세포가 엎질러지지 않도록 주의하고 주변 조직을 손상시키지 않도록 주의하여 세포가 복부 내부로 퍼지는 것을 방지하십시오. 이 절차에 따라, 전임상 약물 반응 연구와 같은 생체내 연구를 면역적격 마우스에서 수행한 다음, 예를 들어 종양 숙주 상호작용을 조사하기 위한 사실, 시퀀싱 또는 조직학적 분석을 수행할 수 있습니다.
