이 작품은 혁신 게놈 캐나다, 온타리오 유전체학 연구소, 혁신의 온타리오 교육부, 그리고 JG에 건강 연구 기금의 캐나다 연구소와 AE 적목 표현 E.에 대한 캐나다 재단에서 기금에 의해 지원되었다 대장균은 변형 DY330는 도널드 L. 법원 (국립 암 연구소, 프레데릭, MD)에서 일종의 선물이었다.

1. E.의 유전자 별 SPA 태그 추가 구축 대장균 DY330 변형 <ol><li> 플라스미드 pJL148은 SPA-태그 DNA 시퀀스와 kanamycin 항생제 저항 아이콘 카세트 (관 R)를 포함한는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭 7의 템플릿으로 사용됩니다. 27 BP (5&#39;-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 &#39;) 태그 특정 앞으로 프라이머와 프레임에서 대상 유전자 정지 코돈 즉시 상류에 위치한 45 NT 유전자 특정 앞으로 프라이머, 그리고 45 NT 유전자 특정 역방향 프라이머, 즉시 위치 94 : 27 BP (5&#39;-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT의 -3 &#39;) 태그 특정 역 프라이머와 프레임에서 대상 유전자 정지 코돈의 하류는 다음과 PCR 사이클 조건을 사용하여 pJL148에서 SPA-태그와 칸 R 카세트를 증폭하는 데 사용됩니다 5 분에 대한 ° C, 1 분, 68 1 분, 55 ° C ° 10 분에 68 ° C에 이어 2 분 10 초에 C에 대해 94 ° C의 30주기. 이 증폭 시퀀스는 서비스를 제공ectopically 소개 λ - 레드 상동 재조합 기계를위한 S 기판 (아래). </li><li> PCR 제품은 electroporation을 방해 할 수 염을 제거하는 Qiaquick PCR 정화 키트를 사용하여 정화하고 있습니다. 정화 PCR 제품은 이후 λ - 레드 재조합 기기는 10 표현되는 DY330 변형에서 특정 유전자의 3 &#39;끝 (기본 정지 코돈의 바로 상류)에 통합하는 타겟팅됩니다. </li><li> DY330 λ - 레드 표현 스트레인는 180 rpm으로 흔들어하여 32 ° C에서 2 ML Luria-Bertani (LB) 매체에 밤새 성장하고 있습니다. 밤 문화의 한 ML은 이후 500 ML 원뿔 플라스크에 70 ML 신선한 LB 매체에 주사합니다. inoculum는 OD 600 ~ 0.8에 도달 할 때까지 180 rpm으로 흔들어하여 32 ° C에서 성장하고 있습니다. </li><li> 문화는 세포 ° C 부드럽게에 흔들림에 의해 42에 물 목욕에 휴대용 술병을 잠복기에 의해 유도되는 신선한 250 ML 원뿔 플라스크로 전송됩니다15 분 180 RPM. 즉시 유도 후 병이 흔들리고있는 최소 30 분 동안 얼음 물 슬러리 욕조에 incubated 수 있습니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 문화는 바로 사전 차가운 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브로 옮겨와 4에서 6 분에 3,993 XG에서 원심 분리를 받게 ° C.합니다 셀 펠렛은 50 ML 얼음처럼 차가운 멸균 물에 resuspended과 4 ° C.에서 6 분에 3,993 XG 다시 한 번 centrifuged 수 있습니다 셀 펠렛 그런 다음 차가운 물 1 ML에 resuspended와 1.5 ML Effendorf 튜브로 옮겨, 4 ° C.에 20 초에 최대 속도로 centrifuged합니다 얼음 냉수 두 개 또는 세 세척 단계 후, 세포 펠렛은 전기 관할 세포의 결과로, 얼음처럼 차가운 멸균 물 700 μl에 마지막으로 resuspended 있습니다. </li><li> electroporation을 통해 정화의 amplicon 중 하나 μl은 전기 관할 세포의 40 μl로 소개되어 있습니다. 2.5 KV, 펄스 25 μF : 세포는 다음과 같이 설정 바이오 RAD GenePulser II에 electroporated 아르200 Ω의 컨트롤러입니다. 상동 재조합과 통합 한 후 성공적으로 염색체에 태그 / 카세트를 재결합 transformants는 관 (그림 1A)에 대한 저항에 따라 선택됩니다. 여러 transformants는 서양의 SPA 태그의 국기 epitopes에 대한 선택입니다 안티 - 플래그 M2 항체와 SPA 태그 융합 단백질의 정확한 생성 (즉, 긍정적 신호)를 확인하는 blotting에 대해 선택됩니다. </li><li> 확인 카르복시 말단 SPA 태그 융합 스트레인은 ​​SPA 정화 프로토콜을 사용하여 수확 세포 용해 단백질 복합체를 분리 할 수​​있는 대규모의 배양입니다. 연관성 태그 정화 절차에 관여 단계의 개요는 그림 1B에 표시됩니다. </li></ol> 2. 배양 및 Sonication <ol><li> SPA 태그 E. 100 μl의 예방 50 ML 훌륭한 국물 (TB)로 대장균의 글리세롤 주식은 액체 매체는 25 μg / ML O의 50 μl로 보충250 ML 원뿔 플라스크에 F 칸 솔루션입니다. 32 ° C.에서 밤 문화를 성장 참고 : 변형 DY330의 온도 inducible의 λ 레드 카세트가 온도에 민감한 억제 (10)의 통제하에 있기 때문에 SPA 태그 대장균의 변종은 32 ° C.에 성장하고 있습니다 </li><li> 4리터 플라스크에 관의 25 μg / ML로 보충 990 ML 신선한 TB로 밤 문화의 10 ML을 전송합니다. OD 600 ~ 2-3에 도달 할 때까지 문화는, 32의 ° C 상수는 5-6 시간에, 250 rpm으로 흔들어와 함께 성장하고 있습니다. </li><li> 1리터 E.를 전송 대장균은 SPA 태그 문화 원심 분리 병을 청소하고 15 분에 Beckman의 ° C J6-HC의 원심 분리기 @ 3,993 XG 4에서 셀을 회전합니다. </li><li> 표면에 뜨는는 원심 분리 병에서 제거됩니다. E.를 Resuspend sonication 버퍼의 25 ML과 대장균 세포 펠릿. 항상 얼음에 원심 분리 병을 유지 있는지 확인하십시오. </li><li> resuspended 펠렛은50 ML 폴리 프로필렌 팔콘 튜브로 옮겨와 액체 질소를 사용하여 냉동. 냉동 세포는 -80 ° C에서 장기 사용을 위해 저장됩니다. </li><li> 이전 sonication에, 얼음에 알약을 유지하여 완전히 냉동 세포를 해동. 