이 작품은 건강의 국가 학회 (R21NS098129)에서 교부 금에 의해 부분에서 지원 됩니다. SueSan 첸, 조나단 탄, 코 티 카 나, 시 카이 니 Feng 위안 부, 누가 설계 및 구조 지원 고속 이미징 실험이이 원고에서 설명 하는 동안 사용 되는 조명 내장에서 우수한 기술 지원을 인정 하 고 싶습니다. .

<ol>
	<li>Faul, M., L, X. u., Wald, M. M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. , (2010).</li><li>Kabadi, S. V., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+for+traumatic+brain+injury:+improving+clinical+translation.">Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 1216-1236 (2014).</li><li>Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+disrupted+in+human+ALS+motor+neurons+identified+through+genetic+correction+of+mutant+SOD1.">Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 781-795 (2014).</li><li>Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+tolerance+and+delayed+elastic+response+of+cultured+axons+to+dynamic+stretch+injury.">High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury.</a> J Neurosci. 19 (11), 4263-4269 (1999).</li><li>Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+axonal+injury+induces+calcium+influx+modulated+by+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels.">Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> J Neurosci. 21 (6), 1923-1930 (2001).</li><li>Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+acute+calcium+influx+after+mechanical+stretch+injury+in+vitro+on+the+viability+of+hippocampal+neurons.">Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons.</a> J Neurotrauma. 21 (1), 61-72 (2004).</li><li>Magou, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+high+throughput+axon+injury+system.">Engineering a high throughput axon injury system.</a> J Neurotrauma. 28 (11), 2203-2218 (2011).</li><li>Morrison, B., Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+traumatic+brain+injury+utilising+two-dimensional+stretch+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures.</a> J Neurosci Methods. 150 (2), 192-201 (2006).</li><li>Cater, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+reproduces+in+vivo+post-traumatic+neurodegeneration:+role+of+glutamate+receptors+and+voltage-dependent+calcium+channels.">Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels.</a> J Neurochem. 101 (2), 434-447 (2007).</li><li>Kang, W. H., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tolerance+to+mechanical+deformation+developed+from+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures.</a> Biomech Model Mechanobiol. 14 (3), 561-575 (2015).</li><li>Sherman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+Injury+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Neurons+in+a+96+Well+Format.">Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format.</a> Sci Rep. 6, 34097 (2016).</li><li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Head+Injury+Mechanisms+Using+Neutral+Density+Technology+and+High-Speed+Biplanar+X-ray.">Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray.</a> Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).</li><li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+response+of+the+human+cadaver+head+to+impact.">A study of the response of the human cadaver head to impact.</a> Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+room+temperature+bonding+of+thermoplastics+and+poly(dimethylsiloxane).">Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane).</a> Lab Chip. 11 (5), 962-965 (2011).</li><li>Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+pathology+in+traumatic+brain+injury.">Axonal pathology in traumatic brain injury.</a> Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).</li><li>Lacour, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+and+stretchable+micro-electrodes+for+in+vitro+and+in+vivo+neural+interfaces.">Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces.</a> Med Biol Eng Comput. 48 (10), 945-954 (2010).</li><li>Yu, Z., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mild+traumatic+brain+injury+induces+functional+alteration+of+the+developing+hippocampus.">Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus.</a> J Neurophysiol. 103 (1), 499-510 (2010).</li><li>Tcw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Platform+for+Astrocyte+Differentiation+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

