Name: a simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue
Uploaded: 2018-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
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이 작품은 국가 주요 연구 및 개발 프로그램의 중국 (2017YFA0104604), 국가 자연 과학 재단의 중국 (NSFC, 81772093)의 일반 프로그램에 의해 지원 되었다 과학 및 기술 개발 프로그램의 소 주 (ZXL2015128) 자연 과학 재단의 장쑤 성 (BK20161241), 고 산동 태 산 학술 상 (tshw201502065).

이 프로토콜에서 사용 하는 인간의 조직 기관의 인간 연구 윤리 위원회의 지침에 따라 처리 된 (NO.2015120401, 날짜: 2015 년 5 월 12 일).
1입니다. 준비
<ol><li>얼음 처럼 차가운 Dulbecco의 10 mL 50 mL 튜브에 병원에서 성형 수술에서 삭제 수집 신선한 성인 복 부 피부 조직이 글 중간 (DMEM)으로. 표본은 세포 생존 능력에 크게 영향을 주지 않고 최대 72 h 4 ° C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>아래에 설명 된 시 약 및 문화 매체를 준비 합니다.<ol>
<li>인산 염 버퍼 솔루션 (PBS) 세척 솔루션 준비의 50 mL에 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 mg/L) 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>두 효소 소화 솔루션의 준비: (1) dispase (2.5 mg/mL에서 DMEM) 50 mL를 준비 하 고 50 mL의 유형 I 콜라 (2.5 mg/mL에서 DMEM) 별도로 기존의 방법; (2) 50 mL dispase의 혼합물을 준비 하 고 나에 게 콜라를 입력 (디졸브 125 mg dispase 가루와 125 밀리 그램의 유형 I 콜라 분말 DMEM의 50 ml에서) 새로운 방법에 대 한. 참고: 모든 효소 솔루션 해야 0.22 μ m 스 트레이너와 필터링 하 고 유지 at4 ° c.</li>
		<li>소화 솔루션을 준비 하는 두 가지 방법에 대 한: 0.05 %trypsin 및 0.25 %trypsin 상업적으로 구입 했다. 10 mg/mL DNase 준비 나 DNase PBS의 5 mL에 분말의 50 밀리 그램을 용 해 하 여 솔루션 0.22 μ m 스 트레이너와 필터링 하 고-20 ° c.에 그것을 저장</li>
		<li>효소 소화를 무력화 하는 매체의 500 mL를 준비: DMEM 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보완.</li>
		<li>500 mL 접종 매체 (성장 요소가 포함 된 매체, G-매체 라는)의 준비: DMEM/F12 (3:1) 매체 1% 페니실린/스, 40 µ g/mL fungizone, 40 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 2 (FGF2) 20 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF)를 포함 하 고 2 %B27 보충입니다.</li>
		<li>100 m m 세포 배양을 pretreat 나 실 온에서 30 분 동안 콜라겐의 형식을 포함 하는 코팅 매트릭스 2 mL와 함께 요리.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 종래의 방법
<ol><li>
피부 조직 전처리
	<ol>
<li>피부 조직의 1.5 c m2 를가 고 그것을 씻어 10 mL의 PBS; 1 x 다음, 30 대 70% 에탄올 10 mL로 씻어 s 그것을 품 어 및 세척 솔루션 (PBS 2% 페니실린과 스 포함), 5 분의 10 mL와 함께 2 배. 참고: 모든 세척 100 mm 셀 문화 요리 층 흐름 후드 내부에서 수행 됩니다.</li>