해동 샘플은 sonication을 위해 얼음에 위치 멸균 스테인레스 스틸 컵으로 전송됩니다. 프로브가 샘플로 잠수 3 분 동안 sonicated 수 있습니다. 추가 2 분은 과열에서 샘플을 냉각 할 수 있습니다. </li><li> sonicated 세포 lysate은 사전 차가운 멸균 원심 분리 관에 전송하고, 두 번 15 분을 위해 JA-17 로터 @ 35,267 XG (16,000 RPM)를 사용하여 Beckman의 원심 분리기에서 4 ° C에서 원심 분리를 받게됩니다. 참고 : 우리는 막 단백질이있는 소수의 모르기 때문에 막 단백질 정화의 경우, sonicated 세포 lysate는 15 분에 한 번만 centrifuged 있으며, 그 펠렛이나 표면에 뜨는 분수의 하나입니다. 따라서 가상을 초과하는 손실을 방지하기brane 단백질, 우리는 15 고속 원심 분리의 분, 1 %의 세제가 막 단백질을 solubilize하는 데 사용되는 표면에 뜨는가 이후 (아래 단계 참조) 정화에 대한 처리의 세포를 스핀. </li><li> 원심 분리 관에서 표면에 뜨는는 신중하게 50 ML 폴리 프로필렌 팔콘 튜브로 옮겨와 액체 질소를 사용하여 냉동하고 있습니다. sonicated 냉동 세포 추출물은 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 6 개월 최대 기간 동안 저장됩니다. </li></ol> 3. 친 화성 정제 <ol><li> 사용하기 전에, 안티 - 플래그 M2 구슬의 100 μl은 AFC 버퍼의 10 권 (30 MM 트리스 - HCL, 150 MM NaCl, 0.1 %의 세제, 그리고 0.1-0.5 MM TCEP [트리스 (2 - carboxyethyl) phosphine에 의해 씻겨 있습니다 - 세제없이 염산])와 환원제 TCEP (트리스 (2 - carboxyethyl) phosphine). </li><li> 냉동, sonicated 세포 추출물은 차가운 물에 튜브를 삽입하여 해동합니다. 해동 세포 추출물은 benzo 3 μl와 incubated 수 있습니다4 ° C.에 30 분을위한 nase nuclease 이 혼합물에, 비 이온 세제를 추가 트리톤 X-100 (세제의 최종 농도가 0.1 %이어야 함) 및 안티 플래그 M2 아가로 오스 비즈 200 μl 중지.주세요 참고 : 모든 수용성 단백질 purifications를 들어, 0.1 %는 트라이 튼 X-100가 아닌 특정 흡착을 최소화하기 위해 사용되는 곳으로 막 단백질 등 C12E8 (Octaethylene 글리콜 dodecyl 에테르) 등 다양한 온난 한 비 이온 세제, DDM을 (정화를위한 N-Dodecyl β-D-maltoside)와 말토오스 - neopentyl 글리콜 (MNG)는 solubilization을 향상시키기 위해 1 %의 세제 농도에서 사용할 수 있습니다. 다른 세제는 막 단백질의 solubilization 효율을 변화 때문에, 그것은 하나 이상의 세제를 사용하여 독립적 인 단백질 purifications을 수행하는 것이 좋습니다. </li><li> 내용은 부드럽게 ° C가 LabQuake 흔드는을 사용하여 4에서 3 시간 동안 튜브를 회전하여 혼합합니다. 회전 3 시간 후, 관은 6 분에 1,700 XG에서 centrifuged 있습니다. 표면에 뜨는는 r이된다느슨한 구슬 펠렛을 방해하지 않고, 최대한 신중하게 emoved. </li><li> 펠렛은 남아있는 표면에 뜨는에 resuspended 후 0.8 X 4cm 바이오 RAD 폴리 프로필렌 사립 칼럼으로 전송됩니다. eluates 중력 흐름에 의해 배출 할 수 있도록, 컬럼의 하단 콘센트 플러그를 제거하려면 확인하십시오. TEV 절단 단계로 열 다섯 번 씻으십시오. </li><li> 세척 eluates을 빨아 후, 열 하단의 출구가 닫힙니다. 같은 열까지 절단은 열에 TEV 단백 분해 효소와 1X AFC 버퍼 400 μl의 ~​​ 5-10 μl (50 단위)를 추가하여 수행됩니다. 캡 열 상단을 닫습니다 있는지 확인하십시오. 구슬을 포함하는 열은 LabQuake 흔드는을 사용하여 ° C 박 4에서 하루 아침에 부드럽게 회전합니다. </li><li> 열 하단에있는 상단 및 콘센트 플러그에 뚜껑을 제거하고, (10)에 의해 쓸려 calmodulin-세 파로스 비즈 200 μl 정지를 포함한 새로운 칼럼으로 TEV 절단 한 후 복구 eluates을 배수calmodulin 바인딩 버퍼의 권. </li><li> 상단과 열 하단의 모두 단단히 고정되며, 열에서 내용은 ° C LabQuake 흔드는을 사용하여 4에서 3 시간에 돌려 부드럽게 혼합되어 있습니다. </li><li> 회전 3 시간 후, eluate은 열 상단 캡과 하단에 플러그를 제거하여 배수입니다. 열은 calmodulin 세척 버퍼 400 μl과 하나가 엄격한 세척 한 다음 1X calmodulin 바인딩 버퍼 200 μl를 네 번 세탁하고 있습니다. </li><li> 바인딩 단백질은 1X calmodulin의 용출 버퍼를 사용하여 새로운 Eppendorf 튜브에 50 μl 네 개의 분수에 용출되어 있습니다. 용출 분획은 동일한 볼륨에 두 개의 깨끗한 Eppendorf 튜브에 배포됩니다. 튜브 모두 이후 속도 진공을 사용하여 건조합니다. </li><li> 다른이 사전에 질량 분광법을 사용하여, -80 ° C에 저장되는 동안 관에서 건조 eluate은 실버 착색 젤을 실행하는 데 사용됩니다. </li></ol> 4. 실버 얼룩 <ol><li> 실버 staini에 대한NG, 3 배 SDS (나트륨 dodecyl 황산) 샘플 버퍼의 절반 볼륨이 건조 eluate의 50 μl에 추가됩니다. 5 분의 혼합물을 끓고 후, 샘플은 SDS의 polyacrylamide 젤에로드됩니다. </li><li> 젤이 실행 완료 후, 조심스럽게 고정 솔루션에 배치 (50 % 메탄올와 10 % 아세트산)와 20 분의 회전 흔드는을 부드럽게 교반하고 있습니다. 젤 그 다음 10 분 20 % 에탄올에 헹구어 있습니다. </li><li> 고정 젤은 낮은 균일 한 배경을 보장하기 위해 10 분에 두 번 증류수 500 ML에 두 번 철저하게 세척합니다. </li><li> 젤 그런 다음 20 초에 증류수 두 세척 단계에 이어 1 분, 500 ML 나트륨-thiosulfate에 부드럽게 교반하고 있습니다. </li><li> 물은 폐기되고, 젤은 30 분에 0.1 % 실버 질산염 200 ML에 incubated 수 있습니다. 