JMN 국립 연구소의 종합 의료 과학 (T32GM088129)과 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (F31DE026682)에서 재정 지원의 건강의 국가 학회 둘 다 인정합니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다. 이 프로젝트 또한 NIH (P30 AI036211, P30 CA125123, 및 S10 RR024574)와 조 엘 M. Sederstrom의 전문가 지원 자금 Cytometry 베일 러 의과대학에서 셀 정렬 코어에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 베일 러 대학의과 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 종양 수확 및 소화
참고: 수확에 필요한 시간은 3-5 분/종양, 및 처리에 필요한 시간 1 ~ h + 2-3 분/종양.
<ol><li>이산화탄소 흡입 하 여 마우스를 안락사와 머리 오염을 방지 하기 위해 수확 하기 전에 70% 에탄올과 아래로 각 마우스 스프레이. 수술로 쥐에서 피하 종양을 제거 하 고 종양 어떤 오염 조직 (즉, 머리, 피부, 복 막, 등)의 무료 인지 확인. 각 종양 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 24-잘 접시에서 없이 기본 RPMI 1640 미디어의 1.8 mL에 놓습니다. 큰 수확에 대 한 계속 판 찬 세포 생존 능력을 유지 하기 위해 얼음에. 참고: 불 임이 필요한 경우 모든 종양 ╂ biosafety 어떤 추가 단계 뿐 아니라 불 임 수술 도구 (즉, 가 위, 집게, 등), 캐비닛에서 필요 합니다. 0.5-1 ㎝ 사이 가장 긴 직경이 종양은 최적의 그리고 더 큰 또는 작은 종양 시 약의 스케일링 필요 합니다.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 각 잘 내3 조각을 1 m m 미만으로 종양을 잘라.</li>
	<li>콜라를 용 해 하 여 소화 칵테일 x 10을 준비 10 mg/mL, 2500 U/mL, 그리고 DNase에서 콜라 4에서 나 기본 RPMI 1640 미디어 (FBS) 없이 200 U/mL에서 나. 참고: 소화 칵테일 사전에 하루를 준비 하 고 수-20 ° C에 저장 그러나, 효소 활동 한번 해산 시간이 지남에 잃게됩니다 장기간된 보관 권장 하지 않습니다.</li>
	<li>난, 콜라 4, 및 DNase 콜라를 포함 하는 분리 칵테일 x 10의 200 µ L을 추가 나 1 m m3 조각으로 각 잘 하.</li>
	<li>60-100 rpm 궤도 격판덮개 셰이 커를 사용 하 여 가볍게 흔들어 동안 37 ° C에서 1 시간에 대 한 소화 샘플 수 있습니다. 참고: 효소 소화 하는 동안 37 ° C에 온도를 상승 면역 세포 활성화를 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>1 시간 후 RPMI 1640 미디어 각 음을 5 %FBS 2 mM EDTA와 보충의 1 mL을 추가 하 여 반응 중화.</li>
	<li>50 mL 원심 분리기 튜브 위에 앉아 40 µ m 셀 스 트레이너로 종양 소화와 나머지 종양 조각 플라스틱. 참고: 종양 소화는 스 트레이너를 쉽게 전송에 대 한 1 mL 피 펫 팁의 끝을 잘라.</li>
	<li>10 mL 주사기 플런저를 사용 하 여 기계적으로 스 트레이너를 통해 종양 조각 세분화. 주기적으로 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL와 여과기를 헹 굴 (포함 하는 5 %FBS) 셀 스 트레이너는 종양의 명확한 때까지 반복. 참고: 전체 미디어의 약 4-10 mL 적절 하 게 종양의 여과기를 헹 구 게 충분 해야 한다. 참고:이 단계는 세포 생존 능력을 유지 하기 위해 모든 샘플에 대 한 완료 될 때까지 얼음에 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>각 50ml 원심 분리기 튜브 보충된 RPMI 1640 미디어를 사용 하 여 동일한 볼륨을 조정 합니다. 참고: 볼륨 조정은 원심 분리기 균형 중요 합니다. 이 단계를 건너뛰는 원심 분리기 손상 또는 상해 될 수 있습니다.</li>
	<li>셀 정지 (5 분, 805 x g, 4 ° C) 원심 supernatants, 삭제 하 고, 다시 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL에 일시 중단. 참고: 셀 집계를 resuspend 어려운 원심 분리에 따라 형성 수 있습니다. 계속 하기 전에 헤어 5 mL 혈 청 학적인 피 펫과 혼합 빠르게 사용 합니다.</li>
</ol>2. 면역과 종양 세포 분수의 분리
참고:이 단계에 필요한 시간은 약 1 시간입니다.
<ol><li>15 mL 원심 분리기 튜브의 하단에 밀도 그라데이션 매체의 3 mL를 추가 합니다. 준비 하 고 각 종양에 대 한 충분 한 튜브 라벨.</li>
	<li>레이어 2 개의 층의 혼합을 방지 하기 위해 튜브의 측면 아래로 천천히 pipetting으로 밀도 그라데이션 매체 위에 종양 세포 현 탁 액 2 mL.</li>
	<li>조심 스럽게 원심 분리기에 스핀 805 x g, 20 ° C, 아니 브레이크에서 20 분에 대 한 계층화 된 튜브를 놓습니다. 참고: 그것은 매우 적절 한 균형을 확인 하 고 아무 브레이크 원심 분리 하는 동안 사용 되도록 하는 것이 중요입니다. 이 과정의 혼선 레이어 혼합 되며 전체 샘플 복구는 어려울 것 이다.</li>
	<li>조심 스럽게 (틸) 계층과 전송 피 펫을 사용 하 여 새로운 15 mL 튜브에 최고의 미디어 계층 백혈구 침투 종양 전송. 모든 나머지 밀도 그라데이션 매체를 삭제 하 고 보충된 RPMI-1640의 2 ml에서 튜브의 하단에 종양 펠 릿 resuspend. 참고: 원심 분리 후 있을 것입니다 아래로 각각 해당 하는 위에서 보이는 4 개의 층: 미디어, TILs, 밀도 그라데이션 매체, 및 종양 세포 펠 릿. 그림 2 다양 한 계층의 예를 참조 하십시오.</li>
