이 작품은 INSERM, 릴 2의 대학에 의해 지원되었다, MEDIALZ, LabEx (우수 실험실, 프로그램은 미래에 대한 투자) 및 DISTALZ (알츠하이머 병에 대한 학문적 접근을위한 혁신적인 전략의 개발). FJ.FG 현재 ANR (프랑스 국립 연구 기관 / NeuroSplice 드 타우 01 인텔리 ANR-2010-BLAN-1114)의받는 사람의 교제이지만,이 작품은 JCCM (스페인)에서 교부금의 지원 아래도했다.

1. 균질화 및 인간과 쥐의 뇌 조직에서 총 단백질 추출 <ol><li> 뇌 조직 균질화. (인간의 샘플) 도공 유리 또는 (쥐 샘플) 테플론 균질화를 사용하여 뇌 조직의 10 % (W / V) 8 M 요소에, 2 M 티오 및 W / V SDS 버퍼 (UTS) 1 % 균질화한다. 60 Hz에서 전체 조직의 분해 (13, 14)에 0.5 초를 적용하는 초음파 발생기 (30) 펄스에서 초음파 처리. <ol><li> 표준으로 BSA를 사용하여, 브래드 포드 분석과 단백질 농도를 결정합니다. 이 버퍼 추출만큼 해물이 의해 carbamylation (15)을 방지하기 위해 가열 오버하지 않기 때문에 하나의 차원 SDS-PAGE와 완전히 호환되는 UTS. </li><li> 1 %를 추가 (W / V) 앰버의 실온에서 10 분 동안 부드러운 혼합으로 품어. 그 후 0.22 μm의 주사기 필터로 필터링하고 마지막 요소 / 티오 우레아 용액에 SDS를 추가합니다. 이 단계는 equilibr에 요산 및 이소시 산의 양을 감소시킨다솔루션의 요소와 IUM 및 분해를 촉진한다. </li></ol></li><li> 클로로포름 / 메탄올 단백질 침전. (독립적으로 IEF를 수행하기 위해 선택한 pH 범위에) 18 센티미터 사람을 위해 11cm IPG 스트립과 1.5 밀리그램 단백질 ㎍의 100 ~ 150 사이를 침전. <ol><li> 얼음 또는 4 ° C에서 모든 단계를 수행 침전 절차를 시작하기 전에 30 분 동안 4 ° C에서 멋진 클로로포름, 메탄올. </li><li> UTS 용 해물의 하나의 볼륨에 메탄올 세 권 클로로포름 하나의 볼륨을 추가합니다. 수동으로 혼합물을 흔들어 냉수 세 볼륨을 추가합니다. 1 분 동안 4 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에서 원심 분리하여 단백질을 펠릿 소용돌이 </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층 액을 버리고 차가운 메탄올의 세 볼륨을 추가합니다. 다시 소용돌이와 4 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기 마지막으로 뜨는을 취소하고 N 2에서 펠렛을 건조. </li></ol></li><li> 2D 분석을위한 단백질의 제조.2D-버퍼 단백질 건조 펠릿 (8 M 우레아, 4 % CHAPS로 보충 2 M 티오 우레아)을 재현 탁. 위에 표시된대로 앰버와 솔루션을 씻고 2D-DIGE 용 2D 버퍼 200 μL 당 단백질 500 μg의 비율을 유지하려고합니다. 참고 : 2D 버퍼가 -80 ° C에 저장하거나 (요소 저하를 방지하기 위해) 일주 동안 4 ° C로 유지 될 수있다. <ol><li> 초음파 처리하고 다음 단계를 수행 할 때까지 -80 ° C에서 샘플을 저장합니다. 단백질의 포름산 가용화 10를 집계 후 주목할,이 프로토콜이 사용될 수있다. 간단히, N 2하에 포름산을 증발 바와 같이 펠렛을 재현 탁. </li></ol></li></ol> 2. 2D-DIGE <ol><li> 샘플의 품질을 테스트합니다. 다시 도즈 샘플 브래드 퍼드 방법을 사용. LDS 샘플 버퍼, 열 37 ° C (15)에서의 단백질의 15 μg을 희석 4-12 % 년 폴리 아크릴 아마이드 젤에로드합니다. </li><li> 쿠마시 염색. 0.1 %의 폴리 아크릴 아마이드 젤 얼룩 (w / v)의 쿠마블루 G-250, 50 %의 EtOH 및 10 %, 적어도 1 시간 동안 (v / v) 아세트산 용액. 배경이 7 % 아세트산 및 10 % (v / v) 에탄올 수용액에 하룻밤 destain하자. </li><li> 샘플의 사전 전기 영동 표시. 