이 작품은 건강 보조금 EY0081 및 5T32UY07145 국립 연구소와 기사단 아이 재단에 의해 지원되었다. 제이슨 Rihel는 생명 과학 연구 재단의 브리스톨 - Squibb의 연구원입니다.

이 프로토콜은 자신의 실험실에서 빛의 단위 및 감소에 zebrafish 애벌레의 Visual 모터 반응을 수행하는 단계를 설명합니다. Zebrafish 행동 연구를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 그들은 유지하기 쉬운, 그들은 대형 클러치 크기를 가지고 있고, 그들은 신속하게 개발할 수 있습니다. 예를 들어, zebrafish 애벌레의 눈을 개발의 일 3 그들이 놀라게 응답을 전시하는 동시에 빛에 반응하고 있습니다. 1 부 : 96 잘 접시에 각각의 물고기를 도금 <ol><li> 28 어두운 / 라이트 사이클에 따라 WT 애벌레의 성장 ° C 이상의 4 일 게시물 수정 (DPF)까지. 우리의 일반 조명 : 어두운주기 오전 9 시에 시작하고, 조명 10 시간 OFF, 11:00 PM에 시작 불을 14 시간입니다. 최상의 행동의 결과를 얻으려면, 인구 과잉되지 않도록, 우리는 일반적으로 하나의 배양 접시에있는 더 이상 50 이상의 유충을 유지. </li><li> 4 DPF 후, zebrafish는 96 - 웰 플레이트에 전송할 준비가 된 것입니다. 애벌레 더 수영 공간을 제공하기 위해, 우리는 일반적으로 650 μl의 큰 잘 크기가 96 - 웰 플레이트를 사용하지만, 표준 96 - 웰 플레이트가 잘 작동합니다. 플라스틱 전송 pipet을 사용하여 부드럽게 당들이 한 유충을 전송하기만하면됩니다. </li><li> 우물에 물고기를 전송 후, 수면이 우물의 상단에 거의 플러시는 그러한 정도로 물고기 물 각 우물을 작성하십시오. 어느 overfilling 또는 잘 underfilling하면 녹음 카메라 광학 문제를 일으킬 수 있습니다. 또한, 우물에 거품을 소개 않도록주의 가져가라. </li></ol> 2 부 : 녹음 장치 조사 프로토콜의이 부분을 들어, 구성 요소를 식별하기 위해 필름을 참조하여 기록 장치의 우리 설정할를 맡은지하시기 바랍니다. <ol><li> 레코딩 챔버 내부 96 - 웰 플레이트를 위치로 잘 정의된 장소입니다. </li><li> 카메라 뒤쪽에 위치하고있는 상자에서 거울을 사용하여 접시에 초점을 맞추고 있습니다. 이 거울의 각도는 장소에 거울을 보유하고있는 나사를 돌려하여 조정할 수 있습니다. </li><li> 녹음 챔버는 적외선 발광 다이오드 (LED)에 의해 바닥에서 조명합니다. 이것은 카메라도 어둠 속에서 물고기를 볼 수 있습니다. 유충은 IR 조명을 검색할 수 없습니다이 지속적인 IR 조명이 실험에 영향을주지 않도록. 화이트 LED는 아래에서 녹화 실 밝게. 그들은 IR 조명에서 별도로 제어됩니다. 위 또는 측면부터 흰색 빛으로 챔버를 조명하는 것은 확실히 가능하지만, 이러한 경우에주의가 강한가 카메라를 방해할 수있는 물의 표면에 묻은 glares 피하기 위해 이동해야합니다. </li><li> 몇 시간 이상 지난, 부드럽게 실험 기간 동안 일정한 온도를 유지하기 위해 물을 실행과 챔버를 채우는 것을 실험. 물의 일정한 흐름을 수행하는 한 가지 방법은 전형적인 수중 수족관 히터와 28 °로 가열 작은 수족관 펌프에 의해 저수지에서 물을 펌프하는 것입니다. </li><li> 객실에서 이탈 진동을 최소화하려면, 전체 기록 장치는 무거운 균형을 테이블 위에 앉아해야합니다. </li></ol> 파트 3 : 비디오 추적의 컴퓨터 그리드와 96 - 웰 플레이트의 정렬 소프트웨어 <ol><li> 레코딩 챔버에 물고기가 들어있는 96 - 웰 플레이트를 놓습니다. </li><li> 물 목욕을 사용할 때, 서서히 수위에게 접시에 흘리고 않고 조정할 수있는 기회를 제공 물에 접시를 놓습니다. 