	<li>모두 때까지 원심 종양 샘플 튜브 (5 분, 805 x g, 4 ° C)를 분리 하 고 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 200 µ L에 때까지 샘플 및 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL에 종양 펠 릿. 생존 능력을 유지 하기 위해 얼음에 계속.</li>
</ol>3. 도금 및 얼룩
참고: 도금에 필요한 시간은 30 s/종양; 표면 얼룩에 필요한 시간은 1 시간; 세포내 얼룩에 필요한 시간은 40 분; 필요한 흐름 cytometry 분석-1 시간 4 분/종양.
<ol><li>준비 하 고 얼룩 패널 및 셀에 대 한 추가 판 각 면역에 대 한 레이블 96 잘 U-하단 플레이트 계산. 참고: 일반적으로, 3 개의 접시 준비가 총에서: 림프 구 집중 패널 판, 골수성 집중 패널 플레이트, 그리고 셀 수 접시.</li>
	<li>Aliquot는 얼룩의 각 단일 셀 정지 패널 접시와 설정된 볼륨 수 접시에. 참고: 카운트 접시 정확한 세포 인구 수 수 있도록 각 착 색 패널에 추가 하는 셀의 총 수를 계산 하는 데 사용 됩니다. 96 잘 접시 샘플링 및 volumetric 분석 기능 교류 cytometer 각 샘플 µ L 당 세포 수를 제공 하 고 그러므로, 각 착 색 패널에 추가 하는 셀의 수를 계산 수 있습니다. 수 판 고정 FACs 버퍼와 rinsing 4 ° C에서 하룻밤 후 다음 날 취득 될 수 있다 (인산 2% 식 염 수 (PBS) 버퍼링 FBS), FACs 버퍼의 설정된 볼륨에서 resuspending 및.</li>
	<li>(5 분, 805 x g, 4 ° C) centrifuging와 모든 무료 FBS를 제거 하려면 각 린스 사이 상쾌한 삭제 샘플 당 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS)의 200 µ L로 두 번 셀 워시.</li>
	<li>Fc 블록의 50 µ L 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 샘플 혼합 및 4 ° c.에 20 분 동안 품 어 추가</li>
	<li>2 x의 50 µ L 집중 extracellular 대상 항 체와 고칠 수 생존 얼룩 혼합물, 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 혼합 하 고 RT 또는 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 품 어 추가 참고: 정확한 착 조건 항 체에 대 한 제조업체의 지침에 따라 달라 집니다. 모든 얼룩 희석 DPBS, 고칠 수 생존 염료의 포화를 방지 하기 위해 아무 추가 FBS와 이어야 합니다. 이 원고에 사용 되는 착 색 패널의 최적의 희석에 대 한 테이블의 재료/장비 를 참조 하십시오. 항 체와 고칠 수 생존 솔루션 얼룩 얼룩 Fc 블록에 추가 될 때 전체 얼룩 볼륨 100 µ L에서 농도 x 최종 1을 2 배 농도에서 준비가 되어 있습니다.</li>
	<li>(5 분, 805 x g, 4 ° C) centrifuging와 각 린스 사이 supernatants 삭제 FACs 버퍼와 두 번 샘플을 씻으십시오.</li>
	<li>고정/permeabilization 솔루션 x 1의 200 µ L에서 resuspend 하 고 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 밤새 품 어. 참고: 실험 일시 중지할 수 있습니다 하룻밤이 시점에서: 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 샘플을 계속.</li>
	<li>다음 날, 원심 판 (5 분, 805 x g, 4 ° C) 그리고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>Permeabilization 버퍼, 원심 분리기 (5 분, 805 x g, 4 ° C), x 1의 200 µ L로 한 번 헹 구 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>1 x 집중된 세포내 항 체 얼룩 패널 1 x permeabilization 버퍼에 준비의 100 µ L을 추가 하 고 실시간 또는 (이 제조 업체에서 얼룩 권장 사항에 따라 달라 집니다) 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>1 x permeabilization와 버퍼 (5 분, 805 x g, 4 ° C), 상쾌한, 삭제 되 면 헹 구 고 린스 FACs 버퍼와 함께 두 번째 시간 (PBS 2 %FBS).</li>
	<li>FACs 버퍼의 300 µ L에서 샘플을 resuspend (PBS 2 %FBS), 교류 cytometry 튜브 샘플 전송 및 흐름 cytometry 분석 수행.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fouad, Y. A., Aanei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+hallmarks+of+cancer.">Revisiting the hallmarks of cancer.</a> American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).</li><li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment.">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li><li>Whiteside, T. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Mass+Cytometry+(CyTOF)+for+Functional+and+Phenotypic+Analysis+of+Natural+Killer+Cells.">Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells.</a> Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).</li><li>Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Tumor-infiltrating+Leukocyte+Subsets+in+a+Subcutaneous+Tumor+Model.">Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