일관 된 취득의 열쇠, biofidelic 표현 형이이 모델에 일관 된 biofidelic 기계 모욕을 적용 합니다. 이 모델 기간이 10-15 ms와 유사한 시체 실험12,13에 따라 인간의 머리 영향에 대 한 펄스 기간 짧은 펄스를 생성할 수 있습니다. 이 모욕의 일관성 indenter 블록 플레이트의 맞춤은 indenters의 일관 된 윤 활에 따라 다릅니다. 때 indenter 블록 정렬 잘 있다 아무 추세 적용 된 스트레인에 행 또는 열 (그림 2C). 윤활제의 얇은 레이어는 일반적으로 두꺼운 층 마찰 만들고 점성 윤활제는 실리콘 파울 현미경 중 빛의 통로 방해 때문에 권장 하지 않습니다. 실제 무대 변위 진폭 수 짧은을 실질적으로 된 변위 진폭 때 많은 indenters을 사용 하 고 소정의 단계 변위 진폭 큰 (> 3 m m) 이다. 그러나, 실제 변위는 큰 진폭에 소정의 변위 보다, 하는 동안 반복 (그림 2B) 남아 있다. 따라서, 큰, 실제 변위 진폭 원하는 값 초과 된 값을 입력 하 여 안정적으로 얻을 수 있습니다. 변위 진폭 피크 막 스트레인, 병 리를 유도 기계 모욕을 직접 측정에 대 한 쉽게 기록 된 프록시 때문에 중요 합니다. 따라서, 단계 진지 변환에서 막 부담을 결정에 대 한 설명 하는 절차가 중요 합니다. 접시와 indenters, 예를 들어 다른 간의 상호 작용에 영향을 주는 시스템에 변경 내용이 있는 주요 경우이 프로세스를 반복 해야 직경 indenters, 다른 indenter 자료 또는 코팅, 실리콘의 종류 바닥된 플레이트 사용 됩니다. 각 실험의 시작에 indenter 블록을 재조정 하 고 제로 위치를 결정 하는 과정을 반복 한다. 스트레칭 장치의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. CAD 모델 장치를 재현 하는 데 필요한 보충 자료로 제공 됩니다: ' 부상 장치-전체 어셈블리-일반 3D. 단계 '; 제공 되는 자료의 관련된 법안으로보충 표 1: 사용자 정의 내장 장치-BOM.xlsx. 또한 보충 테이블 2 96 잘 접시 _loader - 핀 배선 Diagram.xlsx, 시스템의 다양 한 구성 요소를 연결 하는 케이블 연결 설명 참조. 'Interconnector_circuit_board.dip'는 케이블을 상호 연결 하는 회로 보드에 설명 합니다.
여행 중간 근처 무대 장치를 비활성화 하는 경우 그것은 스프링 때문에 전원 차단 후 무대 이동 합니다. 전원이 복원 되 면 피드백 루프 마지막 알려진된 된 위치와 실제 위치 사이의 큰 차이 감지 합니다. 이 위치로 갑자기 이동 무대 장치가 비활성화 되었습니다 때 발생 합니다. 않으므로 주의 한다 그것은 그것의 전원이 꺼져 있는 휴식 여행 상단에 위치 하는 경우에 장치를 비활성화 하려면이 갑자기 모션 인코더의 출력에서 오류를 발생할 수 있습니다.
제조 클램프는 최적의 결합을 허용 하는 방식으로 함께 접시 신체와 실리콘 바닥을가지고 설계 되었습니다. 이 위해, 있는 세 가지 핵심 기능 추가 파일에서 제공 하는 디자인 ' 프레스 다이-일반 3D. 단계 '. 첫째, 클램프 플레이트 몸 홀더 실리콘 바닥에 평행 하다. 이 제대로 빌드된 경우 초기 설치 후 아무 조정이 필요 합니다. 둘째, 클램프에 거품 고무의 레이어 클램프 폐쇄 때 완전히 딱딱한 시스템 이론적으로 무한 한 클램핑 힘을 제로 클램핑 힘에서 급격 한 증가 경험으로 접시, 아래 준수의 작은 금액을 제공 합니다. 크로스바의 위치와 클램프의 나사는 클램프의 두 측면 사이의 거리는 괜찮을 수 있다 그래야 조정 가능 하다.
모든 노력 스트레인 특성 실험 중 점 뒤에 밝은, 흰색 배경 잘 하단에 제공 하 여야 한다. 더 나은 대비 이러한 이미지에 쉽게 될 것입니다 높이 교환원 큰 실험 분석에 대 한 지루한 될 수 있는 도트의 너비를 측정 하는 과정을 자동화. 96 잘 접시에 우물의 바닥의 고속 videography 우물의 벽 그림자 경향이 있기 때문에 도전을 선물 한다. 돔 빛 또는 카메라의 시선에 따라 이미지를 왜곡 없이 밝히는 수 확산 축 빛의 사용은 그림자 또는 반사 반사 기존의 광원으로 발생 하는 것을 제거 합니다. 밝은 빛 소스 밝은 조명 이미지 짧은 노출 시간으로 획득 될 수 있기 때문에 사용 되어야 한다. 짧은 노출 시간 동작 흐림 효과 최소화합니다. 확산 축 빛의 발광 다이오드 (Led)를 업그레이드 중 고속 비디오 짧은 노출 시간을 허용 한다. Led Led 주식 제거 확산 축 빛을 개방 하 여 업그레이드할 수 있습니다, 그리고 장착 4 높은 전원 LED Led 홀더를 사용 하 여, 일정 한 현재 전력 공급에 연결 하 고 확산 축 빛 (참조 테이블의 재조합 백 창 배열 재료 카탈로그 번호). 업그레이드 하는 Led의 단점은 과열 될 위험이 몇 초에 대 한 수 동적으로 냉각된 Led 유지할 수 없는. 따라서, 다른 빛 후 블록 및 카메라 조정의 필요 합니다.
