JMN 국립 연구소의 종합 의료 과학 (T32GM088129)과 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (F31DE026682)에서 재정 지원의 건강의 국가 학회 둘 다 인정합니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다. 이 프로젝트 또한 NIH (P30 AI036211, P30 CA125123, 및 S10 RR024574)와 조 엘 M. Sederstrom의 전문가 지원 자금 Cytometry 베일 러 의과대학에서 셀 정렬 코어에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 베일 러 대학의과 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 종양 수확 및 소화
참고: 수확에 필요한 시간은 3-5 분/종양, 및 처리에 필요한 시간 1 ~ h + 2-3 분/종양.
<ol><li>이산화탄소 흡입 하 여 마우스를 안락사와 머리 오염을 방지 하기 위해 수확 하기 전에 70% 에탄올과 아래로 각 마우스 스프레이. 수술로 쥐에서 피하 종양을 제거 하 고 종양 어떤 오염 조직 (즉, 머리, 피부, 복 막, 등)의 무료 인지 확인. 각 종양 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 24-잘 접시에서 없이 기본 RPMI 1640 미디어의 1.8 mL에 놓습니다. 큰 수확에 대 한 계속 판 찬 세포 생존 능력을 유지 하기 위해 얼음에. 참고: 불 임이 필요한 경우 모든 종양 ╂ biosafety 어떤 추가 단계 뿐 아니라 불 임 수술 도구 (즉, 가 위, 집게, 등), 캐비닛에서 필요 합니다. 0.5-1 ㎝ 사이 가장 긴 직경이 종양은 최적의 그리고 더 큰 또는 작은 종양 시 약의 스케일링 필요 합니다.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 각 잘 내3 조각을 1 m m 미만으로 종양을 잘라.</li>
	<li>콜라를 용 해 하 여 소화 칵테일 x 10을 준비 10 mg/mL, 2500 U/mL, 그리고 DNase에서 콜라 4에서 나 기본 RPMI 1640 미디어 (FBS) 없이 200 U/mL에서 나. 참고: 소화 칵테일 사전에 하루를 준비 하 고 수-20 ° C에 저장 그러나, 효소 활동 한번 해산 시간이 지남에 잃게됩니다 장기간된 보관 권장 하지 않습니다.</li>
	<li>난, 콜라 4, 및 DNase 콜라를 포함 하는 분리 칵테일 x 10의 200 µ L을 추가 나 1 m m3 조각으로 각 잘 하.</li>
	<li>60-100 rpm 궤도 격판덮개 셰이 커를 사용 하 여 가볍게 흔들어 동안 37 ° C에서 1 시간에 대 한 소화 샘플 수 있습니다. 참고: 효소 소화 하는 동안 37 ° C에 온도를 상승 면역 세포 활성화를 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>1 시간 후 RPMI 1640 미디어 각 음을 5 %FBS 2 mM EDTA와 보충의 1 mL을 추가 하 여 반응 중화.</li>
	<li>50 mL 원심 분리기 튜브 위에 앉아 40 µ m 셀 스 트레이너로 종양 소화와 나머지 종양 조각 플라스틱. 참고: 종양 소화는 스 트레이너를 쉽게 전송에 대 한 1 mL 피 펫 팁의 끝을 잘라.</li>
	<li>10 mL 주사기 플런저를 사용 하 여 기계적으로 스 트레이너를 통해 종양 조각 세분화. 주기적으로 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL와 여과기를 헹 굴 (포함 하는 5 %FBS) 셀 스 트레이너는 종양의 명확한 때까지 반복. 참고: 전체 미디어의 약 4-10 mL 적절 하 게 종양의 여과기를 헹 구 게 충분 해야 한다. 참고:이 단계는 세포 생존 능력을 유지 하기 위해 모든 샘플에 대 한 완료 될 때까지 얼음에 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>각 50ml 원심 분리기 튜브 보충된 RPMI 1640 미디어를 사용 하 여 동일한 볼륨을 조정 합니다. 참고: 볼륨 조정은 원심 분리기 균형 중요 합니다. 이 단계를 건너뛰는 원심 분리기 손상 또는 상해 될 수 있습니다.</li>
	<li>셀 정지 (5 분, 805 x g, 4 ° C) 원심 supernatants, 삭제 하 고, 다시 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL에 일시 중단. 참고: 셀 집계를 resuspend 어려운 원심 분리에 따라 형성 수 있습니다. 계속 하기 전에 헤어 5 mL 혈 청 학적인 피 펫과 혼합 빠르게 사용 합니다.</li>
</ol>2. 면역과 종양 세포 분수의 분리
참고:이 단계에 필요한 시간은 약 1 시간입니다.
<ol><li>15 mL 원심 분리기 튜브의 하단에 밀도 그라데이션 매체의 3 mL를 추가 합니다. 준비 하 고 각 종양에 대 한 충분 한 튜브 라벨.</li>
	<li>레이어 2 개의 층의 혼합을 방지 하기 위해 튜브의 측면 아래로 천천히 pipetting으로 밀도 그라데이션 매체 위에 종양 세포 현 탁 액 2 mL.</li>
	<li>조심 스럽게 원심 분리기에 스핀 805 x g, 20 ° C, 아니 브레이크에서 20 분에 대 한 계층화 된 튜브를 놓습니다. 참고: 그것은 매우 적절 한 균형을 확인 하 고 아무 브레이크 원심 분리 하는 동안 사용 되도록 하는 것이 중요입니다. 이 과정의 혼선 레이어 혼합 되며 전체 샘플 복구는 어려울 것 이다.</li>