		<li>조직 100 mm 셀 문화 접시에 있는 피하 지방 층을 제거 하 고, 다음, 피부 조직 (무게는이 프로토콜에 1 g)를 무게를 멸 균가 위로 잘라. 참고: 충분 한 트리밍은 진 피에서 표 피의 효율적인 분리에 대 한 매우 중요 합니다. 노란 지방 층 구분할 수 있습니다 쉽게 시각적으로.</li>
		<li>아래 진 피 쪽으로 또 다른 100 m m 메 마른 요리 조직을 전송 하 고, 다음, 피부 조직을 메스 블레이드를 사용 하 여 3-4 m m-와이드 스트립으로 잘라. 참고: 지방 층과 진 피 쪽 쉽게 시각적으로 인식 된다.</li>
		<li>100 m m 문화 접시에 피부 조직에 2.5 mg/mL dispase 솔루션의 10 mL를 추가 하 고, 다음, 4 ° C (더 이상 20 h)에서 하룻밤 접시를 품 어. 참고: dispase 솔루션의 금액의 조직의 각 그램의 소화에 대 한 dispase 솔루션의 10 mL를 사용 하 여 계산할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
피부 조직에서 표 피의 분리
	<ol>
<li>둘째 날에는 정밀한 족집게를 사용 하 여 진 피에서 표 피를 벗기십시오. 참고: 표 피를 벗기다 어려운 경우 dispase 소화 충분 하지 않았다, 일반적으로 조직의 부족 한 잘라내기 때문입니다. 이 경우에 조직 이상 보육 시간이 필요합니다.</li>
		<li>메스;를 사용 하 여 조직 슬러리에 세포 배양 매체의 500 µ L로 벗 겨 표 피를 말하다 그런 다음, 50 mL 튜브에 0.25 %trypsin 10 mL와 함께 그것을 resuspend 하 고 그것에 알 떨고와 37 ° C에서 물 욕조에 20 분을 품고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수집 및 기본 세포의 배양
	<ol>
<li>중화 솔루션 (10 mL이 프로토콜에서)의 동일한 볼륨을 추가 하 여 트립 신 활동을 무력화.</li>
		<li>10 mL 혈 청 학적인 피 펫으로 20 x 위아래로 솔루션 pipetting으로 표 피 세포를 해리 하 고 어떤 잔여 조직 파편을 제거 하는 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 셀 솔루션을 전달 합니다.</li>
		<li>여과; 후 5 분 동안 200 x g 에서 셀 솔루션을 원심 세척에 대 한 중립화 매체에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고, 다음, 셀 펠 렛을 얻기 위해 200 x g 에 다시 원심.</li>
		<li>낮은 칼슘, 혈 청 무료 keratinocyte 매체 (SFM) 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 총 셀 수를 계산 하 고, 약 2 x 106 셀 100 mm 셀 문화 요리 코팅 매트릭스와 청소용된으로 SFM의 10 mL 다음, 접시에이 솔루션의 10 µ L를가지고 (포함 하는 유형 I 교원 질). 참고: 코팅은 종래의 방법에 대 한 필요한 단계 이다.</li>
		<li>문화 매체 마다 2 d를 변경 합니다. 참고: 전과 문화 매체를 변경한 후 현미경으로 세포 접착을 확인 하십시오.</li>
		<li>그들은 약 80%에 도달할 때 셀 통로 합류. 참고: 모든 문화 요리는 청소용 코팅 매트릭스와 함께.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 새로운 방법
<ol><li>
피부 조직 전처리
	<ol>
<li>조직 설명 대로 위의 (2.1 단계) 종래의 방법에 대 한 수집 합니다.</li>
		<li>씻어 피부 조직 1 x 10 mL PBS의 그리고, 다음, (무게는이 프로토콜에 약 1 g) 전자 규모에 의해 살 균 플라스틱 용기에 무게. 참고: 조직의이 프로토콜에 필요한 최소 무게는 0.1 g, 때문에 사용 하는 조직 표본은 너무 작은 경우 셀의 충분 한 수를 얻기 어렵다. 궁극적으로 연산자의 처리 용량에 따라 달라 집니다이 프로토콜에 대 한 조직의 최대 무게가 있다.</li>
		<li>겸 자 30 대 70% 에탄올 10 mL와 피부 조직 린스를 사용 하 여 s.</li>
		<li>조직 2 품 어 세척 솔루션 (2.1.1 단계에서 준비), 5 분 동안 각 시간 10 mL x. 참고: 위에서 언급 된 모든 세척 단계 100 mm 셀 문화 요리 층 류 두건 (조직 문화 후드) 내부에서 수행 됩니다.</li>