이전 시아닌 염료 라벨을 수행하는, N-하이드 록시 대체 기본 pH에서 더 효율적이고 pH가 8.6에서 최적으로 주어진부터 기본 또는 중립이어야한다 시료의 pH를 확인합니다. <ol><li> 50 μg protein/400 pmol의 염료의 비율과를 Cy3 또는 Cy5의 형광 염료 연구의 최소한 두 개의 샘플을 라벨과 프로톤 아민과 시아닌의 NHS 에스테르 반응 그룹을 용이하게하기 위해 어둠 속에서 4 ° C에서 1 시간 동안 유지 라이신의 그룹. </li><li> 특히 시아닌 한 시료의 우대 커플 링을 방지를 Cy3와 Cy5에 염료와 크로스 라벨을 만드는 샘플 변형을 줄일 수 있습니다. 시아닌 염료 라벨링 PR 최소한 1 μg의 비율을 유지하면서 단백질 소량 위해 적응 될 수 있음을 유의8 pmol의 시아닌 염료 당 otein. 그렇다면, 미니 2DE 시스템 대신 대형 2D 젤 시스템에 사용될 수있다. 이는 뇌 조직의 소량 2D-DIGE 분석을 가능하게 할 것이다. </li><li> CY2 형광 염료와 동일한 양의 단백질 (총 50 μg)과 함께 두 샘플의 풀을 라벨과 내부 표준 물질로 사용된다. 이전에 나타낸 바와 같은 조건을 사용한다. </li><li> 1.1 %의 Destreak 시약, IPG 버퍼의 1.2 % 및 브로 모 페놀 블루 라벨 단백질의 총 150 μg (CY2 50 μg, CY2 50를 Cy3 ㎍의 50 μg)의 흔적을 포함하는 2D 버퍼와 총 부피 350 μL에 완료. 4 개의 독립적 인 스트립을 사용하여 사통에서이 단계를 수행합니다. 또한, 예비 젤에 대한 단백질의 350 ~ 450 μg과 두 개의 추가 비 표지 스트립 (각 샘플에 대해 하나)을 준비합니다. </li><li> 수동 재수 미네랄 오일 하룻밤 덮여 여섯로드 스트립을 남겨주세요. </li></ol></li><li> Isoelectrofocusing. (20)에서 IEF을 수행6, C. pH가 3-11NL의 경우 18 cm의 프로토콜을 제거합니다 : 최대 전류 설정은 8 단계에서 50 μA / 스트립입니다 : 1) 150 V 1 시간 동안 단계, 2) 200 V 5 시간, 3) 500 V 그라데이션 단계 2 시간, 2 시간 4) 1,000 V의 그라데이션, 5) 2,000 V 2 시간 동안 그라데이션, 6) 4,000 V 2 시간 동안 그라데이션, 7) 8,000 V 2 시간 8) 24,000 V의 총에 대한 그라데이션 · 시간 단계 . IEF 후, 크로마토 그래피 페이퍼를 사용하여 미네랄 오일의 과잉을 파견 및 제 사이즈까지 -20 ° C에서 스트립을 저장한다. </li><li> IPG는 평형을 제거합니다. 같은 버퍼에 요오도 아세트 아미드 4.7 %로하지만, DTT없이 6 M 요소, 2 % SDS, 30 % 글리세롤, 50 MM 트리스 - 염산 pH를 15 분 동안 DTT의 1 %와 8.6 버퍼와 후 스트립을 평형. </li><li> 두 번째 차원 또는 SDS-PAGE 전기 영동. 6 ~ 12 % SDS-PAGE 젤 (1.5 M 트리스 - 염산의 pH 8.6, 12 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드, 0.1 % (W / V) SDS, 0.072 % (W / V) APS 0.1 % (V / V)을 확인 TEMED ) STRI 네 낮은 형광 유리판으로, 대형 2D 시스템을 사용하여 동시에단백질 반점을 절제하기 위해 예비 젤에 대한 두께 1.5 mm의 형광 샘플 및 두 개의 다른 유리 접시와 PS. <ol><li> (w / v) 아가로 오스의 0.5 %와 젤의 상단에 레이어드를 통해 여섯 IPG 스트립을로드합니다. 실행 버퍼는 25 mM 트리스, 192 mM의 글리신, 0.1 % (W / V) SDS로 구성되어있다. 4 ° C 16, 17로 설정 냉동 시스템 야간에 2.5 W / 젤에서 마이그레이션을 수행하십시오. </li></ol></li><li> 형광 이미지 획득 및 분석. 형광 젤 이미지 (하나의 실험에 대한 12 이미지)를 얻기 위해 태풍 9400 스캐너를 사용합니다. 