CJN 실험실에서 연구 NSERC, 캐나다 암 협회 연구소 (CCSRI)와 캐나다 유방암 재단 (BC-유콘 지점)에서 운영 보조금 지원됩니다.

참고 :이 절차의 일반적인 작업은 그림 2에 설명되어 있습니다. 성장 억제 용량 1. 결정 <ol><li> 효모 하룻밤 문화의 준비 참고 :이 프로토콜에 사용되는 효모 추출물 - 펩톤 - 덱스 트로 오스 성장 미디어 (YEPD)는 표준 조리법 (13)이다. <ol><li> BY4741 (마타 HIS3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) YEPD 한천 접시에 세포 밖으로 행진 30 ° C 또는 볼 식민지 형성 할 때까지 48 시간 동안 배양한다. </li><li> 하나의 식민지로 무균 배양 용기에 YEPD 액체 매체의 5 mL를 접종하여 하룻밤 문화를 준비합니다. 연속 회전이나 진탕 30 ° C에서 밤새 품어. 문화는 일반적으로 아침 (~ 2 × 10 8 세포 / ㎖)에 의해 포화에 도달 할 것입니다. </li></ol></li><li> 고체 한천 매체 준비 다양한 화학 용량을 포함 <ol><li> 여러 주식을 준비화학 물질은 적당한 용매 100X 원하는 최종 농도에서 시험한다. 참고 : 유효 농도는 화학 물질에 따라 달라집니다, 그리고 경험적으로 결정해야합니다. 높은 mM의 낮은 μM에서, 즉, 그것은 처음에 폭 넓은 최종 농도 범위를 테스트하는 것이 좋습니다. </li><li> 화학 물질의 농도에서 각각 여러 멸균 배양 관에 분취 용융 YEPD 한천 3 ㎖를 시험한다. 55 ° C의 물을 욕조에 장소 응고에서 유지합니다. </li><li> 테스트 할 화학 물질의 농도를 각각 들어 12 웰 플레이트에 중복 우물의 각 쌍에 용융 미디어, 소용돌이에 섞어 2 ~ 3 초, 피펫 1 ml에 100 배 화합물의 30 μl를 추가합니다. 만 제어 차량을 포함해야합니다. 플레이트는 실온에서 하룻밤 설정할 수 있습니다. 여분의 미디어를 폐기하십시오. </li></ol></li><li> 확산 도금 세포 <ol><li> 1 단계로 하룻밤 성장 포화 효모 문화의 2 μL와 YEPD 액체 매체 10 ㎖를 접종.1.2. </li><li> 잘 희석 주당 효모 문화의 25 μL는, 멸균 유리 구슬 또는 막대를 사용하여 균일하게 확산하고 판은 불꽃에서 건조 할 수 있도록 접시입니다. 48 시간 동안 30 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 접시에 효모의 성장 (식민지 모두 총 개수 및 크기)을 평가합니다. 화면을 수행하는보다 10 % -15 %의 성장을 저해하지 않는 화합물의 치사량 농도를 선택한다. </li></ol></li></ol> 2. 체계적인 화학 유전자 화면 <ol><li> 소스 플레이트의 삭제 돌연변이 배열의 유지 보수 (DMA) 및 준비 <ol><li> 글리세롤 주식에서 삭제 돌연변이 어레이를 구성에 대한 자세한 설명은 Baryshnikova 등. (14)을 참조하십시오. 삭제 돌연변이가 판 당 384 식민지의 밀도로 배열되고 나면, DMA는 4 ° C에서 몇 달 동안 저장할 수 있습니다. 각각의 콜로니로 성장하는 것을 방지하기 위해 필요한만큼의 G418 200 ㎍ / ml를 함유 YEPD 한천 복제다른. 주 : 복수 직렬 복제가 느린 성장 균주의 손실을 방지하고 억제 돌연변이 출현을 최소화하기 위해 피해야한다. 