	<li>조심 스럽게 (틸) 계층과 전송 피 펫을 사용 하 여 새로운 15 mL 튜브에 최고의 미디어 계층 백혈구 침투 종양 전송. 모든 나머지 밀도 그라데이션 매체를 삭제 하 고 보충된 RPMI-1640의 2 ml에서 튜브의 하단에 종양 펠 릿 resuspend. 참고: 원심 분리 후 있을 것입니다 아래로 각각 해당 하는 위에서 보이는 4 개의 층: 미디어, TILs, 밀도 그라데이션 매체, 및 종양 세포 펠 릿. 그림 2 다양 한 계층의 예를 참조 하십시오.</li>
	<li>모두 때까지 원심 종양 샘플 튜브 (5 분, 805 x g, 4 ° C)를 분리 하 고 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 200 µ L에 때까지 샘플 및 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL에 종양 펠 릿. 생존 능력을 유지 하기 위해 얼음에 계속.</li>
</ol>3. 도금 및 얼룩
참고: 도금에 필요한 시간은 30 s/종양; 표면 얼룩에 필요한 시간은 1 시간; 세포내 얼룩에 필요한 시간은 40 분; 필요한 흐름 cytometry 분석-1 시간 4 분/종양.
<ol><li>준비 하 고 얼룩 패널 및 셀에 대 한 추가 판 각 면역에 대 한 레이블 96 잘 U-하단 플레이트 계산. 참고: 일반적으로, 3 개의 접시 준비가 총에서: 림프 구 집중 패널 판, 골수성 집중 패널 플레이트, 그리고 셀 수 접시.</li>
	<li>Aliquot는 얼룩의 각 단일 셀 정지 패널 접시와 설정된 볼륨 수 접시에. 참고: 카운트 접시 정확한 세포 인구 수 수 있도록 각 착 색 패널에 추가 하는 셀의 총 수를 계산 하는 데 사용 됩니다. 96 잘 접시 샘플링 및 volumetric 분석 기능 교류 cytometer 각 샘플 µ L 당 세포 수를 제공 하 고 그러므로, 각 착 색 패널에 추가 하는 셀의 수를 계산 수 있습니다. 수 판 고정 FACs 버퍼와 rinsing 4 ° C에서 하룻밤 후 다음 날 취득 될 수 있다 (인산 2% 식 염 수 (PBS) 버퍼링 FBS), FACs 버퍼의 설정된 볼륨에서 resuspending 및.</li>
	<li>(5 분, 805 x g, 4 ° C) centrifuging와 모든 무료 FBS를 제거 하려면 각 린스 사이 상쾌한 삭제 샘플 당 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS)의 200 µ L로 두 번 셀 워시.</li>
	<li>Fc 블록의 50 µ L 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 샘플 혼합 및 4 ° c.에 20 분 동안 품 어 추가</li>
	<li>2 x의 50 µ L 집중 extracellular 대상 항 체와 고칠 수 생존 얼룩 혼합물, 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 혼합 하 고 RT 또는 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 품 어 추가 참고: 정확한 착 조건 항 체에 대 한 제조업체의 지침에 따라 달라 집니다. 모든 얼룩 희석 DPBS, 고칠 수 생존 염료의 포화를 방지 하기 위해 아무 추가 FBS와 이어야 합니다. 이 원고에 사용 되는 착 색 패널의 최적의 희석에 대 한 테이블의 재료/장비 를 참조 하십시오. 항 체와 고칠 수 생존 솔루션 얼룩 얼룩 Fc 블록에 추가 될 때 전체 얼룩 볼륨 100 µ L에서 농도 x 최종 1을 2 배 농도에서 준비가 되어 있습니다.</li>
	<li>(5 분, 805 x g, 4 ° C) centrifuging와 각 린스 사이 supernatants 삭제 FACs 버퍼와 두 번 샘플을 씻으십시오.</li>
	<li>고정/permeabilization 솔루션 x 1의 200 µ L에서 resuspend 하 고 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 밤새 품 어. 참고: 실험 일시 중지할 수 있습니다 하룻밤이 시점에서: 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 샘플을 계속.</li>
	<li>다음 날, 원심 판 (5 분, 805 x g, 4 ° C) 그리고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>Permeabilization 버퍼, 원심 분리기 (5 분, 805 x g, 4 ° C), x 1의 200 µ L로 한 번 헹 구 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>1 x 집중된 세포내 항 체 얼룩 패널 1 x permeabilization 버퍼에 준비의 100 µ L을 추가 하 고 실시간 또는 (이 제조 업체에서 얼룩 권장 사항에 따라 달라 집니다) 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>1 x permeabilization와 버퍼 (5 분, 805 x g, 4 ° C), 상쾌한, 삭제 되 면 헹 구 고 린스 FACs 버퍼와 함께 두 번째 시간 (PBS 2 %FBS).</li>
	<li>FACs 버퍼의 300 µ L에서 샘플을 resuspend (PBS 2 %FBS), 교류 cytometry 튜브 샘플 전송 및 흐름 cytometry 분석 수행.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