점 막에 스탬프의 팽창 측정 하 여 막 스트레인 측정의 표시 방법은 상대적으로 원유, 하지만 그것은 강력한 방식으로 여러 우물 확장할 수 있습니다. 잘 아래쪽 스트레인 필드 디지털 이미지 상관 관계를 사용 하 여 좀 더 자세하게에서 특징 수 있습니다. 이 기술은 포함 한다 우물의 기지에 얼룩 덜 룩 한 패턴을 분사 하 고 다음에 그것을 이미징 변형 중 고속. 상용 소프트웨어는 다음 얼룩 덜 룩 한 패턴의 진화를 추적 하 여 이미지의 모든 지점에서 스트레인 척도를 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 hiPSCNs에 다 면, 임상 관련, 스트레칭 상해 형을 생성합니다. 세포 죽음, neurite 변성 및 neurite 구슬 인간에서 TBI의 모든 문서화 sequelae 이며 동물 모델15. 이 모델에서 성공의 열쇠는 설정 이며 건강 한 문화를 유지 하. 일반적으로 말하자면, 기존의 경직 된 플레이트와 개발 세포 문화 프로토콜 stretchable 격판덮개 문화에 대 한 가치 있는 출발점입니다. 그러나, 문제의 세포 실리콘에 다르게 응답할 수 있습니다 가능성 항상 고려 되어야 한다. 이 문화 상황에 매우 민감한 hiPSCNs의 특히 사실 이다. 셀 밀도 laminin 농도 최적화의 몇 가지 예는 (그림 3, 그림 4) 대표적인 결과 섹션에서 제공 됩니다. 플라즈마 처리 된 실리콘의 활성화는 생명 이다. 실리콘은 소수 성 그리고 unreactive; 자연 상태에서 그것은 하지 laminin 또는 셀 첨부를 홍보 하는 데 사용 하는 다른 분자에 바인딩합니다. 플라즈마 처리는 친수성 표면을 렌더링 하 고 반응 그룹 노출. 이러한 변화 접착 분자 실리콘 바인딩할 홍보 셀 첨부 파일을 허용 합니다. 그것은 중요 한 플라즈마 처리 효과 표면, 액체에 빠져들 고 그래서 최대한 빨리 활성화 된 표면 건조를 포함 하는 절차를 수행 해야 분 이내 사라지는 것. 플라즈마 처리의 효과 없어진 경우 확인 하는 간단한 방법은 표면에 물 한 방울을 배치 하는 것입니다. 플라즈마 처리 실리콘에 밖으로 전파 하는 반면 치료 실리콘에는 물방울을 구슬 것입니다. 우리가 사용 하는 hiPSCNs와 ( 재료의 표참조), 제조업체 셀 서 스 펜 션 보다는 사전 코팅 laminin 추가 것이 좋습니다. 이 프로토콜은이 접근을 성공적으로 통합 했다. 세분화, 이론적으로, 달성 될 수 있다 오픈 소스 소프트웨어 또는 범용 프로그래밍 언어, 하는 동안 이러한 도구와 능력의 높은 학위 좋은 결과 얻기 위해 필요 합니다. Neurites는 자주 그들은 너무 슬림 하기 때문에 배경 신호 로부터 구별 하기 어렵다입니다. 따라서, 우리는 그들이 사용할 수 있는 경우 전용 모듈 세분화와 뉴런의 정량화에 대 한 높은 콘텐츠 현미경 회사에서 배포 하는 상용 소프트웨어 도구를 사용 하 여를 권장 합니다. 상용 소프트웨어와도 시각적으로 정확도 확인 하기 위해 세분화의 이미지를 내보낼 현명 하다.
기존의 경직 된 플레이트 작업에 비해 stretchable 접시에서 일하고와 관련 된 몇 가지 제한이 있습니다. Stretchable 접시 공기 목표와 정상적으로 몇 군데 될 수 있습니다. 그러나, 집중 목표와 이미징 매우 어렵습니다. 렌즈 오일 실리콘을 손상 될 수 있습니다. 또한, 목표 위쪽으로 이동할 때 실리콘 막에 압력을 미치는. 이 압력 배 수량 막 수직, 어렵게 초점으로 샘플을가지고. 현재 판 제조에 사용 되는 실리콘 막 약 250 µ m 두께입니다. 이 두께 많은 높은 전력, 침수 목표의 초점 거리를 초과합니다. 특별 한 배려는 현미경에 필요한 평탄도 달성 하기 위해 클램핑 하기 전에 완벽 하 게 평면 멤브레인을가지고 한다. 자동 초점 시스템 어느 정도 완성 된 플레이트의 평탄도에 편차를 보정할 수 있습니다. 이후 버전의 프로토콜 평탄도 보장 하기 위해 접시 위쪽에 접착은 전에 막을 긴장 미리 수 있습니다. 플레이트 최고14 에 실리콘 막 본딩 접착제 없는 절차에는 현재 프로토콜의 중요 한 힘으로 간주 됩니다. 그것은 평탄도 접착제 층의 비균일 두께 때문에 neurotoxicity 어떤 편차 및 접착제에서의 위험을 제거합니다.
다중 전극 배열 일반적으로 그들의 성숙과 기능을 평가 하기 위해 hiPSCNs와 함께 실험에 사용 됩니다. 셀 문화 기판은 엄밀한 때문에 불행 하 게도, 이러한 시스템이 모델과 호환 되지 않습니다. Stretchable 다중 전극 어레이 만들, 비록이 지금까지 입증 되었습니다 하나의 잘 포맷16,17가능 하다. Note는 indenters에서에서 제거할 수 있습니다 개별적으로 indenter 블록을 일부 우물 들여쓰기 되지 shams로 사용할 수 있습니다. 제거 하 고 indenter 들여쓰기를 방지 하지만 기계적 로드 이므로 우물에 있는 액체의 여전히 관성 모션 스테이지를 이동 하는 동안 완전히 제거 하지 않습니다. 그것은 결코 단계 모션 움직임의 어떤 병 적인 영향을 측정에 적용 했다 플레이트에 웰 스 이 우물 비교 가치가 있다. 또한, 블록에 indenters의 배열 bisymmetric (앞 뒤쪽으로 대칭과 좌우로) 이어야 한다. 이 경고는 무대 옆으로 기울기 하지 않으며 그들의 베어링에 바인딩할 막대를 원인이 되도록 들여쓰기, 중 접시 로드 균등 하 게 보장 합니다.
Neurotrauma 치료 혁신을 주요 과제 중 하나입니다 복잡 하 고이 조건. 외상에 적용 됩니다 멀티 모달 스트레스 중앙 신경 시스템에 모든 셀 형식을 동시에. 신경 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에서 안정적으로 생성 된 고 널리 상용 공급 업체에서 사용할 수 있습니다. 혁신은이 분야에서 신속 하 게 진행 되 고 이다18 microglia19 같은 다른 신경 세포 유형 또한 hiPSCs에서 파생 되 고. 곧 체 외에 외상 그리고 공동 문화 다른 세포 유형 그들은 외상 후 통신 하는 방법을 이해 하는 것이 세포 유형의 각각의 셀 자치 응답 분리 수 수 있습니다. 이 방법에서는, 궁극적으로 철저 하 게 인간의 시스템에 그것을 이해 하는 바닥에서 임상 도전 최대 다시 수 수 있습니다. 이 방법은 다른 설치류 모델에 의존 하는 기존의 접근 이며이 일반적인, 엄청난, 그리고 다루기 힘든 조건에 대 한 첫 번째 치료를 이끌어 내는 새로운 통찰력을 생성 하는.