또는, 물의 흐름을 차단 판을 추가하고, 다음 흐름을 재개한다. 또한, 장소에 96 - 웰 플레이트를 잡아 봄이나 고무 밴드를 사용해야합니다. </li><li> 뷰포인트 Videotrack 소프트웨어, 실험의 모든 애벌레가 컴퓨터 화면에 볼 수 있는지 확인합니다. 소프트웨어의 컨트롤을 사용하여, 각각의 물고기 모양의 격자의 사각형 내에 그러한 접시의 우물과 비디오 추적 소프트웨어의 격자를 맞춥니다. 추적 컴퓨터가 컴퓨터 격자를 misalign면 물고기의 움직임을 일부 손실될 수 있습니다,이 상자의 각 별도로 운동을 계산합니다. 심지어 악화 두 인접한 물고기는 동일한 영역을 차지합니다 한 생선으로 계산됩니다. 이 단계는 모든 레코딩을 위해 매우 중요합니다. </li><li> 정렬 후, 프로그램 불이 켜거나 가야 때 타이밍. 우리는 일반적으로 상자에 가볍거나 어두운 적응 3 시간 모두 기본 활동 수준을 얻을 수뿐만 아니라 유충에게 pipetting 및 처리 다음과 진정 기회를 제공합니다. 기준 후에, 우리는 다음 OFF 라이트 30 분 뒤에 불을 30 분 대체하고, 여러 번 반복합니다. </li><li> 다음 레코딩 챔버의 문을 닫고 녹음을 시작합니다. </li><li> (영화를 참조 실제로, 우리는 초당 각 물고기의 활동을 기록하지만, 실제로 뷰포인트 소프트웨어는 프레임 데이터가 프레임을 기록데이터 수집의 시범을위한). 프레임 당 최소 픽셀 변경에 대한 임계값을 설정하면 특정 카메라와 조명 설정에 다소 달라집니다. 우리의 설치를위한, 우리는 일반적으로 4 픽셀의 임계값을 사용하여, 그 적은 4 개 이상의 픽셀이 변화하는 경우, 그것이 배경 간주됩니다있다. 4 개 이상의 픽셀이 이동하는 경우, 그것은 물고기가 이동을 나타냅니다. 우리는 경험적으로이 단절은 거의 모든 애벌레 수영 및 회전 움직임을 감지 사실을 확인했습니다. </li><li> 녹음 상자가 상당히 잘 유충을 분리에도 불구하고, 방에 불을 끄고 같은 폐쇄하고 개방 문을 방에, 댄스 파티를 열, 또는 운동 루틴을하고 같은 기계적 노이즈가 방해를 최소화하는데주의를 기울여야. </li></ol> 4 부 : 데이터 분석 <ol><li> 실험이 완료되면, 엑셀 시트로하거나 원하는 분석 제품군에 수집된 데이터를 전송합니다. </li><li> 첨부된 엑셀 시트는 데이터처럼 보일지 모르지만 어떤의 예입니다 : 그것은 전체 실험을 통해 그 동안 맛있는 생선은 초 당 각 유충의 실험과 활동의 시작부터 초 단위로 시간을 (에서 보조 파일 예제 데이터를 참조가 포함되어 있습니다 이 페이지의 파일 섹션). </li><li> 그림 1은 단일 유충의 활동의 예를 보여줍니다. 그림 2는 40 WT의 zebrafish의 애벌레의 평균의 대표 성분이다. 은 ON과 OFF 평균 응답은 유수와 일치합니다. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_9/923_Figure-02.png" alt="그림 1" width="569" height="398" /> 그림 1 : 단일 물고기의 활동 30 분 빛을 기간을 교류하고 OFF에 대응 5 DPF에서 단일 WT 물고기의 활동.. ON 응답은 검은색 화살표와 빨간색 화살표로 OFF 반응으로 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_11/923_Figure-03.png" alt="그림 2" width="577" height="387" /> 그림 2 : 40 물고기의 평균 활동을 30 분 빛을 기간을 교류하고 OFF에 대응 5 DPF 40 WT 생선의 평균 활동.. 