에 다양 하 고 복잡 한 세포 구성 성분과 분자의 구성 됩니다. 최근 기록은이 환경의 정확한 특성 치료 성공 또는 실패의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다 식별할 수 있습니다 심지어 치료 저항 메커니즘 제안. 예를 들어 intratumoral 수준 (즉, MDSCs, T 규정 하는 세포, 등) 다양 한 면역 세포의 증가 이펙터 면역 반응을 완화를 immunotherapeutic 효과 파기 됩니다. 다른 한편으로, 이펙터 면역...

진압 시간 최근 암의 각 인으로 인정을 받고 있다 그리고 immunotherapy1그들의 민감성을 완화 뿐만 아니라 개발, 진행, 그리고 고체 종양 암의 보호에 중요 한 역할을 알려져 있습니다. 에 수많은 세포 하위 집합 및 고기, 종양의 면 역학적 상태에 중요 한 통찰력을 제공 하는 모두는 구성 됩니다. 이러한 면 역학적 하위 집합 추가 함께 타고 난 및 적응형 면역 반응2,3의 대다수를 구성 하는 림프 구 또는 골수성 근원의 세포로 층 화 될 수 있다. Immunotherapeutic 전략 (즉, 검사점 면역 억제제, 공상 항 원 수용 체 T-세포, 등) 튼튼한 암 유발 가능성이 있는 암 immunotherapy 분야의 최근 발전 증명 재발; 그러나, 그들은 상대적으로 단단한 종양 암4,5에서 효과 유지. 수많은 그룹 시간 치료 성공6,7을 재생할 수 및 따라서, 거기에 특별히 초점을 맞추고 전 임상 설정에서 새로운 immunotherapies 정확 하 게 평가할 필요가 남아 있다 중요 한 장애물이 나타났습니다 그들의 변조 또는8시간 극복 하는 능력.
일반적으로 시간을 특성화 하기 위해 현재 노력 중 현미경 활용 또는 항 체 면역 세포 하위 집합 및 그들의 기능9,10식별 하는 전략을 라벨 함께 cytometry 흐름. 이 두 가지 전략 현미경 세포 하위 집합의 공간 감사 있으며 cytometry 제공 높은 처리량 및 세포 변화의 광범위 한 정량화 고유 하 게 서로 다른 정보를 제공 합니다. 형광 성 다중 immunohistochemistry 지금 최대 7 매개 변수를 지원할 수, 스펙트럼 이미징 시스템 최적화에 최근 개선에도 불구 하 고 제한 된 패널 크기 어려운 광범위 한 레벨 프로 파일링 면역 이며 따라서이 기술을 자주 자세한 예약 집중 분석. 결과적으로, cytometry는 가장 널리 사용 되는 면역 프로 파일링 기법 중 하나 남아 있다. 시간 특성에 그것의 광범위 한 사용, 처리 및 얼룩을 위해 사용 되는 방법을 매우 변수는 있습니다. 가장 자주 프로토콜 활용 종양 효소 해리 (즉, collagenases, DNase, 등) 및 수동 분리 방법은 단일 셀 정지를 달성 하기 위해 다음 항 체 얼룩이 지 고 분석7. 각 방법의 장점에도 불구 하 고 수많은 그룹11이러한 기법 통해 유도 될 수 있는 광범위 한 다양성을 보여주었다. 이것은 종양 microenvironment 프로 파일링의 크로스-연구 비교 매우 어려운 동일한 murine 종양 모델을 평가 하는 경우에 합니다. 또한, 종양 세포를 평가 하기 위해 제한 된 잠재력을 제공 하는 이러한 메서드 및 종양 면역 침투 하지 구성 요소 독립적으로, 때문에 두 구성 요소는 소화 후 산재. 샘플 수량 다음 제한 멀티 패널 얼룩 및 분석, 희귀 면역학 하위 집합 특성 하려고 할 때 주요 문제 되는 (즉, 종양 관련 T-세포)12. 대량 cytometry cytometry (CyTOF), 비행 시간 등 최근 기술 42 독립적인 매개 변수13보다 큰 패널 디자인을 지 원하는 일부 시스템 셀룰러 하위 집합의 차원 높은 phenotypic 분석 허용. CyTOF 기술에 면역 프로 파일링의 엄청난 힘에도 불구 하 고 그것은 비용, 분석 전문 및 장비에 대 한 액세스 제한 된 남아 있습니다. 또한, 많은 CyTOF 프로토콜 추천14, 신호 대 잡음 비율 개선 하기 위해 면역 하위 집합의 정화 그리고 따라서 좋습니다 우리의 농축 메서드를 사용할 수는 업스트림 데이터 품질 향상을 위한 CyTOF 분석의.
여기 우리가 종양 microenvironment 소화 및 분석 분리를 침투 하는 종양 면역을 통합 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법의 목적은 종양 면역 침투 및 종양 microenvironment의 광범위 한 특성 분석을 위한 종양 세포 분수의 독립적인 높은 처리량 프로 파일링 수 있도록. 이 방법을 사용 하 여, 더 설명 전체 종양 분석의 중요성으로 피하 고체 종양 모델은 중요 한 공간 면역학이 발견 합니다. 전반적으로,이 방법은 더 정확 하 고 일관 되 게 비교할 수 샘플 사이의 종양 내에서 면역 세포 하위 집합에 대 한 풍요롭게 종양 세포와 종양의 면역 분수의 독립적인 프로 파일링을 허용 하기 때문에.