이 haploids으로 컬렉션을 유지하는 경우에 특히 관련이있다. </li><li> 로봇 시스템의 배열 미생물을 사용하여 모든 복제 도금 단계를 수행합니다. 또한, 수동 피닝 도구를 사용하여 식민지를 배열 조작 할 수 있습니다. 참고 : 효모 삭제 컬렉션 여러 상용 소스에서 haploids 및 diploids로 사용할 수 있으며 일반적으로 96 웰 플레이트에 글리세롤 주식으로 제공됩니다. </li></ol></li><li> 삭제 돌연변이의 배열을 응축 <ol><li> G418 200 ㎍ / ㎖의를 포함 YEPD 한천 미디어 250 ml의를 준비합니다. G418의 유효 농도는 다를 수 있으며, 각각의 많은 경험적으로 테스트해야합니다. </li><li> 접시 당 G418 200 ㎍ / ㎖의를 포함 YEPD 한천의 50 ㎖를 주입하여 다섯 YEPD 한천 플레이트를 준비합니다. 배열을 응축하기 전에이 일일를 수행하고 판을 실온에서 냉각 할 수 있도록erature 하룻밤 다음 평평한 표면에. 참고 : 4 판은 1536 - 변형 밀도에서 수집해야합니다, 다섯 번째 판은 추가로 부어있다. </li><li> 접시 당 384 식민지의 밀도로 돌연변이 삭제 컬렉션을 포함하는 16 개의 배양 접시를 제거하고 실온 (1 ~의 시간)에 올 수 있습니다. </li><li> 섬세한 작업을 닦아 사용하여 각 판의 덮개를 형성하고 응축을 닦으십시오. 물방울이 발생할 수 있습니다 그렇게하지 ​​않으면 배열과 배열 된 돌연변이 체의 교차 오염에 증착된다. </li><li> 미생물 배열 달아 로봇을 사용하여, 판 당 1,536 식민지 (4 페트리 접시)에 접시 당 384 콜로니 (16 페트리 접시)의 밀도에서 DMA를 응축. 플레이트 (1) 핀에서 1 차 식민지가 응축 된 배열의 1 열 1 행하기 때문에이 작업을 수행 판 (2)의 1 차 식민지는 1 열 2, 2, 1 열을 행하기 판 (3)의 1 차 식민지를 행 및합니다 판 (4)의 1 차 식민지는 2 행합니다2 열. </li><li> 하룻밤 30 ° C에서 통합 된 배열을 품어. </li><li> 소스 판에서 식민지의 균일 한 전송을 보장하기 위해 배열을 검사합니다. DMA가 제대로 (그림 4A)를 응축 된 보장하기 위해 가이드 역할을 의도적으로 배열에 포함 여러 빈 위치,있을 것이다. 주 :이 시험 화합물을 함유하는 매체 상 복제본 도금 소스 판 것이다. 단일 소스 복수 pinnings 판에 사용될 수있다. 또한 많은 로봇마다 전송되는 효모의 비슷한 번호를 확인합니다 상쇄 기능을해야합니다. </li></ol></li><li> 복제 플레이트 삭제 돌연변이 어레이 <ol><li> 제어 700 ㎖ (차량 만 해당) 및 실험 매체 (화학 물질 함유) 700 ml의를 준비합니다. 이 세중 분석 (조건 당 12 판, 플러스 두 엑스트라)을 수행하기위한 충분하다. </li><li> 시험 물질 또는 플레이트 당 컨트롤을 포함 YEPD 한천의 50 ㎖를 붓고. 플레이트 t 허용오 다음 평평한 표면에 하룻밤 실온에서 냉각. </li><li> 레플리카 플레이트에 로봇을 사용하여, 실험적으로 결정된 농도로 화학 물질을 함유하는 접시의 3 세트뿐만 아니라, 차량 제어를 함유하는 플레이트 상에 세 세트 DMA 접종. 24 ~ 48 시간 동안 실온에서 접시를 품어. </li></ol></li></ol> 3. 