		<li>다른 100 mm 셀 문화 살 균 접시 전송 조직.</li>
		<li>메스를 사용 하 여 말하다 조직을 철저 하 게 조직 슬러리에.</li>
		<li>젖은 조직 유지를 200 µ L의 PBS 마다 5 분을 추가 합니다. 참고: 단계 3.1.5-3.1.7 약 15 분 소요. 위의 단계를 모두 상 온에서 수행 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
피부 조직의 소화
	<ol>
<li>무 균된 조직 솔루션 50 mL 튜브로 전송 합니다. 피부 조직의 모든 1g에 대 한 효소 혼합물의 10 mL를 추가 합니다. 무 균 조직 효소를 철저 하 게 혼합.</li>
		<li>1 시간 동안 37 ° C에 물 목욕에 떨고와 혼합물을 품 어.</li>
		<li>37 ° c.에 물 목욕에서 또 다른 30 분 소화 혼합물에 0.25 %trypsin (2.5 mL이 프로토콜에서)의 1/5 볼륨 추가</li>
		<li>DNase를 추가 나 1: 100 (v/v) 비율로 (이 프로토콜에 250 µ L) 효소 혼합물에 솔루션 및 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수집 및 기본 세포의 배양
	<ol>
<li>1:1 비율로 중립화 매체의 12.5 mL을 추가 하 여 소화 프로세스를 중지 합니다. 약 20 배, 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 세포 분열을 위한 솔루션을 위쪽 및 아래쪽 플라스틱.</li>
		<li>조직 파편을 제거 하는 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 해리 셀을 필터링 합니다. 200 x g 5 분 관찰 튜브의 하단에 펠 릿에서 상쾌한 원심</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 200 x g 세포를 수집 5 분에 다시 중화 매체, 그리고 원심 분리기의 10 mL와 함께 셀 펠 릿을 세척.</li>
		<li>Y-27632의 10 µ M와 접종 매체 (G-중간 단계의 1.2.5) 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>총 셀 수를 계산 하 고, 다음, 대략 2 x 106 셀 100 mm 셀 문화 접시에 G 매체의 10 mL 접시 솔루션의 10 µ L를 가져가 라. 참고: precoating 단계는 새로운 방법에 대 한 필요 하 고 피부 층의 아무 제거도 필수.</li>
		<li>3 d, 후 접종 매체를 낮은 칼슘 SFM 매체 바꿉니다. 문화 매체 마다 2 d를 변경 합니다. 참고: 매체 변경 전후 세포 접착을 확인 하십시오.</li>
		<li>그들은 약 80%에 도달할 때 셀 통로 합류. 참고: 필요한 경우 0.05% trypsin 2 분에 대 한 셀을 pretreat 고 표 피 세포를 trypsinizing 전에 피부 세포를 오염 제거에 PBS 가진 세포를 씻어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 셀 뿌리고
<ol><li>제거 매체, PBS, 셀을 세척 하 고, 다음, (각 100 m m 접시) 당 0.05 %trypsin 2 개 mL를 추가.</li>
	<li>5 분 동안 인큐베이터 (5% CO2와 37 ° C)에서 세포를 품 어.</li>
	<li>모든 세포는 문화 접시에서 분리 된 ㄴ 다는 것을 확인 하는 현미경을 사용 하 여 셀을 확인 합니다.</li>
	<li>추가 10 %DMEM 8 mL FBS 효소 반응 중화 하 고, 다음, 15 mL 튜브에 세포를 수집을.</li>
	<li>셀 펠 렛을 얻기 위해 5 분 동안 200 x g 에서 원심.</li>
	<li>상쾌한을 천천히 제거, SFM 매체의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend 그리고 셀의 수를 계산 합니다.</li>
	<li>각 100 mm 셀 접시에 SFM의 10 mL로 플레이트 1 x 106 셀.</li>
	<li>매체 마다 2 d를 변경 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