TBI 일으키는 약 52000 죽음과 275000 입원 마다 년1사망률과 질병 률, 미국에서의 주요 원인입니다. TBI에 대 한 후보 치료제의 임상 시험을 30 개 이상의 단일 성공2없이 실시 되었습니다. 이 유니폼 실패 인간-특정 프로세스에서 일반적으로 사용 되 전 임상 설치류 모델에서 관찰 하는 이상 인간의 TBI를 별도 나왔다.
HiPSCNs의 출현 neurotrauma 인간의 생체 외에서 모델을 공부 하는 기회를 창조 했다. 약 hiPSCN 기반 모델 심사는 설치류 셀을 채용 하는 모델 보다 더 많은 임상 성공의 예측 결과 제공할 수 있습니다. 또한, hiPSCNs는 격리 하 고 병 리3개별 인간의 유전 이체의 효과 연구 유전으로 조작할 수 있습니다.
이 원고에 설명 된 메서드는 neurotrauma을 모델링 하는 hiPSCN 기반 질병의 독특한 장점을 설계 되었습니다. Neurotrauma의 스트레치 부상 모델에 생체 외에서 잘 설립된4,5,6 주 쥐 세포와 인간의 신경 암 세포 라인은. 이러한 모델의 대부분은 공기 실리콘 막 로드 하 여 스트레치를 생성 합니다. 이 방법은 단일 잘 형식에 효과적입니다 하지만 다 잘 형식7최대 규모 어려운 입증 되었습니다. 결과적으로, 결코 스트레치 부상된 신경 치료 하는 에이전트에 대 한 높은 처리량 화면 계속 있다.
이 모델에서 막 때문에 엄밀한 indenter와 밑에서 들여쓰기 펼쳐져 있습니다. 이 방법은 단일 잘 시스템8,,910관련 임상 병리학에 생체 외에서 생성 하 반복적으로 표시 되었습니다. 우리의 최근 작품으로는 쉽게 확장 96 잘 서식 하는 도메인의 닫히는 머리 영향 이벤트12,13시간 펄스 기간 수십 밀리초11, 순서를 유지 하면서 나타났습니다.
요약 하자면,이 생체 외에서 부상 모델의 주요 장점에 96 잘 형식, hiPSCNs의 사용 및 모욕의 임상 관련 시간 도메인.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="932">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">.010&#34; Silicone Sheet</td>
			<td style="width:205px;">Specialty Manufacturing, Inc</td>
			<td style="width:344px;">#70P001200010</td>
			<td style="width:167px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sparkleen</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#043204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc 256665</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#12-565-600</td>
			<td>Bottomless 96 Well Plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kim Wipes</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>S-8115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>#PDC-001-HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#440140</td>
			<td>APTES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parchment Paper</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dome Light</td>
			<td>CCS inc</td>
			<td>LFX2-100SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dome Light Power Supply</td>
			<td>CCS inc</td>
			<td>PSB-1024VB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axial Diffuse Lighting Unit&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>Nerlite DOAL-75-LED</td>
			<td>Diffuse axial light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Power LED Array&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
			<td>CREE</td>
			<td>XLamp CXA2540</td>
			<td>High Power LED Array&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED holder</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1807200001</td>
			<td>LED Holder&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LED power supply</td>
			<td>Mean Well</td>
			<td>HLG-320H-36B</td>
			<td>Constant Current Power Supply&#160; &#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastCam Viewer software&#160;</td>
			<td>Photron</td>
			<td></td>
			<td>camera softeware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fastcam Mini UX50</td>
			<td>Photron</td>
			<td>N/A</td>
			<td>High Speed Camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-NIKKOR 105mm f/2.8</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>#1455</td>
			<td>High Speed Camera Lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P4597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCells</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRC-100-010-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCell media</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRM-100-121-001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCell supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics International</td>
			<td>#NRM-100-031-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcein AM</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">voice coil actuator&#160;</td>
			<td>BEI Kimco</td>
			<td>LA43-67-000A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical linear encoder&#160;</td>
			<td>Renishaw</td>
			<td>T1031-30A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">servo drive</td>
			<td>Copley Controls</td>
			<td>Xenus XTL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Controller</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cRIO chassis</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>cRIO 9113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital input module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI 9411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">data acquistion chassis</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI 9113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>instrument control software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hiPSCNs</td>
			<td colspan="2">Cellular Dynamics International</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for high speed stretch injury of human induced pluripotent stem cell-derived neurons in a 96-well format