이미징 플레이트 및 데이터 분석 <ol><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 실온 (1 ~의 시간) 이전 영상에 올 수 있습니다. 이 판을 이미징하는 동안 결로 현상을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 뚜껑을 제거하고 플랫 베드 스캐너에 얼굴을 아래로 배치하여 24 및 48 시간에서 이미지 플레이트. 적어도 300 dpi의 해상도로 이미지를 캡처합니다. 다르게는, 이미지를 캡처하는 디지털 카메라를 사용한다. 이렇게하면, 장소 플레이트는 어두운 배경에 닫 얼굴과 이미지에 뚜껑을 제거합니다. 주 : 판의 파일 형식 및 위치가 사용 정량 프로그램에 의존 할 것이다. </li&gt; <li> 정량 Balony 15 SGAtools (16), 및 ScreenMill (17) 등 여러 오픈 소스 프로그램 중 하나를 사용하여 배열을 식민지 크기 비교를 수행합니다. </li></ol> 화면의 4. 검증 참고 :이 단계에서 몇 가지 효모 삭제 돌연변이 관심있는 화학 물질 등의 과민 점수 것입니다. 이러한 화학 물질이 유전 적 상호 작용은 다음 두 가지 방법으로 확인해야합니다. 먼저 민감한 균주의 신원은 PCR에 의해 확인되어야한다. 둘째, 화학 감도는 독립적으로 득점해야합니다. 아래에 설명하는 변형 과민, 효모 생물학에서 일반적인 기술을 검증하기 위해 안보 분석을 수행하기위한 간단한 프로토콜입니다. <ol><li> 킬 밖으로 G418 200 ㎍ / ㎖의를 포함 YEPD 한천에 효모 삭제 컬렉션 (과민) 돌연변이를 원했다. 콜로니를 형성 할 때까지 30 ° C에서 품어. 프라이머에 따라 함께 진단 PCR에 의해 변형의 유전자형 확인제조업체의 프로토콜입니다. </li><li> 각 변형에 대한 YEPD 액 5 mL를 접종하고 회전이나 진탕 30 ° C에서 밤새 품어. </li><li> OD 600을 측정하고 멸균 dH보다 2 O 600 = 1 중독 각 균주를 희석 이들은 지금 정규화 된 효모 문화입니다. </li><li> 96- 웰 플레이트의 웰 A1로 정규화 야생형 효모 (BY4741) 100 ㎕ 배양 디스펜스. 우물 B1-H1에 최대 7 개의 추가 균주의 100 μl를 분배. </li><li> A6-H6를 통해 우물 A2-H2 멸균 dH보다 2 O의 90 μl를 분배하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 마지막으로, 표준화 된 효모 배양 1:10 희석 시리즈를 준비합니다. 직렬 멀티 채널 피펫으로 열 2 열 1의 10 μl를 피펫 팅에 의해 시작, 6 희석이 이루어질 때까지 96 웰 플레이트에 걸쳐 계속 (즉, 10 0-10 -5). </li><li> 멀티 채널을 사용하여 그리드에 희석 효모 문화의 2-5 μl를 전송화학 및 차량 컨트롤을 포함 YEPD 고체 매체에 피펫. 24 ~ 48 시간 동안 적절한 온도에서 접시를 품어. </li><li> 판을 검사하고 (BY4741 컨트롤을 기준으로) 화학 물질을 선택 돌연변이의 감도를 비교합니다. 이미지 (24) 접시와 단계 3.2에서와 같이 48 시간. 참고 : 관련 유전자 온톨로지 또는 함수 여러 민감한 균주의 동정은 스크린의 유효성을 확신 적합하지만, 유전자의 야생형 카피를 함유하는 플라스미드 과민 결실 균주의 변환은 공식적 유전자 것을 설정하는 데 필요한 관심의 삭제 (그리고 숨겨진 두 번째 사이트 돌연변이) 약물 감도가 발생합니다. </li></ol>