스캔 CY2, 520분의 488 nm의 580분의 532 nm의 670분의 630 nm의 여기 / 방출 파장, 각각 각 젤를 Cy3와 Cy5에 이미지. 이미지를 분석하는 INFORMATIC 소프트웨어를 사용합니다. 데이터 공부 두 샘플 간의 네 겔 걸쳐 신호의 분포와 연관된 스폿 볼륨의 변동을 반영한다. </li><li> 큰 젤에 대한 쿠마시 염색. 5에 예비 젤 수정0 % (V / V)을 EtOH 3 %에서 최소 24 시간 동안 (V / V) 오르토 인산 솔루션을 제공합니다. 그런 후, 20 분 동안 매우 순수한 물로 2 회 세척한다. 34 %에 착색을 수행합니다 (v / v)의 메탄올, 17 % (W / V) 암모늄 황산 (w / v)의 쿠마시 블루 G-250 0.1 %를 추가하기 전에 1 시간 동안 2 % 오르토 인산. 최소 48 시간 초순수에 탈색을위한 색채 젤을 유지합니다. <ol><li> MS의 식별을위한 관광 명소입니다. 형광 이미지를 분석하면, 소프트웨어는 식 통계적 다른 스폿의리스트를 제공한다. 수동으로 예비 젤에서 이러한 장소를 절제. 이 절차는 각질 오염을 피하기 위해 약간의 연습과 손재주를 필요로한다. 다음 샘플은 MS로 전송 될 때까지 -20 ° C에서 물에 보관하실 수 있습니다. 스팟 식별 탠덤 질량 분석 (MS / MS)와 단백질 정체성의 관련성과 완벽하게 호환되는이 확률 0.05 (P &lt;0.05) (18)의 P-값을 계산 기반 Mowse 점수에 따라 판단된다. </li> &lt;/ OL&gt; </li></ol> 3. 질적 미니 2DE 분석 실험 <ol><li> 2D 버퍼의 단백질 시료의 최대 100 μg을 재​​현 탁 11cm의 IPG 스트립 200 μL의 최종 볼륨까지. 과발현 시스템 또는 정제 된 단백질의 경우, 시작 양은 20 μg으로 낮출 수있다. </li><li> 200 μL의 최종 볼륨 (V / V) Destreak 시약, 0.55 % (V / V) IPG 버퍼와 브로 모 페놀 블루의 흔적을 1.1 %를 추가합니다. 그런 다음, 소용돌이, 빠른 스핀을 밤새 미네랄 오일이 덮여 (원래의 두께로 지구를 가져) 수동 수분 보충을 위해 IPG 스트립에로드합니다. 참고 : IPG 버퍼의 비율이 원하는 산도 (pH를 3-11, 4-7, 7-11, 등)의 모든 구간에 대해 동일하지만, 그 조성물 선택된 pH 범위의 함수로 변화한다. </li><li> Isoelectrofocalisation. 20 ° C에서 IEF를 수행 프로그램의 지속 기간은 선택된 산도 간격에 의존한다. 주목할만한, 그런 electroendosmosis는 IEF 프로필을 방해 할 수와 같은 이러한 경우에 매개 변수,electrofocalisation 시간 최적화는 19이 필요합니다. 주 : 반드시 더 나은 결과를 제공하지만, IEF의 시간을 단축하는 것도 해상도를 향상시킬 수있다 이상 IEF 아니다. IEF 후, I​​PG 스트립 개월 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> IPG는 평형을 제거합니다. 25 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 20 mM의 DTT, 10 % 글리세롤, 5 % SDS, 0.05 % 브로 모 페놀 블루를 함유하는 완충액에 스트립을 평형화. 세 가지 평형이 각 화장실 사이의 완충 용액을 변화와 함께 15 분 동안 목욕합니다. </li><li> SDS-PAGE. 관심의 단백질의 분자량에 따라 선택 폴리 아크릴 아미드의 비율로 프리 캐스트 젤 (IPG +1 아니라, 11cm의 IPG 스트립)에 IPG 스트립 레이어. 그 후, 33 분 동안 100 MV에 니트로 셀룰로오스 / PVDF 멤브레인 상에 겔을 가릴. </li><li> 필요한 항체를 밤새 품어 과산화 효소 활성에 의해 시각화. 이차 항체에 의해 밝혀 관련이없는 폴리 펩타이드를 사용하여 면역 블롯의 정렬을 수행합니다. 반으로 Quantit 도달ImageJ에 소프트웨어를 추적 / 반점의 볼륨과 강도의 농도계에 의해 분석는 ative. </li></ol>