외상 성 뇌 손상 (TBI)은 높은 사망률과 사망 주요 임상 도전 이다. 전 임상 연구의 십 년간에 불구 하 고 아니 입증 된 치료 TBI에 대 한 개발 되었습니다. 이 문서는 기존 전 임상 모델을 보완 하기 위한 전 임상 neurotrauma 연구에 대 한 새로운 메서드를 제공 합니다. 그것은 인간의 이상 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 (hiPSCNs)를 통해 소개합니다. 그것은 로드 펄스 달성 기간 임상의 로딩 기간 유사한 폐쇄 머리 영향 부상. 그것은 높은 처리량 실험을 용이 하 게 하 고 비싼 셀 및 문화 시 약의 효율적 사용 96-잘 형식을 사용 합니다. 실리콘 막 신경 uncured 폴리머를 제거 하려면 먼저 처리 되며 다음 stretchable 96 잘 접시를 만드는 상업적인 96 잘 접시에 보 세. 사용자 장치는 기계적으로 우물에 문화에 있는 세포를 손상 equibiaxial 기계적인 긴장을 유도 아래에서 잘 바닥의 일부 또는 전부를 사용 됩니다. 들여쓰기 깊이 기계적 스트레인의 관계 경험 잘 바닥의 고속 videography를 사용 하 여 들여쓰기 중 결정 됩니다. HiPSCNs를 포함 하 여 셀, 기존의 세포 배양 프로토콜의 수정된 버전을 사용 하 여 이러한 실리콘 막에 배양 수 있습니다. 세포 배양의 형광 현미경 이미지는 취득 하 고 반자동 방식에 각 잘 상해의 수준을 계량으로 부상 후 분석. 제시 하는 모델은 hiPSCNs에 최적화 되어 있지만 수 이론에서에 적용할 다른 세포 유형.