에 다양 하 고 복잡 한 세포 구성 성분과 분자의 구성 됩니다. 최근 기록은이 환경의 정확한 특성 치료 성공 또는 실패의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다 식별할 수 있습니다 심지어 치료 저항 메커니즘 제안. 예를 들어 intratumoral 수준 (즉, MDSCs, T 규정 하는 세포, 등) 다양 한 면역 세포의 증가 이펙터 면역 반응을 완화를 immunotherapeutic 효과 파기 됩니다. 다른 한편으로, 이펙터 면역...

진압 시간 최근 암의 각 인으로 인정을 받고 있다 그리고 immunotherapy1그들의 민감성을 완화 뿐만 아니라 개발, 진행, 그리고 고체 종양 암의 보호에 중요 한 역할을 알려져 있습니다. 에 수많은 세포 하위 집합 및 고기, 종양의 면 역학적 상태에 중요 한 통찰력을 제공 하는 모두는 구성 됩니다. 이러한 면 역학적 하위 집합 추가 함께 타고 난 및 적응형 면역 반응2,3의 대다수를 구성 하는 림프 구 또는 골수성 근원의 세포로 층 화 될 수 있다. Immunotherapeutic 전략 (즉, 검사점 면역 억제제, 공상 항 원 수용 체 T-세포, 등) 튼튼한 암 유발 가능성이 있는 암 immunotherapy 분야의 최근 발전 증명 재발; 그러나, 그들은 상대적으로 단단한 종양 암4,5에서 효과 유지. 수많은 그룹 시간 치료 성공6,7을 재생할 수 및 따라서, 거기에 특별히 초점을 맞추고 전 임상 설정에서 새로운 immunotherapies 정확 하 게 평가할 필요가 남아 있다 중요 한 장애물이 나타났습니다 그들의 변조 또는8시간 극복 하는 능력.
일반적으로 시간을 특성화 하기 위해 현재 노력 중 현미경 활용 또는 항 체 면역 세포 하위 집합 및 그들의 기능9,10식별 하는 전략을 라벨 함께 cytometry 흐름. 이 두 가지 전략 현미경 세포 하위 집합의 공간 감사 있으며 cytometry 제공 높은 처리량 및 세포 변화의 광범위 한 정량화 고유 하 게 서로 다른 정보를 제공 합니다. 형광 성 다중 immunohistochemistry 지금 최대 7 매개 변수를 지원할 수, 스펙트럼 이미징 시스템 최적화에 최근 개선에도 불구 하 고 제한 된 패널 크기 어려운 광범위 한 레벨 프로 파일링 면역 이며 따라서이 기술을 자주 자세한 예약 집중 분석. 결과적으로, cytometry는 가장 널리 사용 되는 면역 프로 파일링 기법 중 하나 남아 있다. 시간 특성에 그것의 광범위 한 사용, 처리 및 얼룩을 위해 사용 되는 방법을 매우 변수는 있습니다. 가장 자주 프로토콜 활용 종양 효소 해리 (즉, collagenases, DNase, 등) 및 수동 분리 방법은 단일 셀 정지를 달성 하기 위해 다음 항 체 얼룩이 지 고 분석7. 각 방법의 장점에도 불구 하 고 수많은 그룹11이러한 기법 통해 유도 될 수 있는 광범위 한 다양성을 보여주었다. 이것은 종양 microenvironment 프로 파일링의 크로스-연구 비교 매우 어려운 동일한 murine 종양 모델을 평가 하는 경우에 합니다. 또한, 종양 세포를 평가 하기 위해 제한 된 잠재력을 제공 하는 이러한 메서드 및 종양 면역 침투 하지 구성 요소 독립적으로, 때문에 두 구성 요소는 소화 후 산재. 샘플 수량 다음 제한 멀티 패널 얼룩 및 분석, 희귀 면역학 하위 집합 특성 하려고 할 때 주요 문제 되는 (즉, 종양 관련 T-세포)12. 대량 cytometry cytometry (CyTOF), 비행 시간 등 최근 기술 42 독립적인 매개 변수13보다 큰 패널 디자인을 지 원하는 일부 시스템 셀룰러 하위 집합의 차원 높은 phenotypic 분석 허용. CyTOF 기술에 면역 프로 파일링의 엄청난 힘에도 불구 하 고 그것은 비용, 분석 전문 및 장비에 대 한 액세스 제한 된 남아 있습니다. 또한, 많은 CyTOF 프로토콜 추천14, 신호 대 잡음 비율 개선 하기 위해 면역 하위 집합의 정화 그리고 따라서 좋습니다 우리의 농축 메서드를 사용할 수는 업스트림 데이터 품질 향상을 위한 CyTOF 분석의.
여기 우리가 종양 microenvironment 소화 및 분석 분리를 침투 하는 종양 면역을 통합 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법의 목적은 종양 면역 침투 및 종양 microenvironment의 광범위 한 특성 분석을 위한 종양 세포 분수의 독립적인 높은 처리량 프로 파일링 수 있도록. 이 방법을 사용 하 여, 더 설명 전체 종양 분석의 중요성으로 피하 고체 종양 모델은 중요 한 공간 면역학이 발견 합니다. 전반적으로,이 방법은 더 정확 하 고 일관 되 게 비교할 수 샘플 사이의 종양 내에서 면역 세포 하위 집합에 대 한 풍요롭게 종양 세포와 종양의 면역 분수의 독립적인 프로 파일링을 허용 하기 때문에.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:615px;" width="615">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">6 to 12 week old male C57BL/6 mice</td>
			<td style="width:113px;">Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Mice used in our tumor studies</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line</td>
			<td style="width:113px;">Acquired from collaborator&#160;</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% isopropyl alcohol&#160;</td>
			<td style="width:113px;">EMD Milipore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PX1840</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Murine surgical tool kit</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">MOUSEKIT</td>
			<td style="width:167px;">Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">24-well plate&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">T1024</td>
			<td style="width:167px;">Or any 24-well flat bottom plate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI-1640 media</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R0883</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase I&#160;</td>
			<td style="width:113px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">234153</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:113px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">LS004189</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11284932001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Low Speed Orbital Shaker</td>