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D., Marcus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+advancement+of+neuroproteomics.">Multidimensional advancement of neuroproteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).</li><li>Hernandez-Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+dystrophy+CTG+expansion+affects+synaptic+vesicle+proteins,+neurotransmission+and+mouse.">Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse.</a> 136, 957-970 (2013).</li><li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+staging+of+synucleinopathy+and+amyloid+deposition+in+dementia+with+Lewy+bodies.">Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).</li><li>Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+is+a+pathological+event+not+associated+with+impairment+of+proteasome+function.">Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function.</a> J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+beta-amyloid+peptide+species+in+pre-clinical+Alzheimer's+disease+as+new+targets+for+the+vaccination+approach.">Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach.</a> J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).</li><li>Le Freche, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+phosphorylation+and+sevoflurane+anesthesia:+an+association+to+postoperative+cognitive+impairment.">Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment.</a> Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).</li><li>Leboucher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effects+of+diet-induced+obesity+on+tau+pathology+are+independent+of+insulin+resistance+in+tau+transgenic+mice.">Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice.</a> Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).</li><li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+neuropathological,+and+biochemical+characterization+of+the+novel+tau+mutation+P332S.">Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S.</a> J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).</li><li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue.">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).</li><li>Bell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+a+twenty-first+century+brain+bank:+experience+in+the+BrainNet+Europe+consortium.">Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium.</a> Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).</li><li>Crecelius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+quantitative+post-mortem+changes+in+the+gray+matter+of+the+human+frontal+cortex+proteome+by+2-D+DIGE.">Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE.</a> Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).</li><li>Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+human+postmortem+brain+using+2-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+(2-D+DIGE).">Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE).</a> Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).</li><li>Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+difference+gel+electrophoresis.">Two-dimensional difference gel electrophoresis.</a> Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).</li><li>Tannu, N. S., Hemby, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+for+comparative+proteomics+profiling.">Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling.</a> Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).</li></ol>