들 것 장치는 (그림 2A) 펄스의 진폭에 따라 펄스 기간이 짧은 10-15 ms와 오래전 무대를 이동 수 있습니다. 펄스 진폭 높게 반복 가능 하지만 펄스 기간 약 1 다릅니다 반복 사이 ms. 우물의 많은 수는 로드 하 고 소정의 진폭은 실제 펄스 진폭 된 펄스 진폭에서 다른 ( 그림 2B참조). 3mm 넘어 무대 변위의 진폭 증가로 실제 변위 진폭 점점 미치지 된 변위 진폭 ( 그림 2B참조). 조심 게시물 블록의 맞춤 행 또는 열 (그림 2C) 막 스트레인에 어떤 추세 든 지 제거. 3.5 m m 52 우물 들여쓰기 단계 변위 진폭 (3.3 m m 실제 변위 진폭) 처방, 모든 잘 지역에 걸쳐 평균 Lagrangian 긴장 했다 0.451 (모든 위치에 대 한 의미의 표준 편차 = 0.051, 평균 표준 편차 모든 위치에 대 한 = 0.065, n = 잘 당 5 측정). 이러한 결과 비록 그들 중 일부는 이미 보고 된11완전성에 대 한 여기 표시 됩니다.
최적, 손상 되지 않은 문화는 5 개 이상의 세포의 경우 몇 덩어리로 있을 것 이다. 개별, 슬림, 길고 긴장 또는 구슬 (그림 3A)의 거의 없거나 전혀 없는 기호로 곡선 Neurites 있을 것입니다. 이상적인 조건 하에서 문화의 생존 제조업체의 데이터 시트 (일반적으로 60-70%)에 지정 된 생존 접근 밀접 하 게 해야 하 고 실리콘에 문화는 기존의 경직 된 문화 기판 ( 유지 그 유사 합니다. 그림 3B). Neurites 되거나 저전력 밝은 분야 현미경에 표시 되지 않을 수 있습니다. Laminin 농도 세포 밀도 및 부상 후 기준선에 영향. 셀 밀도 증가 수 및 문화에서 형성 하는 덩어리의 크기를 증가 했다. 종종 laminin 농도 증가 counteracted이 효과 (그림 3A). 그러나, 부상 (그림 4) 문화의 감도 무디게 하 너무 많이 집중 된 laminin 증가. 손상 되지 않은 문화에 대 한 최적의 laminin 농도 50 µ g/mL laminin (그림 3), 하지만 가짜 고 스트레치 부상된 인구 사이 최적의 분리 laminin (그림 4)의 10 µ g/mL에서 얻은 했다. 높은 laminin 농도 점에서 긴 시간 (예를 들어, 7 일) 향상 된 초기 세포 생존 능력 뿐만 아니라 짧은 시간 포인트 (그림 4), 부상 문화의 감도 감소. 요약 하자면, 그것은 각 실험 시나리오에 대 한 laminin 농도 최적화 가치가입니다.
막 긴장, 후 부상 영상 시간, laminin 농도, 및 세포 밀도 모든 셀 당 neurite 길이에 고도의 통계적으로 중요 한 주요 효과 발휘 (ANOVA, p < 0.001). 셀 당 neurite 길이에 막 긴장의 효과 했다 후 부상 이미징 시간 지점과 laminin 농도와 높은 통계적으로 중요 한 상호 작용 (ANOVA, p < 0.001)와 셀와 통계적으로 중요 한 상호 작용을 밀도 (ANOVA, p < 0.05). 마찬가지로, 막 긴장, 후 부상 밀도, 셀 시간 포인트, 이미징 및 모든 laminin 농도 세포 생존 능력에 높은 통계적으로 중요 한 주요 효과 발휘 (ANOVA, p < 0.001). 세포 생존 능력에 막 긴장의 효과 했다 후 부상 이미징 시간 포인트와 높게 통계적으로 중요 한 상호 작용을 (ANOVA, p < 0.001) 및 셀 밀도 (ANOVA, p 와 통계적으로 중요 한 상호 작용을 < 0.05). 이러한 결과 타이밍, 세포 밀도, 그리고 laminin 농도 발휘 적용된 모욕 및 실험 결과 관계에 중요 한 영향을 미치는 그래서 각 신중 하 게 최적화 되어야 합니다 증명.
낮은 세포 생존 능력 및 저하 neurite 성장, 함께 파란색된 neurites 독성 문화 조건에서 부적절 하 게 발생할 수 있는 실리콘 준비를 나타냅니다. 건너뛰기 또는 물 담가 또는 건조 오븐 단축 수 흡수 에탄올 떠나거나 미디어로 확산 하 고 셀 강조 수 있는 멤브레인, 각각, 물. 세포 생존 능력, 단축 또는 누락 neurites, 파란색된 neurites, 및 긴장 된 또는 데크에 neurites 잘 부상된 문화 감소 됩니다. 부상 수 있습니다 잘 분산 된 사전 부상 했다 세포 배양에 응집을 유도 하 고 있다. 큰 덩어리는 형태소 분석을 혼동 수 있습니다. 형태소 분석에 대 한 눈에 띄는 변화가 발생 하지만 셀은 여전히 일부 neurites 함께 존재 하는 상해 수준을 조정 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig1.jpg"> 그림 1 : A 라는 부상 장치 회로도. (A) 평면도, 아이소메트릭 뷰 (B), (C) 전면 보기, (D) 오른쪽 보기. 눈금 막대는 직교 뷰 (A, B, D)에 적용 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig2.jpg"> 그림 2 : 기계적 모욕의 운동학. (A) 단계 변위 기록 된 진폭 (범례에 나열 된 진폭)의 범위에서 5 펄스 동안 아무 웰 스는 로드 되었을 때. (B) 단계 변위 기록 된 진폭 (범례에 나열 된 진폭)의 범위에서 10 펄스 동안 52 웰 스는 로드 되었을 때. (C) 각 잘 3.3 m m의 무대 변위 진폭의 평균 변형 (n = 5 측정 음, 당 평균 표준 오차 잘 당 0.029 =). C4-f 4와 c 9 f 9는 스트레치 제어 우물 note. 이 그림에서 셔먼 외 수정 되었습니다. 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig3.jpg"> 그림 3 : 문화의 최적화 실리콘에 조건. (A) 다양 한 실리콘에 hiPSCN 문화에 셀 밀도 laminin 농도의 효과. 셀 밀도 증가 laminin 농도 감소와 응집 증가 합니다. 셀 밀도 laminin 농도 문화 모노 분산을 달성 하기 위하여 낙관 되어야 한다. 모노 분산 문화는 덜 취약 아티팩트를 정량화 하는 동안. 참고 동적 범위는 neurites의 시각화를 최적화 하기 위해 조정 되었습니다. 결과적으로, 많은 밝은 소마 포화 됩니다. 이 프레 젠 테이이 션은 많은 주차 neurites 거의 보이지 않는 렌더링 소마에 대해 동적 범위를 최적화의 대안을 선호. 빨간색 사각형으로 강조 표시 조건 스트레치 부상 실험 체 외에 대 한 최적의 간주 했다. (B) 최적의 조건에서 실리콘 막에 문화 유사 하 게 나타납니다 기존의 딱딱한 기판에 문화. 왼쪽된 패널 hiPSCNs 33,750 셀/cm2 (셀 문화 기판은 취급 하는 조직 문화 주기적 올레 공동 중합체) 기존의 엄밀한 96 잘 접시에 laminin의 3.3 µ g/mL에서 교양 보여줍니다. 오른쪽 패널 (A)에서 빨간색으로 설명 패널을 재현 합니다. 바 규모 = 100 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig4.jpg"> 그림 4 : 부상 표현 형 및 그것의 의존 laminin 농도. (A) 건강 한 문화, 10 µ g/mL laminin 및 67,500 셀/c m2를 사용 하 여. Neurites 아무 구슬과 오래 있습니다. 몇 가지 죽은 핵, 그리고 몇 덩어리 있다. (B) 문화 같은 문화 조건, 57% 피크 스트레인 부상 4 h. Neurites 단축 후 몇 군데 또는 누락 된, 그리고 일부는 구슬 (화살표로 표시). 