가 ON 평균 (검은 화살표)과 OFF (빨간색 화살표) 반응 유명 일관하고 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 그림 3은 실험의 모든에 사용되는 실험 개요의 도식 개요입니다. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_12/923_Figure-04.png" alt="그림 3" width="530" height="479" /> 그림 3. 시각 운동 반응 (VMR) 시험의 실험 설계.) 개인 물고기는 기록 챔버에서 96 - 웰 플레이트에 배치됩니다. 각 물고기의 활동은 초당 측정됩니다. B) 생선은 그들을 해결하고 기본 활동 수준을 얻기 위해 어둡거나 밝은 적응의 기간을 부여하고 있습니다. 30 분 ON 조명과 조명의 기간은 OFF 3 시간 총 연속적으로 소개하고 있습니다. 이 다이어그램 Prober 외에서 맞게되었다., 2006. 비주얼 모터 응답 그래프는 어떤 형태입니까? 우리는 빛의 단위 및 감소에 WT 물고기의 ON과 OFF 반응을 측정. 이러한 반응은 눈 기능에 의존했고 확인하기 위해, 우리는 어떤 눈을 개발하지 확인해의 돌연변이의 활동을 측정. 그림 4는 WT 동물뿐 아니라 확인해의 돌연변이에서 얻은 평균 활동을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_13/923_Figure-05.png" alt="그림 4" width="489" height="212" /> 그림 4 : WT 물고기는 측면 눈을에 의해 중재 아르 답변을 켜거나 취소가 불 30 분 가벼운 OFF 30 분에 대응하여 5 DPF에서 zebrafish 애벌레의 전위의 동작은 초당 기록됩니다.. 각 추적 120 개인 WT (블루 추적) 또는 확인해 돌연변이의 애벌레 (오렌지 추적) 3 실험을 통해 녹화에서 480 응답의 평균을 나타냅니다. 확인해의 돌연변이 크게 증가하거나 감소 빛 중 자신의 활동을 증가하고 활동의 낮은 기본 수준을 필요가 없습니다. 이 수치는 Emran 외., 2007 년부터 조정되었습니다. NRC 돌연변이 물고기에서 Visual 모터 응답. NRC 돌연변이 OKR 테스트를 기반으로 상당히 운이 좋았다고 생각했다. NRC 돌연변이에서, photoreceptor 단말기가 제대로 형성하지 않습니다 및 시각 경로에서이 심각하게 1 손실이 크다. 이러한 돌연변이 물고기의 망막 신경절 세포의 녹음들은 주로 OFF 타입의 신경절 세포 응답, 일부 비정상적인 ON - OFF지만, 2 형 반응없이 순수한을 전시하는 것으로 나타났습니다. VMR 테스트를 사용하여 우리는 NRC 돌연변이가 정상 OFF - 응답 및 지연과 느린 ON - 반응을 가지고 것으로 나타났다 (SEE 그림 5). 따라서 NRC 돌연변이가 이전에 생각이 완전히 장님이되지 않습니다. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_14/923_Figure-06.png" alt="그림 5" width="591" height="244" /> 그림 5 : NRC의 mutats 빛의 농도의 변화에 대응하여 그들의 활동을 증가 행동 응답 WT 5 DPF에서 NRC 돌연변이 애벌레부터 빛과 OFF로.. 각 성분은 각 유전자형 120 개인 생선에서 480 응답의 평균을 나타냅니다. NRC의 돌연변이의 평균 전위의 행동 (분홍색 흔적)은 약간으로 WT 물고기 (블루 성분)에 비해 감소했지만 자극 OFF 빛을 다음 활발한 남아있다. WT 물고기의 반응 조명에 비해 수월하기 위해 NRC 돌연변이 응답의 속도가 느린 상승 시간을 확인합니다.