			<td style="width:113px;">BioExpress (supplier: Genemate)&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S-3200-LS</td>
			<td style="width:167px;">Or any orbital shaker.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Thermoregulating incubator</td>
			<td style="width:113px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-255-27</td>
			<td style="width:167px;">Or any other thermo-regulated incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:113px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:119px;">E177</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1 mL Pipette and tips</td>
			<td style="width:113px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">13-690-032</td>
			<td style="width:167px;">Or any other pipette and tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40 um Cell Strainers</td>
			<td style="width:113px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22363547</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">C1062-P</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">15 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">C1012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">10 mL Luer-Lok Syringe without needles</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309604</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Lymphoprep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:113px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">7811</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Transfer Pipettes</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">P7212</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">96-well U-bottom plates</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS</td>
			<td style="width:113px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D8573</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set&#160;</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">00-5523-00</td>
			<td style="width:167px;">Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermoregulated Centrifuge</td>
			<td style="width:113px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5810 R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">For 96-well cell volumetric counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:216px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)&#160;Clone 2.4G2&#160;</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">553141</td>
			<td style="width:167px;">Fc Block</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L34962</td>
			<td style="width:167px;">Fixable viability stain</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">47-0451-80</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17-5961-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD8-&#945; Antibody (KT15), PE</td>
			<td style="width:113px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-53473&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15-0041-81</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">56-5321-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15-0114-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">48-4801-80</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17-0112-81</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-5931-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25-5982-80</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46-9972-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711</td>
			<td style="width:113px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">563755</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment and characterization of the tumor immune and non-immune microenvironments in established subcutaneous murine tumors