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The authors declare they have no competing financial interests.

화학적 상호 작용 유전자 프로파일을 생성하기위한 방법이 여기에 설명했다. 방법은 간단하다 화학의 유무에 광범위한 유전자 결실 컬렉션 각 균주의 콜로니 크기를 비교하여, 화학적 내성 모독에 필요한 모든 유전자들은 식별된다. 민감한 균주의 결과 목록의 주석 농축 분석은 화학 물질의 작용 모드에 대한 통찰력을 제공하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 효모 신진 위해 최적화되어 있?...

유전 도구와 모델 생물 사카로 미세스 세 레비 시아에 이용 가능한 자원 일괄 유전자 네트워크 생물학적 시스템의 요구 사항을 이행하는 방법으로서 기능에 대한 새로운 통찰력을 제공 대규모 기능 유전체학 연구있게되었다. 이러한 도구의 초석은 효모 1, 2의 모든 열려있는 독서 프레임의 비 필수 유전자 결실의 완전한 세트의 공동 제작했다. 눈에 띄는 관찰 표준 실험실 조건에서 haploids로 성장하면 효모의 유전자 만 ~ 20 %가 생존에 필요한 것이 었습니다. 이것은 다른 생물학적 경로의 이용을 통해 게놈 섭동에 대하여 버퍼링 세포의 능력을 강조한다. 유전 개별적으로 가능한 있습니다 돌연변이하지만 조합에 치명적인는 연결 또는 수렴 병렬 생물학적 경로를 신호 및 생물학적 기능을 설명하는 유전자 상호 작용 네트워크를 형성한다. 조건부 TE의 발전과 함께필수 유전자의 mperature에 민감하고 hypomorphic 대립이 기술은 중요하지 않은 유전자 3,4의 연구에 국한되지 않았습니다. 이 개념은 유사한 세포 과정에 관여하는 유전자 (5)가 함께 클러스터링 방법을 설명하는 편견 유전자 상호 작용지도를 생산하는 게놈 규모로 적용되었습니다. 유전자 네트워크의 화학 교란 모방 유전자 결실 (그림 1) 6. 과민성위한 결실 균주의 고밀도 배열 대해 성장 저해 화합물을 조회하면 화학적 스트레스를 허용하는 데 필요한 유전자의리스트, 즉 화학적 상호 작용 유전자 프로파일을 식별한다. 유전 적 상호 작용과 마찬가지로, 화학 라이브러리의 대형 스크린은 액션 함께 클러스터 (7)의 모드를 갖는 화합물과 유사한 것으로 나타났다. 따라서, 화합물의 화학적 상호 작용 유전자 프로파일을 구축하여 작업의 모드는 LAR과 비교하여 추론 할 수있다GE의 규모의 합성 유전자 및 화학 유전자 상호 작용은 8,9 데이터 집합. 화합물의 점수가, 심문하고있는 큰 규모의 화학 유전 스크린, 바코드 경쟁 분석에 의해 수행되었다. 이 방법에서는, 삭제 균주의 풀링 된 컬렉션 화학 물질을 포함하는 미디어의 작은 볼륨에서 여러 세대에 한꺼번에 성장한다. 각 삭제 돌연변이가 고유 한 유전자 바코드를 품고 있기 때문에, 삭제 균주의 풀 내의 개별 돌연변이의 생존 / 성장은 마이크로 어레이 또는 높은 처리량 시퀀싱 (10)에 의해 추적됩니다. 생체 활성 화합물을 함유하는 고체 아가상에서 성장 물리적으로 배열 된 돌연변이 콜로니 크기를 모니터링하여 적응도를 추론하는 것은 화학적 상호 작용 11,12 유전자를 확인하는 효과적인 방법이다. 이 방식은 경쟁 기반 스크리닝에 비용 효율적인 대안을 제공하고, 화학 물질의 작은 라이브러리를 분석하기에 적합하다.여기에 설명 된 S.의 화학적 상호 작용 유전자의리스트를 생성하기위한 간단한 방법이다 생물학 조작 또는 인프라 분자에 의존하지 않는 cerevisiae의는. 그것은 단지 효모 삭제 수집, 로봇 또는 수동 피닝 장치 및 무료로 사용할 이미지 분석 소프트웨어가 필요합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="987">
	<tbody>
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		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:213px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:161px;">BioBasic</td>
			<td>G0961</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:213px;">Tyrptone Powder</td>
			<td style="width:161px;">BD Biosciences</td>
			<td>211820</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">Dextrose</td>
			<td style="width:161px;">Anachemia</td>
			<td style="width:156px;">31096-380</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) - Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Agar A</td>
			<td style="width:161px;">Bio Basic</td>
			<td>FB0010</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:213px;">G418</td>
			<td style="width:161px;">A.G. Scientific Inc.</td>
			<td style="width:156px;">G-1033</td>
			<td style="width:457px;">Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">12 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">5ml culture tubes</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>222-2376-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">10cm Petri Dish</td>
			<td style="width:161px;">VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROTOR HDA</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>ROT-001</td>
			<td>high-throughput microbial array pinning robot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLUSPLATE&#169; Petri Dish</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>PLU-001</td>
			<td>Box of 200 dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384 Short-Pin RePad</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>RP-MP-384</td>
			<td>Box of 1000 pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1536 Short-Pin RePad</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>RP-MP-1536</td>
			<td>Box of 1000 pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alternative Pinning Tools:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fully Automated Robtic Systems</td>
			<td>S&#38;P robotics</td>
			<td>http://www.sprobotics.com</td>
			<td>Several automated colony handling robitic and imagining systems available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual Pinning Tools</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>http://www.vp-scientific.com</td>
			<td>Handheld replication tools and accessories.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid identification of chemical genetic interactions in saccharomyces cerevisiae