저자는 선언하는 어떠한 이해 관계가 없습니다.

단백질의 병리학 적 발현 변화를 발견, 생체에 대한 검색 및 약물 표적에 대한 잠재적 인 경로의 변조 neuroproteomics의 목적 중입니다 (30)에 접근한다. 새로운 도구 가운데, 2DE 필드는 유망한 expectative을 추가합니다. 그럼에도 불구하고, 합의 변동을 최소화하고 실험의 재현성을 높이기 위해 도달되어야한다. 이 아이디어의 라인에서 2D-DIGE (그림 2)와 모노 차원 면역 블롯과 완벽?...

정신 및 신경 장애는 질병의 글로벌 부담의 13 %를 나타냅니다, 병태 생리 학적 메커니즘, 위험 요소 및 구성 (prodromal) 바이오 마커와 같은 새로운 도전 1 탐구해야합니다. 이 목적에 부합하는, 인간의 뇌의 단백질 체학 연구는 생리에 대한뿐만 아니라 병적 인 조건뿐만 아니라 메모리, 행동, 감정과 예를 들어 신경 세포의 가소성, 같은 프로세스에 관련된 분자 경로를 발견하기 위해 필수가됩니다. 따라서, 동물 모델의 사용 및보다 구체적으로 형질 전환 마우스는 인간의 신경 퇴행성 질환의 병인이 모방하는 광범위한 가능성을 가져온다. 프로테오믹스 방법은 신경 과학 분야에서 이러한 새로운 관점을 달성하기 위해 요즘 사용할 수 있습니다. 이차원 전기 영동 (2DE)는 시료의 넓은 범위의 프로테옴을 비교할 수 유력한 것으로 간단한 방법이다. 또한,도식별하기 위해 복잡한 혼합물로부터 단백질을 분리하고 추가로 질량 분석법에 의해 분석하기위한 강력한 방법. (IEF)을 isoelectrofocusing하여 자신의 등전점 (PI)에 따라 1) 단백질의 분리 :이 기술은 기본적으로 두 개의 연속적인 단계로 구성되어 있습니다. 보다 정확하게는, 전위의 pH 구배 구비 immobiline 아크릴 아미드 스트립을 가로 질러인가 된 후 단백질은 이주 및 글로벌 넷 충전 기능 판정의 pI에 초점을 맞출 것이다. 2) Isoelectrically 집중된 단백질은 첫 구조하여 단백질이 SDS-PAGE (3)에 의해 그들의 겉보기 분자량 (MW)에 따라 구분되며) 변성하고 부정적인 도데 실 황산나트륨 (SDS의 첨가에 의해 부과. 이 두 가지 속성은 우리가 프로테옴의 연구에 더 갈 수있는 두 값을 해결 할 수 있습니다. 한편이 방법은 최소한의 염료 2D-DIGE 방법을 사용하여 정량 분석​​을 수행 할 수있는 가능성을 제공하고, 반면에 qualitativ미니 2DE에 의해 전자의 분석은 웨스턴 블로 팅에 결합. 2D-DIGE에 의한 정량 분석​​ 단백질 발현은 모든 샘플의 프로테옴에 변경 수여한다. 간단히 샘플은 세 개의 서로 다른 파장 (블루, 그린, 레드)에 발광 세 시아닌 (CY2,를 Cy3와 Cy5에)로 표시되어 있습니다. N-히드 록시 숙신 이미 딜 에스테르기를 함유 한 불소 최소한 염료는 공유 결합, 아미드 결합 소재 얻어진 단백질의 리신 잔기의 ε-아미노 그룹과 반응한다. 리신 잔류 물은 1 ~ 3 % 사이 따라서 단백질에 여러 라벨 또한 주요 그물 충전 수정 5, 6을 방지 표시되어 있습니다. 를 Cy3와 Cy5에 자주 CY2 비교할 샘플의 동일한 비율의 혼합에 태그를하는 동안 두 개의 독립적 인 샘플을 레이블로 사용됩니다. 두 가지 주요 이점은 모든 표지 샘플 혼합하고 IEF 및 SDS-PAGE 젤이 비교에 의한 실험들 간 변동을 피하기 위해, 각 단계에 대해 한 번에 한 겔에서 실시되어있다. 또한, 단백질 7의 약 1 femtomole의 높은 탐지 임계 값을 제공한다. 젤 스캔 및 2D 소프트웨어는 CY2는 질량 분석에 의해 그들의 후방 식별을위한 관광 명소 중 통계적 차이의 식별을 허용하는 내부 표준으로 제공하는 2D 겔의 형광 이미지를 비교하고 있습니다. 내부 표준을 사용하여 2 차원 분석 소프트웨어 통계적 신뢰도 8의 95 % 이상과 샘플 사이의 차이의 10 % 미만의 빠른 검출을 달성한다. 미니 2DE 질적 분석은 단백질 특성 분석을위한 중요한 단계입니다. 원리는 이전 pi에서 MW 분리 설명한 것과 동일하지만,이 경우에는 단백질이 막에 작은 폴리 아크릴 아미드 겔로부터 전송 및 면역 블 롯팅은 나중에 수행된다. 하나의 차원 겔 전기 영동은 하나의 항체 기능, 정보 출력 여러 단백질 에피토프에 대한 단백질 발현의 변화를 제공하는 반면미니 2DE에서 북쪽으로 두 개의 추가 매개 변수를 부여한다. 첫째, 단백질 isovariants은 번역 후 변형이 일어날 수 있음을 나타내는 파이의 기능에 변경합니다. 둘째, 질량 분석 식별 그럴듯 zymogens과 단백질의 이화 작용 제품을 나타낼 수있다. 따라서, 2D-DIGE 관찰 수정이 글로벌 프로테옴 프로파일의 변화를 기본 메커니즘을 나타내는 것 같다. 미니 2DE하여 동일한 단백질 에피토프 / S에 대한 몇 가지 샘플들 사이 면역 블롯의 선형은 산도가 약간 관찰 번역 후 변형에 빛을 흘리는 변경 또는하지 monodimensional 면역 블롯 (9, 10)에 의해 반영 될 수 있습니다. 또한,이 분석은 대사 잔기 11,12의 파이 및 MW의 기술에 의한 전위 절단 부위에 대해 알려준다. 이들 두 기술의 조합은 상보 단백질 체학 분석을 제공한다. 한편 2D-DIGE은 일반 가르치시표정이 다른 폴리 펩타이드의 정확한 분리를 허용 차이의 전자. 이러한 차이는 지점 또는 형광 젤의 소프트웨어 분석에 의해 주어진 하나의 강도의 증가 / 감소의 비 표시로 기본적으로 구성되어 있습니다. 그러나, 그 자체로 이러한 관찰은 관찰 변형 예의 본질을 설명 할 확률이다. 의 isovariant / 이소 형 수준의 변화 : 폴리펩티드를 단리하고 질량 분석에 의해 식별되면 이러한 이유로, 미니 2DE의 사용)는 정확하게 하나를 확인하기 위하여 절연 단백질의 정체성과 차이의 2) 자연있게 예를 들어 표현, 번역 후 변형 및 절단 과정. 그러나, 매우 비슷하다 추출 프로토콜의 사용으로 인해 잠재적 분산액을 제한하기 위해 2D-DIGE 가진 미니 2DE 호환 모두 시작 용해 완충액을 개발하는 것이 필요하다. 본 문서에서는, 우리는 드2D-DIGE 인간 및 마우스 조직에서 오는 뇌 단백질 미니 2DE 기술의 준비, 추출 및 성능에 대한 적응 프로토콜을 스 크라이 빙.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="709">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">25-8010-65</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Immobiline DryStrip</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval/size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPG Buffer, pH X-X</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval desired</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1&#160;</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">551797N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td>17-1335-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KIT BOX IPG 1 * 1 KIT</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9334-92</td>
			<td>Plastic box to make the passive rehydration&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">MILLEX GS Filter</td>
			<td style="width:113px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the MW to separate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPGphor III Isoelectric Focusing Unit</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">11-0033-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Ettan DALTsix Large Electrophoresis System</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">80-6485-08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">P2D1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