그 이후에는 실버 질산염이 제거되고 젤이 초과 실버 질산염을 제거하는 20 초에 증류수로 세척합니다. </li><li> 젤은 결국 75 ML에 흥분 손으로개발 솔루션의. 원하는 강도가 달성되면, 개발 솔루션은 삭제되며 아세트산의 80 ML는 반응을 중지에 추가됩니다. 겔 밴드의 적절한 시각화를위한 20 분의 최소 아세트산의 젤을 배양 할 수 있는지 확인합니다. </li></ol> 5. 질량 분석법에 대한 Proteolysis 및 샘플 준비 <ol><li> 말린 샘플에, 소화 버퍼 50 μl 100 MM TCEP-HCL (트리스 (2 - carboxyethyl) phosphine - 염산)의 0.9 μl를 추가하고 실온에서 45 분의 혼합물을 품다 감소 단계. 다음, 500 밀리미터 iodoacetamide 1 μl를 추가 및 샘플 알킬화 할 수 있도록하는 또 다른 40 분 어둠 속에서 incubated입니다. </li><li> 부화의 두 번째 라운드 후, 혼합물에 고정 트립신의 1 μg을 추가로 5 시간 또는 실온에서 하룻밤에 37 ° C에서 중 품다. 아세트산 1 μl를 추가하여 반응을 중지 확인합니다. </li><li> 사전 젖은 Millipo으러 및 평균 솔루션 10 μl를 aspirating하여 다시 우편 - 팁 피펫 팁. 낭비 할 수있는 솔루션을 투여. 이후에 세척 용액 10 μl를 기음과 낭비 할 수있는 솔루션을 투여. 이 단계를 두 번 반복합니다. </li><li> 끝으로 펩타이드 혼합물의 효율적인 바인딩, 피펫은 펩타이드 혼합물을 20 번 섞는다. 끝을 준수하는 펩타이드 혼합물은 aspirating 및 세척 용액을 조제하여 씻어 수 있습니다. 끝으로 펩타이드 혼합물의 효율적인 결합에 대해 두 번이 절차를 반복합니다. </li><li> 바인딩 펩타이드를 포함하는 팁과 함께 으러 및 평균 솔루션 10 μl를 대기음, 그리고 깨끗한 eppendorf 튜브에 조제. 이 단계를 두 번 반복합니다. 사용하기 ° C 사전을 속도 진공에서 용출 샘플을 건조 후, 샘플은 질량 분광법에 의해 즉시 분석 할 수 또는 -80에 저장됩니다. </li></ol> 6. LTQ Velos Orbitrap 질량 분광계에 의한 단백질 식별 일고립 된 단지의 전자 폴리펩티드 구성 요소 LTQ Velos의 Orbitrap 하이브리드 탠덤 질량 분석기를 사용하여 식별됩니다. Orbitrap은 뛰어난 해결 능력 (&gt; 60,000 전체 너비 하프 최대, 또는 FWHM) 및 제어 purifications에서 감지 관련이없는 비 특정 배경 오염 물질의 MS / MS 샘플링을 최소화 대량의 정확도를 (&lt;2 PPM)가 고속 Velos 이온 트랩 동안 구성 요소가 감지 할 수 있습니다 전자 전달 분리와 충돌 유발 분해 모드를 사용하여 조각 낮은 풍요의 펩티드. 결과 MS / MS 스펙트럼 사이에서 높은 신뢰 일치는 참조 E.에 매핑됩니다 대장균 단백질 시퀀스는 SEQUEST와 STATQUEST 11 같은 확률 알고리즘 동안 평가를 각각의 일치 시퀀스 같은 데이터베이스 검색 알고리즘을 사용합니다. 총 스펙트럼 번호, 펩타이드 시퀀스 고유 대조군 (예. 모의) purifications에서 감지 일반적인 배경 오염 물질은 낮은 경험적 허위 - 비밀입니다 달성하기 위해 간주됩니다covery 속도. 다음 단계는 단백질 식별을 위해 수행됩니다 : <ol><li> 마이크로 열은 3 μm 루나-C 18 수지의 ~ 10cm로 포장하고 Orbitrap 악기와 라인에 배치되어있는 Proxeon nanoelectrospray 이온 소스에 연결할 있습니다. </li><li> Proxeon 나노 흐름 바이너리 HPLC 펌프는 펩타이드 분리시 ~ 300 NL 분 -1의 안정 팁 유량을 제공하는 데 사용됩니다. </li><li> 펩타이드 용출을 달성하기 위해, 유기 버퍼 기울기는 샘플의 복잡성에 따라 설정됩니다. 예를 들어, 다음과 같은 그라디언트는 일반적으로 E.에 설정되어 대장균의 SPA 샘플 : 용매 B는 1 분에 100 % 개최 옆에 4 분에서 100 %로, 38 분에서 24 %로, 1 분에 2퍼센트 6 %에서 증가 한 다음, 1 분에서 2 %로 감소 15 분에서 2 %로 개최 최종. 모바일 상 용매 용매 B는 0.1 % 개미의 ACI와 5% HPLC 기울기 물과 95 % ACN가있을 때, 0.1 % 개미의 산성과 95% HPLC 기울기 물과 5 % ACN이D. 바늘의 끝의 유량은 60 분 300 NL 분 -1로 설정되어 있습니다. </li><li> 질량 분광계주기는 60,000 해상도에 하나의 전체 질량 검사를 통해 실행으로, 10 수반하는 협동 조각 질량 검사는 가장 강렬한 전구체 이온에 대한 수집하고 있습니다. 동적 제외, monoisotopic 대량 선택, 실시간으로 데이터에 의존 수집 악기 기능을 사용할 수 있습니다. </li><li> 스펙트럼은 E.의 데이터베이스에 대해 이러한 SEQUEST 같은 데이터베이스 검색 알고리즘을 사용하여 검색됩니다 대장균 단백질 시퀀스, 그리고 결과는 통계적으로 낮은 잘못된 검색 속도를 보장하기 위해 이러한 STAQUEST 11과 같은 확률 알고리즘을 사용하여 필터링하고 있습니다. 일치하는 이론적 펩티드 질량에 비해 10 개 이상의 PPM 질량 오류를 보여주는 더 고려에서 제거하는 동안 만 높은 신뢰 (99 % 확률) 후보자가 선택됩니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli.">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li><li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins.">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li><li>Mak, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentiviral+functional+proteomics+approach+identifies+chromatin+remodeling+complexes+important+for+the+induction+of+pluripotency.">A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency.</a> Mol. 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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 설명 된 SPA 기반 APMS 방식의 핵심 부분은 태그가함으로써 정상적인 유전자 조절을 보장하는 것은 유지 (예. 기본 미끼업자의 앞 표현 수준이 어리둥절하지 않습니다, 보존) 및 안정적-관련 기본입니다, 자연 염색체 컨텍스트 내에서 수행되는 것입니다 단백질 단지는 거의 내생 수준에서 회수하고 있습니다. 오페론 극성 문제도 선택 마커의 외측 중심의 발기인을 포함하여 피할 수 있...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td>Vendor</td>