상처를 치료 클리닉에서 3 년 이상에 대 한 교양된 기본 HKCs 널리 이용 되었습니다 그리고, 그때 이후로, 그것은 항상 중요 했다 효율적으로 적시에 임상 응용 프로그램에 대 한 셀의 충분 한 번호를 얻을. 따라서, 실제로 기존의 절연 메서드와, 진 피에서 표 피 분리, 어렵게 셀과 낮은 수 성인 셀 통로의 낮은 수율으로 인해 이러한 요구 사항을 충족 합니다. 여기, 우리는 우리가 효율적으로 연구소 ...

목표 임상 응용 성인 조직에서 기본 인간의 keratinocytes (HKCs)을 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발 했다. 피부의 기저 층에 피부 표 피 줄기 세포 증식 및 분화 keratinocytes 피부1,2,3, 의 기능을 유지 하기 위해 제공 하는 높은 잠재력을가지고 4. HKCs 피부 조직 목적을 위해 피부 조직 공학 및 재생, 특히 손상 된 피부의 복구와 임상 응용 프로그램5,6에 대 한 유전자 치료에 널리 이용 된다에서 격리. HKC-기반 응용 프로그램에 대 한 중요 한 문제는 파악 하 고 확장 하는 높은 잠재적인 생체 외에서7,8HKCs의 큰 숫자입니다. 다양 한 연구 그룹 줄기 같은 HKCs의 문화를 생산 하는 방법을 개발 했습니다, 하지만 이러한 방법을 수행 하 고 낮은 셀 수율 등 피부 견본 형식에 의해 제한 되 고 다른 제한이 복잡 하 고 시간이 많이 소요 되기도 9를 사용합니다. 예를 들어, 피부 조직에서 HKCs을 전통적인 방법은 진 피6에서 표 피의 분리 2 단계 효소 소화를 포함 한다. 그 방법은 일반적으로 신생아 조직을 위해 잘 작동 하지만 성인 조직에서 세포를 분리 하는 데 사용 하는 경우 그것은 매우 어려워집니다.
Y-27632, 억제제로 관련 단백질 키 니 아 제 (바위)의 표 피 줄기 세포 격리와 식민지 성장10,,1112의 효율성을 크게 향상을 보고 되었습니다. 이전 연구에서 우리는 Y-27632 상피 세포의 클론 성장을 촉진 하지만 차동 접착 분자13의 식을 조절 하 여 피부 세포의 수확량 감소를 발견 했다. 우리는 또한 성장과 기본 표 피 세포의 수익률을 지 원하는 G-매체 라는 새로운 조건된 접종 매체 설립. G-매체 Y-27632와 결합 하 여이 새로운 메서드는 표 피-진 피 분리13,14단계 제거 효소 소화 후 저절로 피 및 피부 세포를 분리할 수 있습니다. 이전 보고서를 바탕으로, 우리는 지금 성인 피부 조직에서 HKCs을이 새로운 방법의 상세한 절차를 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Countess automated cell counter</td><td>Invitrogen Inc.&amp;nbsp;</td><td>C10227</td><td>Automatic cell counting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026333</td><td>For cell incubating</td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004380</td><td>Cell centrifuge</td></tr><tr><td>Constant Temperature Shaker</td><td>Shanghai Boxun</td><td>150036</td><td>For water bath</td></tr><tr><td>Electronic Scale</td><td>Harbin Zhonghui</td><td>1171193</td><td>For tissue weighing</td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Eppendorf</td><td>30702115</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>50ml Centrifuge Tube</td><td>KIRGEN</td><td>171003</td><td>For cell centrifuge</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Corning incorporated</td><td>431792</td><td>Cell filtration</td></tr><tr><td>Phosphate buffered solution</td><td>Solarbio Life Science&amp;nbsp;</td><td>P1020-500</td><td>Washing solution</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>C11995500</td><td>Component of neutralization medium</td></tr><tr><td>Defined K-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>10785-012</td><td>Epidermal cells culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1AC5</td><td>Component of neutralization medium</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td>For HKC dissociation</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin&amp;nbsp;</td><td>Beijing Solarbio Science &amp;amp; Technology</td><td>T1350-100</td><td>For HKC dissociation</td></tr><tr><td>Coating Matrix Kit</td><td>Life Technologies</td><td>R-011-K</td><td>For coating matrix</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>For HKC isolation</td></tr><tr><td>Collagenase Type I</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td>For HKC isolation</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma</td><td>9003-98-9</td><td>For HKC isolation</td></tr><tr><td>F12 Nutrient Mix, Hams</td><td>Life Technologies</td><td>31765035</td><td>Component of G-medium</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Growth factor in G-medium</td></tr><tr><td>FGF-2 Millipore</td><td>Merck Biosciences</td><td>341595</td><td>Growth factor in G-medium</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>ROCK inhibitor</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td>Preparation for G-medium</td></tr><tr><td>EGF Recombinant Human Protein</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td>Growth factor in G-medium</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>Thermo Scientific</td><td>NC9864731</td><td>cell proliferation and cytotoxicity assays</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human Cytokeratin5</td><td>Hewlett-Packard Development Company</td><td>MA-20142</td><td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Human Loricrin</td><td>Covance</td><td>PRB-145p</td><td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs</td></tr><tr><td>Mouse anti-human Vimentin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3390</td><td>For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts</td></tr><tr><td>Integrin &amp;alpha;6(GOH3)</td><td>Santa Cruz&amp;nbsp;</td><td>SC-19622</td><td>flow cytometry analysis of HKCs</td></tr><tr><td>Rat IgG2a FITC</td><td>Santa Cruz&amp;nbsp;</td><td>SC-2831</td><td>negative control antibody of &amp;alpha;6-integrin&amp;nbsp; in flow cytometry analysis&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue

