장 중간엽을 분리하기 위한 우리의 프로토콜은 높은 수율의 텔로세포를 초래합니다. 이 방법은 항상성 및 질병에서 텔로세포와 관련된 세포-세포 상호작용을 연구하기 위한 초기 플랫폼을 제공합니다. 텔로세포는 이용 가능한 조직 해리 프로토콜에 민감한 독특한 세포입니다.
따라서이 기술의 주요 장점은 농축 된 생존 가능한 텔로 세포를 포함한 중간엽의 분리입니다. 텔로세포를 포함한 중간엽은 생체 외에서 조직화된 성장에 필요한 신호 분자 및 성장 인자의 공급원 역할을 할 수 있습니다. 시작하려면 안락사 된 마우스에서 분리 된 장을 차갑고 멸균 된 PBS가 들어있는 페트리 접시에 담아 씻으십시오.
장을 페트리 접시에 넣으십시오. 그리고 볼팁 가위를 사용하여 장 튜브를 세로로 열고 대변을 씻어냅니다. 신선하고 차가운 PBS가 들어있는 새로운 접시에 장을 옮깁니다.
장을 한 번 더 씻은 후 소장을 1cm 길이의 세그먼트로 자르고 8 밀리리터의 PBS로 채워진 15 밀리리터의 원추형 튜브로 옮깁니다. 1분 동안 초당 1회 또는 2회 수동으로 튜브를 흔듭니다. 용액을 페트리 접시에 붓습니다.
그리고 집게를 사용하여 세그먼트를 20 밀리리터의 용액 A로 채워진 50 밀리리터의 원뿔형 튜브로 옮깁니다.튜브를 섭씨 37 도의 궤도 셰이커 인큐베이터에 20 분 동안 놓습니다. 배양 후 1분 동안 초당 4-5회 회전하여 손으로 튜브를 세게 흔들어 상피를 해리시킵니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
이전에 설명한 대로 조각을 절단하고 세척한 후 10밀리리터의 멸균 PBS로 채워진 새로운 50밀리리터 튜브로 옮기고 1분 동안 초당 1-2회 사이클로 튜브를 뒤집습니다. 페트리 접시에 용액을 붓는다. 세그먼트를 10 밀리리터의 멸균 PBS로 채워진 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮기고 2 분 동안 초당 1-2 사이클로 부드럽게 위아래로 기울입니다.
생물 안전 캐비닛 아래에서 집게를 사용하여 세그먼트를 멸균 실험실 물티슈에 올려 건조시킵니다. 건조되면 세그먼트를 조각으로 더 자릅니다. 집게를 사용하여 절단 된 조각을 웰 당 4 밀리리터의 예열 된 소화 용액으로 채워진 6 웰 플레이트에 옮깁니다.
플레이트를 섭씨 37도에서 50분 동안 배양하고 20분마다 수동으로 플레이트를 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫을 사용하여 4밀리리터의 DMEM으로 채워진 15밀리리터의 원뿔형 튜브에 조각을 옮깁니다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 1분 동안 초당 4회 또는 5주기로 튜브를 수동으로 흔듭니다.
100마이크로미터 스트레이너를 통해 50밀리리터 원뿔형 튜브로 서스펜션을 여과합니다. 여과액을 섭씨 4도에서 5분 동안 700g으로 원심분리합니다. 흡인에 의해 상청액을 버리고 세포 펠릿을 2% FBS/PBS 5밀리리터에 재현탁합니다.
현탁액을 700 g에서 5분 동안 한 번 더 원심분리한 후, 상층액을 버리고, 세포 펠렛을 12 밀리리터의 배양 배지에 재현탁시켰다. 마지막으로, 세포 현탁액을 6-웰 플레이트에 시딩한다. 중간엽 해리 후, 텔로사이트는 세포 특성을 잃고 둥근 세포 형태를 나타내며 다음 날에 비해 첫날에 더 적은 수의 GFP 양성 세포를 반사합니다.
며칠 후, 텔로 세포는 짧은 세포 과정으로 작고 뻗어있는 세포 형태를 나타냅니다. 파종 7-10 일 후, 텔로 세포는 세포 특성을 회복하여 긴 세포질 과정으로 크고 뻗어있는 세포 형태를 보여줍니다. 유세포 분석은 세포 구성을 보여줍니다.
전체적으로, 분리된 세포의 69%는 DAPI 염색에 기초하여 생존 가능하였다. 그리고 이 중 60.9%는 상피 오염과 면역 및 내피 세포를 나타냈습니다. 텔로세포 분획은 각각 100k 및 70k FSC 및 SSC 위에 흩어져 있으며 개폐 중간엽의 거의 10%를 나타냅니다.
FACS 분석은 텔로세포의 하위세트가 CD201 및 GP38에 대한 양성 염색에 의해 정의될 수 있음을 밝혀냈다. 이들 마커를 사용하여 하루 동안 배양된 중간엽의 면역염색은 세포가 세포 특성을 나타내지 않음에도 불구하고 이러한 분자 마커의 발현을 보여주었습니다. 이 절차를 통해 기질 세포의 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있으며, 이는 2D 배양뿐만 아니라 오가노이드를 사용한 3D 공동 배양 또는 바이오프린팅과 같은 다른 응용 분야에도 사용할 수 있습니다.