<ol>
	<li>Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+is+arrested+in+retinal+photoreceptors+of+the+zebrafish+nrc+mutant.">Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant.</a> J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).</li><li>Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OFF+ganglion+cells+cannot+drive+the+optokinetic+reflex+in+zebrafish.">OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).</li><li>Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocretin/orexin+overexpression+induces+an+insomnia-like+phenotype+in+zebrafish.">Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish.</a> J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).</li></ol>

우리가 영화에서 보여주 실험 절차 WT 생선의 대표입니다. 그러나 이러한 실험은 돌연변이 물고기뿐만 아니라 (대표 결과 섹션을 참조) analogously 할 수 있습니다. 우리는 최적의 제어 목적 검사기 보드 개요에서 같은 접시 플레이트 WT 생선과 돌연변이 물고기로하는 것이 좋습니다. WT 물고기 같은 접시에 돌연변이 물고기를 사용할 때 당신은 물고기의 종류가 각 우물에 도금 있었는지 적어 있는지 확인하십?...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microplate devices</td>
<td>Tool</td>
<td>Whatman</td>
<td>7701-1651</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipetes</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>202205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish water</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>refer to reference #4</td>
</tr>
<tr>
<td>Recording chambers (Zebrabox)</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Videotrack Software</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities 

optokinetic 반사 (OKR)는 기본적인 시각 반사 대부분의 척추 동물에 의해 전시 및 영상 장면에 상대적으로 눈에 안정화에 중요한 역할을합니다. 그러나, OKR는 동물 이동 줄무늬를 감지해야하며 그것은 OKR을 전시하지 않는 물고기가 완전히 장님이되지 않을 수도 있습니다. 하나의 돌연변이 zebrafish, 노 optokinetic 응답 C (NRC)는 어떤 조명 조건 테스트 상당히 운이 좋았다고보고했습니다 아래에는 OKR이 없습니다. 이전, 우리는 OFF - 신경절 세포 활동이 돌연변이에 기록될 수 것으로 나타났습니다. 같은 NRC 돌연변이로 노 OKR와 돌연변이 물고기가 간단한 조명 증가 그리고 우리가 시각 모터 행동 분석 (VMR)를 개발 감소를 검색할 수 있는지 여부를 확인합니다. 이 분석에서는 단일 zebrafish의 애벌레는 자동으로 비디오 추적 시스템을 사용하여 유충의 동시 모니터링을 허용하는 96 - 웰 플레이트의 각 우물에 배치됩니다. 빛 30 분 30 분 가벼운 OFF 각 유충의 전위의 반응은 기록하고 계량했다. WT 생선은 낮은보다 기본 활동을 반환 다음 놀라게 반응으로 알려진 불을,시 모터 활동의 간단한 증가를 동결했다. WT의 물고기 (몇 분 이상) 기준 전위의 활동에 수익을 또한 급격하게 조명을 OFF 다음 즉시 전위의 활동을 증가만을 점차. NRC의 돌연변이 WT 물고기 OFF 가벼운 비슷하게 반응하지만, WT 물고기에 비해 자신의 평균 활동에 약간의 감소를 나타냅니다. NRC 돌연변에서 빛에 대한 응답으로 모터 활동이 지연하고 둔한입니다. 로 반응 WT 조명에 비해 수월하기 위해 NRC 돌연변이의 응답 속도가 느린 상승 시간이 있습니다. 결과는 NRC 물고기 완전히 맹인 아니라는 것을 나타냅니다. teleosts가 아닌 망막 조직을 통해 빛을 감지할 수 있기 때문에, 우리는 가벼운 강도의 변화에​​ 즉각적인 행동 반응이 완전히 개발의 초기 단계에서 눈을 부족 chokh (체크해봐) 돌연변를 사용하여 그대로 눈을 필요는 것을 확인. 우리 VMR의 분석에서 확인해의 돌연변이 측면 눈이 문제를 중재 것을 보여주는 하나 ON 빛 또는 OFF로 더 놀라게 응답을 전시하지 않습니다. VMR의 분석 여기 빛의 농도의 변화에​​ 대응하는 zebrafish 애벌레의 능력을 테스트하지 않습니다 잘 설립 OKR 분석을 보완 설명했다. 또한 VMR 분석의 자동화 시각적 반응을 중심 가벼운 강도의 결함에 대한 높은 처리량 검사라는 것으로.

