오늘 우리가 시연 할 방법은 COVID-19 감염과 관련된 항체의 혈청 전환을 평가하거나 일상적인 분석을위한 예방 접종을위한 높은 처리량 솔루션을 제공합니다. 흥미롭게도,이 접근법은 우리가 동일한 분석물 상의 다중 에피토프를 평가할 수있게합니다. 이것은 세포 신호 연구 및 면역 반응 모니터링을 포함하여 생물 과학에서 수많은 응용 프로그램을 가지고 있습니다.
오늘 당신을 위해이 기술을 시연하는 것은 내 실험실의 박사 후 연구원 인 Imad Tarhoni 박사가 될 것입니다. 시작하려면 고유 한 비드 영역을 가진 자기 미소 구체의 세 가지 다른 바이알을 선택하고 사용 된 각 바이알에 대한 비드 ID 및 로트 정보를 기록하십시오. 이어서, 선택된 미소 구체 스톡을 60초 동안 와류시키고, 5분 동안 초음파 처리한다.
여섯 개의 비드를 1.5 밀리리터 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브에 1.0 배 10 번 옮기고 튜브를 자기 분리기에 삽입하십시오. 60 초 동안 분리를 허용한다. 튜브를 자기 분리기에 가만히 두고, 비드 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.
자기 분리기에서 튜브를 제거한 다음 100 마이크로리터의 HPLC 등급 물과 와류로 비드를 30초 동안 재현탁시켰다. 다시 튜브를 60초 동안 자기 분리기에 다시 넣고 상층액을 제거합니다. 세척 프로토콜을 두 번 반복하십시오.
마지막 세척 후, 자석 분리기로부터 튜브를 제거하고, 세척된 미소 구체들을 90 마이크로리터의 활성화 완충액, pH 6.2에 재현탁시키고, 30초 동안 와류시켰다. 다음으로, 미소 구체를 10초 동안 와류하여 밀리리터 당 50밀리그램의 10 마이크로리터의 anhydroxy-sulfosuccinamide 및 밀리리터 당 50 밀리그램의 EDC 용액 10 마이크로리터로 순차적으로 처리한다. 나중에, 미소 구체들을 실온에서 20분 동안 10분마다 온화한 와류로 인큐베이션한다.
인큐베이션 후, 앞서 기술한 바와 같이, 미소 구체를 50-밀리몰 MES 또는 커플링 완충액, pH 5.0으로 두 번 세척한다. 세탁을 두 번 반복하십시오. 완료되면 자기 분리기에서 튜브를 제거하고 비드를 100 마이크로 리터의 커플링 버퍼로 30 초 동안 와류하여 재현탁시킨 다음 즉시 원하는 양의 단백질을 튜브에 첨가합니다.
커플링 버퍼를 사용하여 총 부피를 150 마이크로리터로 가져오고 30초 동안 와류에 의해 반응물을 혼합한다. 이어서, 튜브를 실온에서 회전시켜 두 시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 미소 구체를 PBS 켄치 완충액으로 두 번 세척하고, 세척된 미소 구체를 30초 동안 와류에 의해 0.05% 나트륨 아지드를 함유하는 담금질 완충액 100 마이크로리터에 재현탁시켰다.
자동화된 세포 계수기를 사용하여 회수된 미소 구체의 수를 계수하고 관찰된 비드 농도를 기록한다. 분석 성능을 위해, 결합된 미소 구체들을 30초 동안 와류에 의해 재현탁시키고, 60 내지 90초 동안 초음파 처리한다. 이어서, 각각의 튜브로부터 각각의 비드 콜로이드의 필요한 양을 제거하고, 비드 콜로이드를 새로운 1.5-밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 결합시킨다.
다음으로, 튜브를 자기 분리기에 넣고 60 초 동안 분리하십시오. 튜브를 자기 분리기에 여전히 넣고 비드 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하십시오. 세퍼레이터로부터 비드를 제거한 후, 비드를 100 마이크로리터의 분석 완충액에 재현탁시킨다.
튜브를 60초 동안 자기 분리기에 넣기 전에 30초 동안 소용돌이 치며 비드를 분리하였다. 세탁을 두 번 반복하십시오. 다음으로, 적절한 부피의 분석 완충액을 첨가하여 삼중계 작동 마이크로스피어 혼합물의 농도를 조정하여 각 표적에 대해 하나의 마이크로리터당 100마이크로스피어의 최종 농도를 생성한다.