생리 활성 화학 물질의 작용 모드를 결정하는 학술, 제약의 넓은 범위에 관심, 산업 과학자이다. 사카로 미세스 세 레비 시아, 또는 신진 효모, 모델 진핵 생물이되는 ~ 6,000 유전자 삭제 돌연변이 hypomorphic 필수 유전자의 전체 모음 돌연변이 체는 시판되고있다. 이러한 돌연변이의 수집 체계적 화학 견딜 필요 유전자 화학적 상호 작용, 즉 유전자를 검출하는데 사용될 수있다. 이 정보는, 차례대로, 화합물의 작용 가능성 모드에보고한다. 여기에서 우리는 효모 신진 화학 - 유전자 상호 작용의 신속한 식별을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 액션의 잘 정의 된 메커니즘이 화학 요법 제 5- 플루오로 우라실 (5-FU)을 사용하는 방법을 보여준다. 우리의 결과는 핵 TRAMP가 엑소 및 DNA 복구 효소 이전 m과 일관성이 5-FU의 존재하에 증식에 필요한 RNA 보여기반 바 코딩 화학 유전 적 접근과 5-FU에 악영향을 모두 RNA 및 DNA 신진 대사에 영향을 미치는 것을 지식을 icroarray. 이러한 높은 처리량 스크린 필요한 검증 프로토콜은 또한 기술된다.

이 방법의 유효성으로서 우리는 위에서 설명한 프로토콜은 다음 화학 요법 제 5- 플루오로 우라실 (5-FU)의 대표적인 화학적 상호 작용 유전자 스크린을 수행 하였다. 5-FU는 티미 신타뿐만 아니라 DNA와 RNA 대사 (18)을 방해하는 것으로 알려져있다. 5-FU의 화학적 유전 적 상호 작용은 공부 잘하고 이질 동형 접합 삭제 컬렉션 8,19를 모두 사용하여 효모 바코드 마이크로 어레이 기술에 ?...

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Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

rapid-identification-chemical-genetic-interactions-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

10.2K 조회수.  University of Victoria. Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

연구

생물학

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

로 표현 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 규칙 단백질의 정제<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR은의 보조 인자 (cofactor)의 산화 환원 적정​​을 모니터링<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

mRNA의 붕괴 요금의 측정에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em사용&gt;<em&gt; rpb1-1</em&gt; 균주

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...