종양 면역 microenvironment (시간) 최근 특히 immunotherapies에 대 한 단단한 종양에서 치료 응답의 중요 한 중재자로 인정 받고 있습니다. 최근 임상 발전 immunotherapy 정확 하 고 철저 하 게 종양 및 그 관련된 면역 침투 특성 재현 방법에 대 한 필요성을 강조 표시 합니다. 종양 효소 소화 및 흐름 cytometric 분석 허용 광범위 한 특성 수많은 면역 세포 하위 집합 및 고기; 그러나, 분석의 깊이 종종 fluorophore 제한 패널 설계 및 큰 종양 샘플을 확보 하는 필요의 희귀 면역 인구를 관찰에 의해 제한 됩니다. 따라서, 우리는 분리 및 농축 비 면역 종양 구성 요소에서 종양 면역 침투에 대 한 효과적이 고 높은 처리량 방법을 개발 했습니다. 설명된 종양 소화와 밀도 기반 원심 분리 기술은 종양 및 종양에 대 한 별도 특성 면역 침투 분수 및 세포 생존을 유지 있으며 따라서 종양의 광범위 한 특성을 제공 합니다 면 역학적 상태입니다. 이 방법은 하는 광범위 한 공간 면역이 단단한 종양에서 더 일관 된 전체 종양 면역학 프로 파일링 기법에 대 한 필요성을 보여주는 사용 되었다. 이 방법은 피하 고체 murine 종양; 면 역학적 특성에 대 한 효과적이 고 융통성 있는 기법을 제공 하는 전반적으로, 이 도구를 사용 하 수 있다 더 나은 종양 면역학 기능을 특성화 하는 등, 소설 immunotherapeutic 전략의 전 임상 평가.