기본 인간 keratinocytes 신선한 피부 조직 및 그들의 확장에서 에 체 외에서 고립 된 실험실 연구와 임상 응용 프로그램에 대 한 널리 사용 되었습니다. 인간의 keratinocytes의 기존의 격리 방법은 포함 한다 낮은 세포 회복 율 및 감소 셀 성인 조직에서 1 차 셀을 생성 효율적으로 입증 된 2 단계 순차 효소 소화 절차를 생존 능력입니다. 우리는 최근 매체에 노 키 니 아 제 억제 물 Y-27632를 활용 하 여 피부 조직에서 인간의 기본 상피 조상 세포 분리 고급 방법 보고. 전통적인 프로토콜에 비해,이 새로운 방법 간단 하 게, 쉽게, 그리고 보다 적게 시간이 걸리는, 그리고 상피 줄기 세포 수확량 증가 이며 그들의 줄기 세포 특성을 향상 시킵니다. 또한, 새로운 방법론, 진 피에서 표 피의 분리는 필요 하지 않습니다 이며, 따라서 여러 유형의 성인 조직에서 세포를 분리 하는 데 적합 한. 이 새로운 격리 방법 기존 방법의 주요 단점을 극복 하 고 높은 힘 실험실 및 임상 응용 프로그램에 대 한 많은 수 표 피 세포의 생산에 대 한 더 적합 합니다. 여기, 우리가 새로운 방법을 자세히 설명합니다.

새 메서드 (그림 1A)와 기존의 방법 (그림 1B)의 도식 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 기존의 방법은 2 일 절차는 2 단계 소화 합니다. 대조적으로, 새로운 방법은 작업에 약 3 시간 소요 단계 소화 합니다. 중요 한 것은, 한 단계 새로운 방법 접종 매체에 Y-27632의 존재에 달려 있는 동시에 두 개의 인구 (표...

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A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

여기 선물이 주 인간의 keratinocytes 성인 피부 조직에서 효율적으로 격리 하는 프로토콜. 이 메서드는 접종 매체에 자연스럽 게 피부 세포에서 상피 세포를 분리 하 록 억제 물 Y-27632를 사용 하 여 기존의 절차를 단순화 합니다.

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

a-simplified-efficient-method-to-isolate-primary-human-keratinocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K 조회수.  Shandong University. 여기 선물이 주 인간의 keratinocytes 성인 피부 조직에서 효율적으로 격리 하는 프로토콜. 이 메서드는 접종 매체에 자연스럽 게 피부 세포에서 상피 세포를 분리 하 록 억제 물 Y-27632를 사용 하 여 기존의 절차를 단순화 합니다.

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Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

연구

발생학

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

각질 줄기 세포 가소성을 모델링하기 위해 높은 처리량 표피 스페로이드 배양 시스템 구축

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

생물학

Generating Primary Cultures for Keratinocyte Live Cell Imaging

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in vitro.&#160;Live-cell imaging has allowed for significant advances in the ability to identify differences between keratinocyte stem cells and committed progenitor behavior. Live-cell imaging is an evolving and somewhat challenging method to study keratinocyte behavior in vitro. This protocol has been developed to culture keratinocytes at low seeding density, enabling relatively long-term time-lapse photography and monitoring of individual cell behavior. Passage 0 keratinocytes are grown at clonal density, and time-lapse photography allows documentation of individual cell divisions and the time of their occurrence. For maximum biological relevance, freshly isolated human keratinocytes are placed in vitro. This approach focuses on proliferation. However, this protocol can be adapted for use in other live cell imaging applications measuring individual cell behavior, such as measuring cell migration, wound healing, and motility.

This protocol outlines the culture of freshly obtained (passage 0) keratinocytes for use in live cell imaging.

Keratinocyte Live Cell Imaging을 위한 1차 배양 생성

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in ...

생체공학

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

인간 포피로부터의 일차 슈완 세포, 각질세포 및 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

신경과학

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

마우스 표피 각질 세포와 체외 클로노겐 문화의 격리

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

성인 마우스 입천장에서 1 차 구강 각막 세포의 격리 및 문화

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Human Skin Keratinocyte Isolation: A Method to Culture Primary Keratinocytes from Skin Samples

Johansen, C. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56863"> Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin</a>. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of keratinocytes&#8212;the most prominent cells of human skin&#39;s epidermal layer, by employing a combination of enzymatic digestion and mechanical disruption methods. This method helps in the preferential growth of keratinocytes over other skin cell types using a selective growth medium.

인간 피부 각질 세포 분리: 피부 샘플에서 1차 각질 세포를 배양하는 방법

Johansen, C. et al.  Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of ...