<table><tbody><tr><td>6 to 12 week old male C57BL/6 mice</td><td>Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Mice used in our tumor studies</td></tr><tr><td>MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line</td><td>Acquired from collaborator&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>70% isopropyl alcohol&amp;nbsp;</td><td>EMD Milipore&amp;nbsp;</td><td>PX1840</td><td></td></tr><tr><td>Murine surgical tool kit</td><td>World Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td>Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>24-well plate&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>T1024</td><td>Or any 24-well flat bottom plate.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI-1640 media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I&amp;nbsp;</td><td>EMD Milipore</td><td>234153</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Low Speed Orbital Shaker</td><td>BioExpress (supplier: Genemate)&amp;nbsp;</td><td>S-3200-LS</td><td>Or any orbital shaker.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Thermoregulating incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-255-27</td><td>Or any other thermo-regulated incubator</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AMRESCO</td><td>E177</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipette and tips</td><td>Eppendorf</td><td>13-690-032</td><td>Or any other pipette and tips</td></tr><tr><td>40 um Cell Strainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tubes</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Tubes</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok Syringe without needles</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep Density Gradient Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipettes</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P7212</td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bottom plates</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D8573</td><td></td></tr><tr><td>FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-5523-00</td><td>Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer</td></tr><tr><td>Thermoregulated Centrifuge</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Flow Cytometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>For 96-well cell volumetric counting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)&amp;nbsp;Clone 2.4G2&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>553141</td><td>Fc Block</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34962</td><td>Fixable viability stain</td></tr><tr><td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>47-0451-80</td><td></td></tr><tr><td>TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8-&amp;alpha; Antibody (KT15), PE</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53473&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>56-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48-4801-80</td><td></td></tr><tr><td>CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25-5982-80</td><td></td></tr><tr><td>CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46-9972-82</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563755</td><td></td></tr></tbody></table>