우리의 결과 프로토콜에 설명 된 대로 비 면역 종양 구성 요소에서 분리 할 때의 중요 한 혜택을 보여 줍니다. 또한, 설립된 단단한 종양의 중요 한 면역학이 설명한 방법을 사용 하 여 설명 합니다.
많은 종양 분리 기술로 중요 한 문제는 가혹한 소화 조건 (즉, 높은 온도, 부적절 한 영양 공급, 등)의 결과로 수시로...

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Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

여기 우리가 설립된 피하 종양에서 종양 면역 및 비 면역 microenvironment의 구성 요소를 풍부 하 게 분리 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 종양 면역 침투 및 비 면역 종양 분수는 종양 면역 microenvironment의 포괄적인 특성화를 허용할 수 있는 별도 분석에 대 한 수 있습니다.

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

enrichment-characterization-tumor-immune-non-immune-microenvironments

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.5K 조회수.  Baylor College of Medicine. 여기 우리가 설립된 피하 종양에서 종양 면역 및 비 면역 microenvironment의 구성 요소를 풍부 하 게 분리 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 종양 면역 침투 및 비 면역 종양 분수는 종양 면역 microenvironment의 포괄적인 특성화를 허용할 수 있는 별도 분석에 대 한 수 있습니다.

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The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

연구

암 연구학

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified to secrete human Prostate Specific Antigen (PSA), and the procedure for the confirmation of tumor implantation. In brief, mice are anesthetized using injectable drugs and are made to lay in the dorsal position. Urine is vacated from the bladder and 50 &#181;L of poly-L-lysine (PLL) is slowly instilled at a rate of 10 &#181;L/20 s using a 24 G IV catheter. It is left in the bladder for 20 min by stoppering the catheter. The catheter is removed and PLL is vacated by gentle pressure on the bladder. This is followed by instillation of the murine bladder cancer cell line (1 x 105 cells/50 &#181;L) at a rate of 10 &#181;L/20 s. The catheter is stoppered to prevent premature evacuation. After 1 h, the mice are revived with a reversal drug, and the bladder is vacated. The slow instillation rate is important, as it reduces vesico-ureteral reflux, which can cause tumors to occur in the upper urinary tract and in the kidneys. The cell line should be well re-suspended to reduce clumping of cells, as this can lead to uneven tumor sizes after implantation.
This technique induces tumors with high efficiency. Tumor growth is monitored by urinary PSA secretion. PSA marker monitoring is more reliable than ultrasound or fluorescence imaging for the detection of the presence of tumors in the bladder. Tumors in mice generally reach a maximum size that negatively impacts health by about 3 - 4 weeks if left untreated. By monitoring tumor growth, it is possible to differentiate mice that were cured from those that were not successfully implanted with tumors. With only end-point analysis, the latter may be mistakenly assumed to have been cured by therapy.

This protocol describes the generation of murine orthotopic bladder tumors in female C57BL/6J mice and the monitoring of tumor growth.

쥐 동소 이식 방광 종양 모델 및 종양 탐지 시스템

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the tumor microenvironment and respond adequately to tumor antigens. The recent development of improved imaging approaches, such as 2-photon microscopy, and the use of powerful mouse tumor models have shed light on some of the mechanisms that regulate anti-tumor T cell activities. Whereas such systems have provided valuable insights, they do not always predict human responses. In human, our knowledge in the field mainly comes from a description of fixed tumor samples from human patients, as well as in vitro studies. However, in vitro models lack the complex three-dimensional tumor milieu and, therefore, are incomplete approximations of in vivo T cell activities. Fresh slices made from explanted tissue represent a complex multi-cellular tumor environment that can act as an important link between co-cultured studies and animal models. Originally set up in murine lymph nodes1 and previously described in a JoVE article2, this approach has now been transposed to human tumors to examine the dynamics of both plated3&#160;as well as resident&#160;T cells4.
Here, a protocol for the preparation of human lung tumor slices, immunostaining of resident CD8 T and tumor cells, and tracking of CD8 T lymphocytes within the tumor microenvironment using confocal microscopy is described. This system is uniquely placed to screen for novel immunotherapy agents favoring T cell migration in tumors.

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

This protocol describes a method to image resident tumor-infiltrating CD8 T cells labeled with fluorescently coupled antibodies within human lung tumor slices. This technique permits real-time analyses of CD8 T cell migration using confocal microscopy.

전 비보 인간의 폐 종양에 거주 CD8 T 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기 연구를 위해 면역 능력이있는 숙주 내로 Zebrafish Pediatric Brain 종양을 이식

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently developed method uses a medical wire functionalized with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies for in vivo isolation of circulating tumor cells (CTCs)1. A patient-matched cohort in non-metastatic prostate cancer showed that the in vivo isolation technique resulted in a higher percentage of patients positive for CTCs as well as higher CTC counts as compared to the current gold standard in CTC enumeration. As cells cannot be recovered from current medical devices, a new functionalized wire (referred to as Device) was manufactured allowing capture and subsequent detachment of cells by enzymatic treatment. Cells are allowed to attach to the Device, visualized on a microscope and detached using enzymatic treatment. Recovered cells are cytocentrifuged onto membrane-coated slides and harvested individually by means of laser microdissection or micromanipulation. Single-cell samples are then subjected to single-cell whole genome amplification allowing multiple downstream analysis including screening and target-specific approaches. The procedure of isolation and recovery yields high quality DNA from single cells and does not impair subsequent whole genome amplification (WGA). A single cell&#39;s amplified DNA can be forwarded to screening and/or targeted analysis such as array comparative genome hybridization (array-CGH) or sequencing. The device allows ex vivo isolation from artificial rare cell samples (i.e. 500 target cells spiked into 5 mL of peripheral blood). Whereas detachment rates of cells are acceptable (50 - 90%), the recovery rate of detached cells onto slides spans a wide range dependent on the cell line used (&#60;10 - &#62;50%) and needs some further attention. This device is not cleared for the use in patients.