적은 Calcein 오전-긍정적인 세포 그리고 있다 더 많은 Calcein 오전 음수가 핵 (즉, 죽은). 부상 가운데 살아남은 세포 응집을 증가 했다. (C) 부상 후 4 h, 셀 당 neurite 길이 laminin 농도에 의존 하는 방식으로 긴장 증가 함께 감소. (D) 부상 후 4 h, 세포 생존 능력 laminin 농도에 의존 하는 방식으로 긴장 증가 함께 감소. (E) 부상 후 24 h, 셀 당 neurite 길이 laminin 농도에 의존 하는 방식으로 긴장 증가 함께 감소. (F) 부상 후 24 h, 세포 생존 능력 laminin 농도에 의존 하는 방식으로 긴장 증가 함께 감소. (n = 4 당 바, 오차 막대는 ± 1 표준 편차, 스케일 바 = 100 µ m). 스트레인 값은 셔먼 외. 여 이전 게시에서 데이터를 사용 하 여 단계 변위에서 추론 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 1:는 indenter의 드로잉 기술. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 1: 사용자 정의 내장 장치. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_1-Custom_Devices-Bill_of_Materials.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 테이블 2: 96 잘 접시-로더 핀아웃 배선도. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_2-96_Well_Plate_Loader.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 1: 부상 장치의 컴퓨터 지원 설계 도면. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_1-Injury_Device-FULL_ASSEMBLY-Generic_3D.STEP" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 2: 플레이트 제작 클램프의 컴퓨터 지원 설계 도면. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_2-Press_Die-Generic_3D.STEP" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 3: 스탬프 형상, 3D 프린터와 함께 사용 하기 위해 적합 한 3D 표현. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_3-stamp.STL" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 4: SubVI MuStLiMo_si_initialize.vi, 인 motion_control.vi 위한 SubVI에 대 한. 모션에 대 한 매개 변수를 대화 상자에 항목을 변환합니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_4-compute_init_param.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 5: SubVI 여러 직선 라인 Moves_simplified.vi, 인 motion_control.vi 위한 SubVI에 대 한. 모션에 대 한 매개 변수를 대화 상자에 항목을 변환합니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_5-compute_parameters.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 6: SubVI position_tracker.vi에 대 한. 카운터 트랙 치환 선형 인코더에서 입력입니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_6-Counter-Continuous_Output.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 7: 기반 LabVIEW 프로젝트. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_7-in_vitro_neurotrauma.lvproj" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 8: 탑 이동 장치 레벨 VI. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_8-motion_control.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 9: SubVI motion_control.vi에 대 한. 접시를 뻗어 급속 한 변위를 실행 합니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_9-Multiple_Straight_Line_Moves_simplified.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 10: SubVI motion_control.vi에 대 한. 스테이지를 이동 하는 느린 변위를 실행 합니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_10-MuStLiMo_si_initialize.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 11: SubVI motion_control.vi에 대 한. Motion_control.vi 컨트롤 패널에서 (보통 언더샘플링된) 변위 역사를 플롯합니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_11-plot_displacement.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 12: 변위 역사를 기록 하는 레벨 6 톱. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_12-position_tracker.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 13: 포함 Variable2, motion_control.vi와 position_tracker.vi 사이 통신. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_13-Untitled_Library_2.lvlib" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 14: 인쇄 회로 기판에 대 한 도식. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_14-interconnector_circuit_board.dch" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 15: 인쇄 회로 보드 레이아웃. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_15-interconnector_circuit_board.dip" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