enrichment and characterization of the tumor immune and non-immune microenvironments in established subcutaneous murine tumors

종양 면역 microenvironment (시간) 최근 특히 immunotherapies에 대 한 단단한 종양에서 치료 응답의 중요 한 중재자로 인정 받고 있습니다. 최근 임상 발전 immunotherapy 정확 하 고 철저 하 게 종양 및 그 관련된 면역 침투 특성 재현 방법에 대 한 필요성을 강조 표시 합니다. 종양 효소 소화 및 흐름 cytometric 분석 허용 광범위 한 특성 수많은 면역 세포 하위 집합 및 고기; 그러나, 분석의 깊이 종종 fluorophore 제한 패널 설계 및 큰 종양 샘플을 확보 하는 필요의 희귀 면역 인구를 관찰에 의해 제한 됩니다. 따라서, 우리는 분리 및 농축 비 면역 종양 구성 요소에서 종양 면역 침투에 대 한 효과적이 고 높은 처리량 방법을 개발 했습니다. 설명된 종양 소화와 밀도 기반 원심 분리 기술은 종양 및 종양에 대 한 별도 특성 면역 침투 분수 및 세포 생존을 유지 있으며 따라서 종양의 광범위 한 특성을 제공 합니다 면 역학적 상태입니다. 이 방법은 하는 광범위 한 공간 면역이 단단한 종양에서 더 일관 된 전체 종양 면역학 프로 파일링 기법에 대 한 필요성을 보여주는 사용 되었다. 이 방법은 피하 고체 murine 종양; 면 역학적 특성에 대 한 효과적이 고 융통성 있는 기법을 제공 하는 전반적으로, 이 도구를 사용 하 수 있다 더 나은 종양 면역학 기능을 특성화 하는 등, 소설 immunotherapeutic 전략의 전 임상 평가.

우리의 결과 프로토콜에 설명 된 대로 비 면역 종양 구성 요소에서 분리 할 때의 중요 한 혜택을 보여 줍니다. 또한, 설립된 단단한 종양의 중요 한 면역학이 설명한 방법을 사용 하 여 설명 합니다.
많은 종양 분리 기술로 중요 한 문제는 가혹한 소화 조건 (즉, 높은 온도, 부적절 한 영양 공급, 등)의 결과로 수시로...

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Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

여기 우리가 설립된 피하 종양에서 종양 면역 및 비 면역 microenvironment의 구성 요소를 풍부 하 게 분리 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 종양 면역 침투 및 비 면역 종양 분수는 종양 면역 microenvironment의 포괄적인 특성화를 허용할 수 있는 별도 분석에 대 한 수 있습니다.