consensus brain-derived protein, extraction protocol for the study of human and murine brain proteome using both 2d-dige and mini 2de immunoblotting

이차원 전기 영동 (2DE)는 잠재적으로 다른 생리적 또는 병리 적 조건과 관련 프로테옴 수정 사항을 발견 할 수있는 강력한 도구입니다. 기본적으로,이 기술은 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 제 1 단계에서 그들의 등전점에 따라 단백질을 분리하고, 둘째 그 분자량에 따른에 기초한다. 이 보고서에서 인간의 사후와 마우스 뇌 조직의 작은 금액에 대한 최적화 된 샘플 준비 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법은 두 개의 차원 형광 차이 겔 전기 영동 (2D-DIGE) 미니 2DE의 면역 블롯을 수행 할 수 있습니다. 이러한 접근 방식의 조합은 하나의 질량 분석 검출과의 호환성 발현 덕분에 새로운 단백질 및 / 또는 단백질의 변형을 찾을뿐만 아니라 수 있지만, 또한 마커 검증에 새로운 통찰력. 따라서, 미니 2DE은 포스트를 확인하고 검증하기 위해 서부 블로 팅 허가에 결합번역 후 수정, 단백질 이화 작용과 다른 조건 및 / 또는 치료 사이에 질적 인 비교를 제공합니다. 여기서, 우리는 아밀로이드 - 베타 펩티드와 알파 synuclein으로 AD와의 Lewy 몸 치매에있는 단백질 집합체의 구성 요소를 공부하는 방법을 제공한다. 우리의 방법은 이와 같이 프로테옴의 분석을 위해 적응 될 수 불용성 단백질은 인간의 뇌 조직 및 마우스 모델에서 추출한다. 병렬에서는 퇴행성 신경 질환뿐만 아니라 잠재적 인 새로운 바이오 마커 및 치료 표적에 관련된 분자 및 세포 경로의 연구를위한 유용한 정보를 제공 할 수 있습니다.