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A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

우리는 빛의 단위 및 감소에 대응하기 애벌레 zebrafish의 모터 출력을 quantitate하는 비주얼 모터 응답을 개발했습니다. 우리는 또 다른 비전 분석, optokinetic 반사에 의해 시험을 할 때 상당히 운이 좋았다고 생각했던 optokinetic 응답 (NRC) 돌연변이, 아무도를 포함하여 zebrafish 비전 돌연변을 조사.

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

16.2K 조회수.  Harvard. 우리는 빛의 단위 및 감소에 대응하기 애벌레 zebrafish의 모터 출력을 quantitate하는 비주얼 모터 응답을 개발했습니다. 우리는 또 다른 비전 분석, optokinetic 반사에 의해 시험을 할 때 상당히 운이 좋았다고 생각했던 optokinetic 응답 (NRC) 돌연변이, 아무도를 포함하여 zebrafish 비전 돌연변을 조사.

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Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

급성 신장 상해를 공부하기 위해 Zebrafish 애벌레의 정맥 Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

연구

생물학

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Zebrafish의 Pronephros의 레이저 절제는 신장 상피 조직이 재생된를 공부

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

3D 원자력기구의 변화를 공부하기 위해 3D 보존 된 계면 핵에 결합 Immunofluorescence와 DNA의 물고기

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

체외 메틸화 분석에서 단백질 아르기닌 메틸화를 공부합니다

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

파장과 산화 스트레스에 레드 / 근적외선 치료의 강렬의 범위의 효과의 평가를위한 방법<em&gt; 체외</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The Drosophila&#160;melanogaster Malpighian (renal) tubule offers an unparalleled opportunity to study the molecular mechanisms of epithelial ion transport, due to the powerful genetics of this organism and the accessibility of its renal tubules to physiological study. Here, we describe the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated fly renal tubules, with the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid. This assay allows study of transepithelial fluid and ion fluxes of ~20 tubules at a time, without the need to transfer the secreted fluid to a separate apparatus to measure ion concentrations. Genetically distinct tubules can be analyzed to assess the role of specific genes in transport processes. Additionally, the bathing saline can be modified to examine the effects of its chemical characteristics, or drugs or hormones added. In summary, this technique allows the molecular characterization of basic mechanisms of epithelial ion transport in the Drosophila tubule, as well as regulation of these transport mechanisms.

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

This protocol describes the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated Malpighian (renal) tubules from Drosophila melanogaster. In addition, the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid, allowing calculation of transepithelial ion flux, is described.

램지 분석의 사용은 유체 분비 및 이온 플럭스 요금을 측정하는<em&gt; 초파리</em&gt; Malpighian하는 Tubule

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

시험 관내 분석에서 포스파티딜 메틸화 된 역가를 측정하는 방법

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

라이트 농도의 변화에 Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이