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

enrichment-characterization-tumor-immune-non-immune-microenvironments

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.6K 조회수.  Baylor College of Medicine. 여기 우리가 설립된 피하 종양에서 종양 면역 및 비 면역 microenvironment의 구성 요소를 풍부 하 게 분리 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 종양 면역 침투 및 비 면역 종양 분수는 종양 면역 microenvironment의 포괄적인 특성화를 허용할 수 있는 별도 분석에 대 한 수 있습니다.

비디오: Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

연구

암 연구학

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been shown to be responsible for tumor initiation, metastasis, and drug resistance. Therefore, it is important to develop specific TIC-targeting therapy in addition to current chemotherapy strategies, which mostly focus on the bulk of non-TICs. In order to further understand the mechanism behind the malignancy of TICs, we describe a method to isolate and to characterize TICs in human sarcomas. Herein, we show a detailed protocol to generate patient-derived xenografts (PDXs) of human sarcomas and to isolate TICs by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using human leukocyte antigen class I (HLA-1) as a negative marker. Also, we describe how to functionally characterize these TICs, including a sphere formation assay and a tumor formation assay, and to induce differentiation along mesenchymal pathways. The isolation and characterization of PDX TICs provide clues for the discovery of potential targeting therapy reagents. Moreover, increasing evidence suggests that this protocol may be further extended to isolate and characterize TICs from other types of human cancers.

We describe a detailed protocol for the isolation of tumor-initiating cells from human sarcoma patient-derived xenografts by fluorescence-activated cell sorting, using human leukocyte antigen-1 (HLA-1) as a negative marker, and for the further validation and characterization of these HLA-1-negative tumor-initiating cells.

육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 발하는 세포의 격리 및 특성화

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard subcutaneous flank models include procedural ease and the ability to monitor tumor progression and response without invasive imaging. Such models are often inconsistent in translational clinical trials and have limited biologically relevant characteristics with low proclivity to produce metastasis, as there is a lack of a native microenvironment. In comparison, orthotopic xenograft models at native tumor sites have been shown to mimic the tumor microenvironment and replicate important disease characteristics such as distant metastatic spread. These models often require tedious surgical procedures with prolonged anesthetic time and recovery periods. To address this, cancer researchers have recently utilized ultrasound-guided injection techniques to establish cancer xenograft models for preclinical experiments, which allows for rapid and reliable establishment of tissue-directed murine models. Ultrasound visualization also provides a noninvasive method for longitudinal assessment of tumor engraftment and growth. Here, we describe the method for ultrasound-guided injection of cancer cells, utilizing the adrenal gland for NB and renal sub capsule for ES. This minimally invasive approach overcomes tedious open surgery implantation of cancer cells in tissue-specific locations for growth and metastasis, and abates morbid recovery periods. We describe the utilization of both established cell lines and patient derived cell lines for orthotopic injection. Pre-made commercial kits are available for tumor dissociation and luciferase tagging of cells. Injection of cell suspension using image-guidance provides a minimally invasive and reproducible platform for the creation of preclinical models. This method is utilized to create reliable preclinical models for other cancers such as bladder, liver and pancreas exemplifying its untapped potential for numerous cancer models.

Here, we present a protocol to utilize ultrasound-guided injection of neuroblastoma (NB) and Ewing's sarcoma (ES) cells (established cell lines and patient-derived tumor cells) at biologically relevant sites to create reliable preclinical models for cancer research.