제공된 이상적인 버퍼 단백질의 100 %, 특히 막 - 연관 또는 세포 골격 단백질을 복구하기 위해 존재하지 않기 때문에 뇌 조직에 프로테오믹스 도전 남아있다. 실험의 첫 번째 세트는 단백질의 대형 패널을 복구 할 수 있도록 두 개의 접근법과 호환 적합한 용해 버퍼의 검색에 집중 하였다. 따라서, 세 용해 버퍼는 가장 적절한 하나를 결정하기 위해 분석 하였다. 첫째, 그것은 1 %와 10 밀리미터 (W / V)...

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Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

인간과 쥐의 뇌 조직을위한 요소 / 티오 / SDS 버퍼를 사용하는 일반적인 단백질 추출 프로토콜은 허용 2D-DIGE 미니 2DE의 면역 블롯에 의해 그들의 연속 특성에 의한 단백질의 indentification. 이 방법은 인간의 조직 검사 및 실험 모델에서 더 많은 재현성 및 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 하나를 할 수 있습니다.

합의 뇌 유래 단백질, 2D-DIGE 미니 2DE 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

consensus-brain-derived-protein-extraction-protocol-for-study-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.9K 조회수.  Inserm UMR 837.  인간과 쥐의 뇌 조직을위한 요소 / 티오 / SDS 버퍼를 사용하는 일반적인 단백질 추출 프로토콜은 허용 2D-DIGE 미니 2DE의 면역 블롯에 의해 그들의 연속 특성에 의한 단백질의 indentification. 이 방법은 인간의 조직 검사 및 실험 모델에서 더 많은 재현성 및 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 하나를 할 수 있습니다. 

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TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS : 연약한 X 증후군 및 자폐증과 개인의 소성의 Mechasnism를 탐험하는 세타 - 버스트 프로토콜을 사용하여

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

연구

신경과학

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

연속 신경 근육 분기점에서 싱글 Schwann 세포를 윤곽을 그리다하는 사진 표백

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

New Methods to Study Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons (GRNs) detect tastant molecules, they encode information about the identity and concentration of the tastant as patterns of electrical activity that then propagate to follower neurons in the brain. These patterns constitute internal representations of the tastant, which then allow the animal to select actions and form memories. The use of relatively simple animal models has been a powerful tool to study basic principles in sensory coding. Here, we propose three new methods to study gustatory coding using the moth Manduca sexta. First, we present a dissection procedure for exposing the maxillary nerves and the subesophageal zone (SEZ), allowing recording of the activity of GRNs from their axons. Second, we describe the use of extracellular electrodes to record the activity of multiple GRNs by placing tetrode wires directly into the maxillary nerve. Third, we present a new system for delivering and monitoring, with high temporal precision, pulses of different tastants. These methods allow the characterization of neuronal responses in vivo directly from GRNs before, during and after tastants are delivered. We provide examples of voltage traces recorded from multiple GRNs, and present an example of how a spike sorting technique can be applied to the data to identify the responses of individual neurons. Finally, to validate our recording approach, we compare extracellular recordings obtained from GRNs with tetrodes to intracellular recordings obtained with sharp glass electrodes.

We present three new methods to study gustatory coding. Using a simple animal, the moth Manduca sexta (Manduca), we describe a dissection protocol, the use of extracellular tetrodes to record the activity of multiple gustatory receptor neurons, and a system for delivering and monitoring precisely timed pulses of tastants.

새로운 방식으로 맛보기 코딩 공부하기

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

Drosophila 섬 분석 결과에서 운전 행동의 높은 처리량 분석

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Extraction and Dissection of the Domesticated Pig Brain

Use of the pig as a preclinical and translatable animal model has been well-documented and accepted by research fields investigating cardiovascular systems, gastrointestinal systems, and nutrition, and the pig is increasingly being used as a large animal model in neuroscience. Furthermore, the pig is an accepted model to study neurodevelopment as it displays brain growth and development patterns similar to what occurs in humans. As a less common animal model in neuroscience, surgical and dissection procedures on pigs may not be as familiar or well-practiced among researchers. Therefore, a standardized visual protocol detailing consistent extraction and dissection methods may prove valuable for researchers working with the pig. The following video showcases a technique to remove the pig brain while keeping the cortex and brainstem intact and reviews methods to dissect several commonly investigated brain regions including the brainstem, cerebellum, midbrain, hippocampus, striatum, thalamus, and medial prefrontal cortex. The purpose of this video is to provide researchers with the tools and knowledge necessary to consistently perform a brain extraction and dissection on the four-week-old pig.