25 마이크로리터의 마이크로스피어 혼합물을 96-웰 플레이트의 각 웰에 분취한다. 혈장 또는 혈청 표본을 분석 완충액에 500배 희석하고 원하는 적정에 따라 표준 표본을 준비합니다. 25 마이크로리터의 분석 완충액을 빈 샘플로 첨가하고, 희석된 각각의 시편 또는 표준을 96-웰 시편 플레이트의 각각의 지정된 웰에 첨가한다.
완료되면 플레이트를 알루미늄 씰 또는 호일로 덮고 분당 700회 회전으로 설정된 플레이트 진탕기 상에서 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션한다. 원고에 기재된 바와 같이 분석 완충액으로 마이크로리터당 네 마이크로그램의 항인간 검출 항체 또는 이차 항체 용액의 용액을 준비한다. 플레이트를 자기 분리기 위에 올려 놓고 빠르게 씻은 다음 플레이트를 생체 위험 용기 위로 강제로 뒤집어 웰에서 액체를 제거하십시오.
접시가 여전히 거꾸로 된 상태에서 두꺼운 종이 덩어리에 대해 접시를 강제로 누릅니다. 그런 다음, 각 웰을 100 마이크로리터의 분석 완충액으로 세척하고, 생물학적 위험 용기 위에 강제 역전시켜 액체를 제거한다. 세척을 두 번 반복하십시오.
마지막 세척 후, 사용 된 모든 종이 덩어리를 생물 위험 용기에 버리십시오. 다음으로, 25 마이크로리터의 이차 항체 작동 용액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 분당 700회 회전으로 플레이트 진탕기 상에서 인큐베이션한다. 30분의 인큐베이션 후에, 플레이트의 웰을 앞서 입증된 바와 같이 분석 완충액으로 두 번 세척한다.
이어서, 100 마이크로리터의 분석 완충액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 플레이트 진탕기 상에서 다섯 분 동안 인큐베이션한다. 시스템 설명서에 따라 계측기 분석기를 통해 60마이크로리터 샘플을 분석합니다.
시편 포획 인큐베이션 시간의 최적화를 위해, 플레이트를 30분, 60분 및 120분의 지속 시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 분석기 상에서 60 마이크로리터의 분석 혼합물을 분석한다. 1:5 연속 희석 시리즈에 기초한 7-포인트 표준 곡선을 스파이크 S1, 막 항체, 및 뉴클레오캡시드에 대해 평가하였다.
플레이트 상에서 인트라-어세이 정밀 검정을 수행하여 변동 퍼센트 계수, 표준 편차 및 평균으로서 계산된 분석 정밀도를 평가하였다. 인터-어세이 정밀도를 위해, 비드 세트의 세 개의 별개의 배치가 각각의 검정에 대해 준비되었다. 표준 및 인간 혈장 샘플을 사용한 검정의 정밀 변수를 계산하였다.
인큐베이션의 120분에서의 평균 중간 형광 강도 값은 스파이크 S1, 막, 및 뉴클레오캡시드 항체에 대한 IgG 역가에 대해 최적이었으며, 이는 빠른 1차 항체 결합 동역학을 나타낸다. 이중 채널 성능의 이차 항체 농도 최적화는 모든 농도에 대한 선형 측정에서 광범위한 신호를 입증했습니다. 이차 항체의 상이한 시간 인큐베이션으로부터의 관찰된 신호 및 모든 인큐베이션 시간에 대한 신호 변화에 대한 세부사항이 여기에 도시되어 있다.
이중 채널 분석에 대한 특이성 평가에서, 블랭크와 단일 리포터 채널 사이에서 무시할 수 있는 교차 신호 오염이 관찰되었다. COVID 19 백신 접종 후의 혈청 전환 사건의 그림에서, 관찰된 스파이크 S1 IgA 및 IgM 값은 IgG 이소형의 역가보다 약 40배 낮았다. 이 방법은 면역 저하 된 개인의 백신에 대한 반응을 모니터링하는 데 중요한 영향을 미칩니다.
이 환자들이 진정으로 예방 접종에 의해 보호되고 있는지 여부를 결정할 수있게 해줄 것입니다.