초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 Xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop better therapeutic strategies, understanding tumor microenvironmental factors that contribute to the treatment resistance is important. A major impediment to understanding disease mechanisms and improving therapy has been a lack of murine cell lines that resemble the aggressive and metastatic nature of human HNSCCs. Furthermore, a majority of murine models employ subcutaneous implantations of tumors which lack important physiological features of the head and neck region, including high vascular density, extensive lymphatic vasculature, and resident mucosal flora. The purpose of this study is to develop and characterize an orthotopic model of HNSCC. We employ two genetically distinct murine cell lines and established tumors in the buccal mucosa of mice. We optimize collagenase-based tumor digestion methods for the optimal recovery of single cells from established tumors. The data presented here show that mice develop highly vascularized tumors that metastasize to regional lymph nodes. Single-cell multiparametric mass cytometry analysis shows the presence of diverse immune populations with myeloid cells representing the majority of all immune cells. The model proposed in this study has applications in cancer biology, tumor immunology, and preclinical development of novel therapeutics. The resemblance of the orthotopic model to clinical features of human disease will provide a tool for enhanced translation and improved patient outcomes.

Here we present a reproducible method for developing an orthotopic murine model of head and neck squamous cell carcinoma. Tumors demonstrate clinically relevant histopathological features of the disease, including necrosis, poor differentiation, nodal metastases, and immune infiltration. Tumor-bearing mice develop clinically relevant symptoms including dysphagia, jaw displacement, and weight loss.

종양 면역 프로 파일링에 대 한 쥐 및 치료 반응 평가에 편평 세포 암 종 세포의 intramucosal 접종

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce multiple tissue and organ damage. Despite recent advances and therapeutic approaches, the overall morbidity has remained unsatisfactory especially in patients with underlying parenchymal abnormalities. In the context of aggressive cancer growth and metastasis, surgical I/R is suspected to be the promoter regulating tumor recurrence. This article aims to describe a clinically relevant murine model of liver I/R and colorectal liver metastasis. In doing so, we aim to assist other investigators in establishing and perfecting this model for their routine research practice to better understand the effects of liver I/R on promoting liver metastases.

We describe in detail a clinically relevant colorectal cancer liver metastases (CRLM) tumor model and the influence of liver ischemia reperfusion (I/R) in tumor growth and metastasis. This model can help to better understand the mechanisms underlying surgery-induced promotion of liver metastatic growth.

허혈 재관류 손상의 설정에서 전이성 간 종양의 뮤린 모델

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

의학

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory cytokine interleukin-1 alpha (IL-1&#945;) has been evaluated as an anticancer agent in several preclinical and clinical studies. However, dose-limiting toxicities, including flu-like symptoms and hypotension, have dampened the enthusiasm for this therapeutic strategy. Polyanhydride nanoparticle (NP)-based delivery of IL-1&#945; would represent an effective approach in this context since this may allow for a slow and controlled release of IL-1&#945; systemically while reducing toxic side effects. Here an analysis of the antitumor activity of IL-1&#945;-loaded polyanhydride NPs in a head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) syngeneic mouse model is described. Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells were injected subcutaneously into the right flank of C57BL/6J mice. Once tumors reached 3-4 mm in any direction, a 1.5% IL-1a - loaded 20:80 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPTEG: CPH) nanoparticle (IL-1&#945;-NP) formulation was administered to mice intraperitoneally. Tumor size and body weight were continuously measured until tumor size or weight loss reached euthanasia criteria. Blood samples were taken to evaluate antitumor immune responses by submandibular venipuncture, and inflammatory cytokines were measured through cytokine multiplex assays. Tumor and inguinal lymph nodes were resected and homogenized into a single-cell suspension to analyze various immune cells through multicolor flow cytometry. These standard methods will allow investigators to study the antitumor immune response and potential mechanism of immunostimulatory NPs and other immunotherapy agents for cancer treatment.

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

A standard protocol is described to study the antitumor activity and associated toxicity of IL-1&#945; in a syngeneic mouse model of HNSCC.

폴리안하이드라이드 IL-1α 나노입자의 생체 내 항종양 활성 평가

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

피하 종양 모델에서 종양 침투 백혈구 하위 집합의 평가

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Patient-derived Xenograft Modeling: A Technique to Generate Melanoma Mouse Models

Source: Min Xiao et al. <a href="https://www.jove.com/v/59508"> A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model</a>. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, human-derived melanoma cells are implanted subcutaneously into the flank region of an immunocompromised mouse. The PDX model allows preclinical investigation of melanoma cells that better recapitulate the tumor heterogeneity and melanoma aggressiveness observed in in vivo conditions.

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