저자 베 키 마르케스, Sentara Bariatric 센터 환자 검사 및 동의의 과정으로 그녀의 지원에 대 한 임상 코디네이터를 인정 하 고 싶습니다. 이 연구는 머 디 Dobrian에 R15HL114062에 의해 지원 되었다.

동부 버지니아에서 제도적 검토 보드 위원회 연구 및 연구에 사용 하는 인간 지방 조직 샘플의 수집을 승인 했다. 정보 서 면된 동의 환자에서 수집 되었다.
1. 버퍼, 미디어, 악기의 준비
<ol><li>Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered 솔루션 (KRBBS) 준비: 135 m m 염화 나트륨, 5 m m 염화 칼륨, 황산 마그네슘 1 m m, 0.4 m m 칼륨 인산 염 염기, 5.5 m m 포도 당, 1mm 아데노신, 0.01% 항생제/antimycotic 혼합 (50 µ g/mL의 페니실린, 스, gentamicin의 30 µ g/mL, 암포의 15 ng/mL의 50 µ g/mL)와 10 mM HEPES (pH = 7.4). 이 솔루션은 조직 수집 및 소화에 대 한 때마다 신선한 준비가 되어 있습니다.</li>
	<li>신선한 콜라 솔루션 준비: 1 mg/mL의 콜라, 입력 1, KRBSS; 3 mL/g의 지방 확인 합니다. 미리 따뜻한 조직 소화 전에 물 목욕에서 37 ° C에서 콜라 솔루션.</li>
	<li>CD34 셀 절연 버퍼 준비: 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 1 mM EDTA.</li>
	<li>지질 미디어 준비: DMEM/F12, 5 %FBS, 페니실린/스, 1.25 µ L/mL (5 µ g/mL 또는 144 mU/mL), 인간 인슐린의 2.8 m m rosiglitazone (1 µ M)의 0.36 µ L/mL의 50 µ g/mL.</li>
	<li>소 프로 파 놀의 100 mL으로 오로 0.3 g을 용 해 하 여 0.3% 기름 빨간 O (오로) 재고 솔루션 (무게/볼륨)를 준비 합니다.</li>
</ol>2. 지방 Stromal 혈관 분수 절연
참고: 연구 morbidly 비만 타입-2 당뇨병 (T2D)와 비 당뇨병 주제, 18-65 세는 Sentara 신진 대사 및 체중 손실 수술 센터 (Sentara 의료 그룹, 노퍽, 버지니아)에 bariatric 수술의 횡단면 일대를 포함. 배제 기준 포함 타입-1 당뇨병 mellitus, 만성 면역 치료, 항 염증 제 약물, thiazolinendiones, 활성 담배 사용, 만성 또는 급성 감염, 또는 역사를 요구 하는 조건을 포함 한 자가 면역 질환 악성의 지난 12 개월 내 처리. T2D는 단식 플라스마 포도 당 126 mg/dL 이상, 200 mg/dl 이상 2 시간 포도 당 내성 검사, 후 포도 당 또는 antidiabetic 약물의 사용으로 정의 되었다.
<ol><li>Bariatric 수술 인체에서 인간의 omental (OM) 및 피하 (SC) 지방이 많은 직물 (AT)를 수집 합니다.</li>
	<li>옴 및 사우스 캐롤라이나에 행 크의 버퍼링 소금 솔루션 페니실린/스 실 온에서의 50 µ g/mL를 포함 하는 조직 추출 후 즉시 별도 튜브 하십시오.</li>
	<li>신중 하 게 청소 하 고 샘플 조직 추출 후 실험실에 도착 하는 때 70% 에탄올 swabbed가 위, 핀셋을 사용 하 여 조직의 거리와 멎 섹션을 제거 합니다.</li>
	<li>It 5 g (또는 적은) aliquots 콜라 소화에 대 한 파티션 및 지방 조직 무게.</li>
	<li>정밀 하 게가 위의 두 쌍을 사용 하 여 실내 온도에, 섬광 유리병 콜라 솔루션의 5 mL에 AT의 5 g을 말하다.</li>
	<li>15 ml 총 다진된 조직에 콜라 솔루션의 추가 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>연속 떨고와 물 욕조에 37 ° C에서 1 시간에 대 한 샘플을 소화.</li>
	<li>무뚝뚝한 끝을 20 mL 주사기에서 끝을 잘라.</li>
	<li>250 µ m 메쉬에서 9 cm x 9 cm 사각 고 무뚝뚝한 끝 주사기를 사용 하 여 50 mL 원뿔 튜브에 밀어 중간.</li>
	<li>20 mL 무뚝뚝한 끝 주사기와 소화 되지 않은 조직에서 adipocytes, 혈관 stromal 세포를 분리 하 50 mL 원뿔 튜브에 250 µ m 나일론 메쉬 통해 필터에 샘플을 부 어. 참고: 메쉬 초과 거리 소화 되지 않은 자료로 인해 막힌 얻을 것 이다으로 50 mL 원뿔 튜브, 당의 이상의 5 g를 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>그리고 KRBBS의 10 mL와 함께 섬광 유리병 세척 후 잔류 세포를 수집 하는 필터를 통해 그것을 부 어.</li>
	<li>실 온에서 5 분에 대 한 필터링 된 샘플을 품 어. 참고:이 단계는 adipocytes 플 로트 튜브의 하단에 정착 하는 튜브의 상단 및 stromal 혈관 세포의 일부에 대 한 허용 해야 합니다.</li>
	<li>20 mL 주사기 및 20 G x 6 pipetting 바늘 stromal 혈관 일부 레이어를 제거 하 고 깨끗 한 50 mL 원뿔 튜브에 전송에 이용 한다.</li>
	<li>KRBBS의 10 mL을 추가 하 고 샘플을 실 온에서 5 분 동안 벤치에 앉아 허용.</li>
	<li>2.12-2.14 단계를 두 번 반복 합니다. 참고:이 단계는 부동 adipocytes와 stromal 혈관 세포의 오염 없이 지킬 것 이다.</li>