This protocol details the technique for removal of the pig brain in its entirety and dissection of several brain regions commonly studied in neuroscience.

길들여진 돼지 뇌의 추출 및 해부

Use of the pig as a preclinical and translatable animal model has been well-documented and accepted by research fields investigating cardiovascular ...

Laser Microdissection-Based Protocol for the LC-MS/MS Analysis of the Proteomic Profile of Neuromelanin Granules

Neuromelanin is a black-brownish pigment, present in so-called neuromelanin granules (NMGs) in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta. Besides neuromelanin, NMGs contain a variety of proteins, lipids, and metals. Although NMGs-containing dopaminergic neurons are preferentially lost in neurodegenerative diseases like Parkinson&#39;s disease and dementia with Lewy bodies, only little is known about the mechanism of NMG formation and the role of NMGs in health and disease. Thus, further research on the molecular characterization of NMGs is essential. Unfortunately, standard protocols for the isolation of proteins are based on density gradient ultracentrifugation and therefore require high amounts of human tissue. Thus, an automated laser microdissection (LMD)-based protocol is established here which allows the collection of NMGs and surrounding substantia nigra (SN) tissue using minimal amounts of tissue in an unbiased, automatized way. Excised samples are subsequently analyzed by mass spectrometry to decipher their proteomic composition. With this workflow, 2,079 proteins were identified of which 514 proteins were exclusively identified in NMGs and 181 in SN. The present results have been compared with a previous study using a similar LMD-based approach reaching an overlap of 87.6% for both proteomes, verifying the applicability of the revised and optimized protocol presented here. To validate current findings, proteins of interest were analyzed by targeted mass spectrometry, e.g., parallel reaction monitoring (PRM)-experiments.

A robust protocol is presented here for isolating neuromelanin granules from human post-mortem substantia nigra pars compacta tissue via laser microdissection. This revised and optimized protocol massively minimizes the required time for sample collection, reduces the required sample amount, and enhances the identification and quantification of proteins by LC-MS/MS analysis.

뉴로멜라닌 과립의 단백질체 프로파일의 LC-MS/MS 분석을 위한 레이저 미세 해부 기반 프로토콜

Neuromelanin is a black-brownish pigment, present in so-called neuromelanin granules (NMGs) in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta. ...

fNIRS 연구의 혁명: 신경 결합에 대한 새로운 접근 방식

New Framework for Understanding Cross-Brain Coherence in Functional Near-Infrared Spectroscopy (fNIRS) Hyperscanning Studies

Despite the growing body of functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) hyperscanning studies, the assessment of coupling between two neural signals using wavelet transform coherence (WTC) seems to ignore the directionality of the interaction. The field is currently lacking a framework that allows researchers to determine whether a high coherence value obtained using a WTC function reflects in-phase synchronization (i.e., neural activation is seen in both members of the dyad at the same time), lagged synchronization (i.e., neural activation is seen in one member of the dyad prior to the other member), or anti-phase synchronization (i.e., neural activation is increased in one member of the dyad and decreased in the other). To address this need, a complementary and more sensitive approach for analyzing the phase coherence of two neural signals is proposed in this work. The toolbox allows investigators to estimate the coupling directionality by classifying the phase angle values obtained using traditional WTC into in-phase synchronization, lagged synchronization, and anti-phase synchronization. The toolbox also allows researchers to assess how the dynamics of interactions develop and change throughout the task. Using this novel WTC approach and the toolbox will advance our understanding of complex social interactions through their uses in fNIRS hyperscanning studies.

저자 스포트라이트: fNIRS 연구에서 새로운 통찰력 확보 - 뇌 간 동기화 분석을 위한 새로운 프레임워크 

Wavelet transform coherence (WTC) is a common methodology for assessing the coupling between signals that is used in functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) hyperscanning studies. A toolbox for assessing the directionality of the signal interaction is presented in this work.

기능적 근적외선 분광법(fNIRS) 하이퍼스캐닝 연구에서 교차 뇌 일관성을 이해하기 위한 새로운 프레임워크

Despite the growing body of functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) hyperscanning studies, the assessment of coupling between two neural signals ...