This protocol is to recover and prepare rare target cells from a mixture with non-target background cells for molecular genetic characterization at the single-cell level. DNA quality is equal to non-treated single cells and allows for single-cell application (both screening based and targeted analysis).

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental enrichment (EE) reduces tumorigenesis by activating the mouse immune system, or affects tumor bearing animal survival by stimulating the wound repair response, including improved microbiome diversity, in the tumor microenvironment. Provided here is a detailed procedure to assess the effects of environmental enrichment on the biodiversity of the microbiome in a mouse colon tumor model. Precautions regarding animal breeding and considerations for animal genotype and mouse colony integration are described, all of which ultimately affect microbial biodiversity. Heeding these precautions may allow more uniform microbiome transmission, and consequently will alleviate non-treatment dependent effects that can confound study findings. Further, in this procedure, microbiota changes are characterized using 16S rDNA sequencing of DNA isolated from stool collected from the distal colon following long-term environmental enrichment. Gut microbiota imbalance is associated with the pathogenesis of inflammatory bowel disease and colon cancer, but also of obesity and diabetes among others. Importantly, this protocol for EE and microbiome analysis can be utilized to study the role of microbiome pathogenesis across a variety of diseases where robust mouse models exist that can recapitulate human disease.

Environmental Enrichment (EE) is an animal housing environment that is used to reveal mechanisms that underlie the connections between lifestyle, stress, and disease. This protocol describes a procedure that uses a mouse model of colon tumorigenesis and EE to specifically define alterations in microbiota biodiversity that may impact animal mortality.

마우스 결 장 종양 모델에서 콜론 미생물 생물 다양성에 환경 농축의 효과 정의 하는 방법

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce multiple tissue and organ damage. Despite recent advances and therapeutic approaches, the overall morbidity has remained unsatisfactory especially in patients with underlying parenchymal abnormalities. In the context of aggressive cancer growth and metastasis, surgical I/R is suspected to be the promoter regulating tumor recurrence. This article aims to describe a clinically relevant murine model of liver I/R and colorectal liver metastasis. In doing so, we aim to assist other investigators in establishing and perfecting this model for their routine research practice to better understand the effects of liver I/R on promoting liver metastases.

We describe in detail a clinically relevant colorectal cancer liver metastases (CRLM) tumor model and the influence of liver ischemia reperfusion (I/R) in tumor growth and metastasis. This model can help to better understand the mechanisms underlying surgery-induced promotion of liver metastatic growth.

허혈 재관류 손상의 설정에서 전이성 간 종양의 뮤린 모델

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited because very few patient derived SBNET cell lines have been generated. Well-differentiated SBNET cells are slow growing and are hard to propagate. The few cell lines that have been established are not readily available, and after time in culture may not continue to express characteristics of NET cells. Generating new cell lines could take many years since SBNET cells have a long doubling time and many enrichment steps are needed in order to eliminate the rapidly dividing cancer-associated fibroblasts. To overcome these limitations, we have developed a protocol to culture SBNET cells from surgically removed tumors as spheroids in extracellular matrix (ECM). The ECM forms a 3-dimensional matrix that encapsulates SBNET cells and mimics the tumor micro-environment for allowing SBNET cells to grow. Here, we characterized the growth rate of SBNET spheroids and described methods to identify SBNET markers using immunofluorescence microscopy and immunohistochemistry to confirm that the spheroids are neuroendocrine tumor cells. In addition, we used SBNET spheroids for testing the cytotoxicity of rapamycin.

Neuroendocrine tumors (NETs) originate from neuroendocrine cells of the neural crest. They are slow growing and challenging to culture. We present an alternative strategy to grow NETs from the small bowel by culturing them as spheroids. These spheroids have small bowel NET markers and can be used for drug testing.

작은 창자 신경 내분비 종양 스페로이드의 설치 그리고 특성화

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...