여기 선물이 외상 영향 관련 날짜 표시줄에 96-잘 형식에서 스트레치 상해의 모델 인간 생체 외에서 하는 방법. 이 기계적 모욕, 경작 및 셀 부상, 이미징, 및 상해 계량 높은 콘텐츠 분석 측정 stretchable 번호판 조작에 대 한 메서드가 포함 됩니다.

인간의 고속 스트레치 부상에 대 한 방법 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 96 잘 형식

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

method-for-high-speed-stretch-injury-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.9K 조회수.  NorthShore University HealthSystem. 여기 선물이 외상 영향 관련 날짜 표시줄에 96-잘 형식에서 스트레치 상해의 모델 인간 생체 외에서 하는 방법. 이 기계적 모욕, 경작 및 셀 부상, 이미징, 및 상해 계량 높은 콘텐츠 분석 측정 stretchable 번호판 조작에 대 한 메서드가 포함 됩니다.

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Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

연구

신경과학

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

인간 만능의 줄기 세포에서 Telencephalic Glutamatergic 뉴런의 사양

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions in newborn infants. While mosquitos are the main route of viral transmission, it has also been shown to spread via sexual contact and vertical mother-to-fetus transmission. In this latter case of transmission, due to the unique viral tropism of ZIKV, the virus is believed to predominantly target the neural progenitor cells (NPCs) of the developing brain.
Here a method for modeling ZIKV infection, and the resulting microcephaly, that occur when human cerebral organoids are exposed to live ZIKV is described. The organoids display high levels of virus within their neural progenitor population, and exhibit severe cell death and microcephaly over time. This three-dimensional cerebral organoid model allows researchers to conduct species-matched experiments to observe and potentially intervene with ZIKV infection of the developing human brain. The model provides improved relevance over standard two-dimensional methods, and contains human-specific cellular architecture and protein expression that are not possible in animal models.

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

This protocol describes a technique used to model Zika virus infection of the developing human brain. Using wildtype or engineered stem cell lines, researchers may use this technique to uncover the various mechanisms or treatments that may affect early brain infection and resulting microcephaly in Zika virus-infected embryos.

대뇌 Organoids 파생 Zika 바이러스 감염 개발 인간의 두뇌에는 생체 외에서 줄기 세포를 사용 하 여 모델링

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

성인 인간 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경의 고수익 문화의 간단한 세대

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a pre-assembled multi-compartment chip made in a cyclic olefin copolymer (COC) to compartmentalize neurons differentiated from human stem cells. The footprint of these COC chips are the same as a standard microscope slide and are equally compatible with high resolution microscopy. Neurons are differentiated from human neural stem cells (NSCs) into glutamatergic neurons within the chip and maintained for 5 weeks, allowing sufficient time for these neurons to develop synapses and dendritic spines. Further, we demonstrate multiple common experimental procedures using these multi-compartment chips, including viral labeling, establishing microenvironments, axotomy, and immunocytochemistry.

This protocol demonstrates the use of compartmentalized microfluidic chips, injection molded in a cyclic olefin copolymer to cultured neurons differentiated from human stem cells. These chips are preassembled and easier-to-use than traditional compartmentalized poly(dimethylsiloxane) devices. Multiple common experimental paradigms are described here, including viral labeling, fluidic isolation, axotomy, and immunostaining.

사전 조립된 플라스틱 미세유체 칩 내에서 인간 줄기 세포 유래 뉴런의 구획화

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model system to explore disease mechanisms and carry out high content screening (HCS) to interrogate compound libraries or identify gene mutation phenotypes. However, with human cells the transition from NPC to functional, mature neuron requires several weeks. Synapses typically start to form after 3 weeks of differentiation in monolayer culture, and several neuron-specific proteins, for example the later expressing pan-neuronal marker NeuN, or the layer 5/6 cerebral cortical neuron marker CTIP2, begin to express around 4-5 weeks post-differentiation. This lengthy differentiation time can be incompatible with optimal culture conditions used for small volume, multi-well HCS platforms. Among the many challenges are the need for well-adhered, uniformly distributed cells with minimal cell clustering, and culture procedures that foster long-term viability and functional synapse maturation. One approach is to differentiate neurons in a large volume format, then replate them at a later time point in HCS-compatible multi-wells. Some main challenges when using this replating approach concern reproducibility and cell viability, due to the stressful disruption of the dendritic and axonal network. Here we demonstrate a detailed and reliable procedure for enzymatically resuspending human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons after their differentiation for 4-8 weeks in a large-volume format, transferring them to 384-well microtiter plates, and culturing them for a further 1-3 weeks with excellent cell survival. This replating of human neurons not only allows the study of synapse assembly and maturation within two weeks from replating, but also enables studies of neurite regeneration and growth cone characteristics. We provide examples of scalable assays for neuritogenesis and synaptogenesis using a 384-well platform.

This protocol describes a detailed procedure for resuspending and culturing human stem cell derived neurons that were previously differentiated from neural progenitors in vitro for multiple weeks. The procedure facilitates imaging-based assays of neurites, synapses, and late-expressing neuronal markers in a format compatible with light microscopy and high-content screening.

신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human neurons, which may contribute to neurodegeneration in various disease states. Although it is challenging to examine mitochondrial dynamics in live human nerves, such paradigms are critical for studying the role of mitochondria in neurodegeneration. Described here is a protocol for analyzing mitochondrial transport and mitochondrial morphology in forebrain neuron axons derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). The iPSCs are differentiated into telencephalic glutamatergic neurons using well-established methods. Mitochondria of the neurons are stained with MitoTracker CMXRos, and mitochondrial movement within the axons are captured using a live-cell imaging microscope equipped with an incubator for cell culture. Time-lapse images are analyzed using software with &#34;MultiKymograph&#34;, &#34;Bioformat importer&#34;, and &#34;Macros&#34; plugins. Kymographs of mitochondrial transport are generated, and average mitochondrial velocity in the anterograde and retrograde directions is read from the kymograph. Regarding mitochondrial morphology analysis, mitochondrial length, area, and aspect ratio are obtained using the ImageJ. In summary, this protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology to facilitate studies of neurodegenerative diseases.

Impaired mitochondrial transport and morphology are involved in various neurodegenerative diseases. The presented protocol uses induced pluripotent stem cell-derived forebrain neurons to assess mitochondrial transport and morphology in hereditary spastic paraplegia. This protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology, which will facilitate the study of neurodegenerative disease.

유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...