			<td>and Catalog Numbers</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>I. Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#KAN201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#AMP201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>2. Terrific-Broth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Tryptone</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#TRP 402</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#YEX 555</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#GLY 002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#PPM 302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#PPM 303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>3. Bacterial Strain and Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DY330</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Yu et al. (2000)10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJL148</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Zeghouf et al. (2004)7</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4. PCR and Electrophoresis Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PCR buffer</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTPs</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mM MgCl2</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td># AGA002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>#B7021S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td># ETB444</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#28355</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#TRS001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#BOR001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># E6768</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>#N3232L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>5. Plasmid isolation and Clean-up Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Midi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#12143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#28104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>6. PCR and Transformation Equipments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>iCycler</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>GenePulser II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 cm electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>42 &deg;C water bath shaker</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Innova 3100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter TJ-25 centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TS-5.1-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 &deg;C Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 &deg;C large Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 &deg;C plate incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>7. Electrophoresis and Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#161-0125</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td># AMP001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># B7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#TEM001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>#09-806A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean 3 cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#165-3301</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot gel transfer device</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#IB1001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#162-0115</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F3165</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>#NA931V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-stained protein molecular weight standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#161-0363</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence reagent</td>
			<td>PIERCE</td>
			<td>#1856136</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>Clonex Corp</td>
			<td>#CLEC810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Draw blotting paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7796</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2 platform rocking shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>8. Sonication Equipment and Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonic</td>
			<td>#23395</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#SOD001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#800-363-5887</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mM TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#20490</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>9. Affinity Purification Reagents and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#732-6008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>#70746</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG M2 agarose beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#A2220</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin-sepharose beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#17-0529-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV protease</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#12575-015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T9284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C2661</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E3889</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabQuake Shaker</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>#59558</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>10. Silver Staining Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#MET302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>t#ACE222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-thiosulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S-7143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>#S181-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#FOR201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#SOC512</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>11. Reagents and Equipment for Protein Identification </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td># V5280</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM NH4HCO3</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#AMC555</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM CaCl2</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#CCL302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#A998-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F0507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#95304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#16125</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Zip-Tip</td>
			<td>Millipore</td>
			<td># ZTC18M960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>~10 cm of 3 &mu;m Luna-C18 resin</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proxeon nano HPLC pump</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>12. Labware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 liter conical flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#89000-372</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene falcon tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml conical flaks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#29140-045</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml sterile culture tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#366052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#479-3221</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &deg;C freezer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#13-990-14</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed vacuum system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>
			Buffers and Solutions
			1. 1 liter Terrific Broth (TB) media
			11 g Bio-Tryptone 
			22 g Yeast Extract 
			2% Glycerol 
			50 ml potassium salt stock solution
			2. Potassium Salt Stock Solution
			1.5 M K2HPO4 
			0.35 M KH2PO4
			3. Sonication Buffer
			20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			0.2 mM EDTA 
			10% Glycerol 
			Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP
			4. AFC buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			0.1% detergent 
			Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP
			5. TEV cleavage buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			0.2 mM EDTA 
			0.1% detergent 
			Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP
			6. Calmodulin binding buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			2 mM CaCl2 
			0.1% detergent 
			Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP
			7. Calmodulin wash buffer
			30 mM Tris-HCl pH 7.9 
			150 mM NaCl 
			2 mM CaCl2 
			0.1-0.5 mM TCEP
			8. Calmodulin elution buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			100 mM NaCl 
			10 mM EGTA 
			0.1-0.5 mM TCEP
			9. Developing solution (1L)
			37% Formaldehyde 
			30 g sodium carbonate 
			1000 ml distilled water
			10. Digestion buffer
			50 mM NH4HCO3 
			1 mM CaCl2
			11. Wetting and Equilibration solution
			70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid
			12. Washing solution
			100% H2O in 0.1% formic acid</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of protein complexes in escherichia coli using sequential peptide affinity purification in combination with tandem mass spectrometry

대부분의 세포 프로세스 macromolecular 어셈블리, 단백질 - 단백질 상호 작용의 체계적인 식별 (PPI)와 단지는 유전자 기능에 대한 통찰력을 제공하고 생물 시스템 1, 2의 이해를 향상시킬 수 있습니다 다중 단백질의 subunit 구성의 식별에 의해 중재되기 때문입니다. 물리적 상호 작용 대량 분석법 (APMS)와 함께 chromosomally 태그 단백질의 친 화성 정화에 따라 거의 생리적 조건 하에서 내생 단백질 단지의 높은 신뢰 vialarge 규모의 절연 및 특성에 매핑 할 수 있습니다. 이러한 접근 방식이 성공적으로 효모, 파리, 웜, 포유류의 세포 및 박테리아 1-6 등의 evolutionarily 다양한 생물에 적용되었습니다. 특히, 우리는 GE를 사용하여 양식 그람 음성 대장균에서 선호도 - 정화 기본 단백질 단지의 카르복시 - 터미널 순차적 펩타이드 선호도 (SPA) 듀얼 태그 시스템을 생성 한기본 생물학, prokaryotes 1, 2, 7 보존 프로세스의 게놈 전체의 조사에 적합 아르 netically - 다루기 쉬운 호스트 실험실 변종. 우리 SPA 태그 시스템은 효모 8, 9 원래 개발 된 직렬 선호도 정화 방법 유사하며, calmodulin 바인딩 구체적인 담배 에칭 바이러스 (TEV) 단백 분해 효소의 절단 사이트에서 다음 펩타이드 (CBP) 및 사본 3 부를 구성되어 있습니다 연관성 농축의 연속 2 발을 허용 플래그 에피토프 (3 배 플래그)의. 카세트 증폭 후, SPA-태그와 선택 마커를 인코딩 순서 특정 선형 PCR 제품은 통합되어 transiently 고효율 heterologous 박테리오파지 람다 재결합 시스템 (10)을 표현하도록 유도하는 DY330 배경으로 카르복시 - 터미널 fusions와 같은 프레임으로 표현. calmodulin 및 안티 플래그 연관성 구슬을 사용하여 후속 듀얼 단계 정화는 높은 선택을 가능하게대규모 문화도 낮은 풍부한 단백질 단지의 효율적인 복구. 직렬 질량 분석법 그 다음 높은 감도 (낮은 nanogram 검출 한계)를 안정적으로 공동 정화 단백질을 식별하는 데 사용됩니다. 여기, 우리는 우리가 일반적으로 체계적인 단백질 태그, 정화 및 대량 E.에서 수용성 단백질 단지의 분석법 기반의 분석을 위해 사용하는 자세한 단계별 절차를 설명 까지 확장 될 가능성이 recombineering 의무가있는 특정 기회 병원균 등 다른 세균 종에 맞게 할 수 있습니다 대장균. 그 결과 물리적 상호 작용은 종종 재미있는 예상치 못한 구성 요소와 소설 기계론의 링크를 제안 연결을 공개 할 수 있습니다. 이러한 유전자 (유전자 유전자) 상호 작용과 예측은 이중에서 다중 단백질 단지의 글로벌 분자 조직의 해설을 촉진 할 수 게놈 - 컨텍스트 (GC)와 같은 다른 분자 협회 데이터와 PPI 데이터의 통합ological 경로. E.에 대해 생성 된 네트워크 대장균은 기능 주석이 현재 부족하는 다른 미생물의 orthologous 유전자 제품의 기능 구조에 대한 통찰력을 얻을하는 데 사용할 수 있습니다.

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.co

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를 설명<em&gt; 대장균</em&gt;도 셀 당 낮은 사본 번호부터 근처의 동질성에 안정적인 멀티 단백질 복합체를 분리하고 특성화하는 데 사용할 수있는.

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

identification-protein-complexes-escherichia-coli-using-sequential

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

48.2K 조회수.  University of Toronto. 질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를 설명 대장균도 셀 당 낮은 사본 번호부터 근처의 동질성에 안정적인 멀티 단백질 복합체?...

비디오: Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

연구

생물학

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

구조 질량 분광법에 의해 큰 단백질 단지 분석

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜<sup&gt; 15</sup&gt; N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

단백질 - 단백질 상호 작용을 확인<em&gt; 초파리</em탠덤 선호도 정화로&gt; 성인 머리 (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

에서 펩타이드 및 단백질과 재조합 엘라스틴 같은 폴리 펩타이드 및 그 융해의 비 크로마토 그래피 정제<em&gt; 대장균</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

단백질 공동 식의 다각적 인 장점에<em&gt; 대장균</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...