	<li>다음 단계에 설명 된 대로 추가 처리를 위해 얼음에 두 플랫폼에서 stromal 혈관 분수를 유지. 참고: 두지 마십시오 셀 1 시간 이상에 대 한 얼음이 세포 생존 능력에 영향을 있을 수 있습니다. adipocytes 플래시-장기 저장을 위한 액체 질소에서 냉동 또는 신선한 실험을 위해 사용.</li>
</ol>3입니다. 지방 조직 내 피 세포의 고립
<ol><li>4 ° c.에 5 분 동안 500 x g 에서 stromal 혈관 분수 (SVF) 회전</li>
	<li>원심 분리기에서 샘플을 제거 하 고 상쾌한;에서 신중 하 게 부 어 SVF 셀을 포함 하는 펠 릿을 유지.</li>
	<li>부드럽게 PBS의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 참고: AT 센터의 5 g 이상의 여러 aliquots (단계 2.4 참조)으로 처리 된 경우 수영장 셀 펠 릿 함께.</li>
	<li>4 ° c.에 5 분 동안 500 x g 에서 샘플을 회전</li>
	<li>제거는 상쾌한, resuspend, PBS의 1 mL에 셀과 셀. 참고: 여기는 자동 셀 카운터 셀 계산을 위해 사용 되었다. 세포 생존 능력 acridine 오렌지/propidium 요오드 화물 (AO/PI) 솔루션의 12 µ L로 세포 현 탁 액의 12 µ L를 혼합 하 여 얻은 ( 재료의 표참조). 각 창 고에 대 한 AT의 그램 당 세포의 평균 수는: (a) 옴 창 고: 1.69 x 105 ± 4.51 x 104; (b) SC 서비스 센터: 105 ± 6.45 x 104x 1.24. 두 플랫폼에서 세포의 생존 능력은 > 90%.</li>
	<li>작은 샘플 500 x g 4 ° c.에 5 분에서 참고: CD34 immunomagnetic 선택 프로토콜 단계 3.7-3.15 적응 했다 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>CD34 절연 버퍼의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend. 참고: 총 셀 카운트 해야 다음 다시 서 스 펜 션 볼륨: (a) < 2 x 107 셀: 100 µ L;에서 펠 릿 resuspend (b) 2 108–5 x 108 셀 배: 1 mL에 펠 릿을 resuspend. 단계 3.9-3.16, 사용 시 약의 볼륨은 축소에 대 한 < 2 x 107 셀.</li>
	<li>CD34 칵테일의 10 µ L을 추가 하 고 실 온에서 15 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>마그네틱 구슬의 5 µ L을 추가 하 고 실 온에서 10 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>각 샘플을 CD34 절연 버퍼의 2.5 mL을 추가 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 자석으로 샘플을 배치.</li>
	<li>5 자석 반전 부 절연 버퍼 어 s.</li>
	<li>자석에서 샘플을 제거 하 고 3.10과 3.11 4 x 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>자석에서 튜브를 제거 하 고 CD34 절연 버퍼의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 5 분 동안 500 x g 에서 셀 펠 렛</li>
	<li>CD34 절연 버퍼의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend 및 셀. 참고: 여기, AT의 그램 당 세포의 평균 수는: (a) 옴 창 고: 4.75 x 104 ± 3.36 x 104; (b) SC 디포: 1.06 x 104 ± 9.53 x 103. CD31 플라스틱 immunobead 프로토콜 단계 3.16-3.34 ( 재료의 표참조)에 대 한 적응 했다.</li>
	<li>5 분 동안 500 x g 에서 셀 작은 고 버퍼 b 250 µ L에 250 µ L 워시 버퍼의 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>철저 하 게 vortexing 튜브에 의해 CD31 구슬 resuspend.</li>
	<li>CD31 구슬의 20 µ L를 추가 합니다. 참고: 때문에 총 셀 계산 > 1 x 106, 볼륨 제조업체의 입력에 따라 축소 했습니다.</li>
	<li>실 온에서 30 분, 락과 샘플을 품 어.</li>
	<li>살 균 50 mL 원뿔 튜브에 스 트레이너를 연결 합니다. 참고: 위에 여과기의 더 큰 개통 되어야 합니다.</li>
	<li>셀 분리 이전 equilibrate는 여과기를 세척 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 단계 3.16는 여과기를 생성 된 혼합물을 적용 합니다.</li>
	<li>20 mL의 전체 볼륨에 대 한 원형 모션 워시 버퍼의 5 mL와 여과기를 세척. 살 균 50 mL 원뿔 튜브에 커넥터를 연결 하 고 luer 잠금 닫습니다.</li>
	<li>커넥터는 여과기를 연결 합니다. 스 트레이너의 벽을 따라 워시 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 활성화 된 버퍼 D는 스 트레이너의 벽을 따라 1 mL를 추가 합니다. 샘플을 부드럽게 소용돌이 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>워시 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 10 배 아래로 pipetting으로 구슬에서 세포를 구분 합니다. 참고: 공기 거품을 생성 하지 마십시오.</li>
	<li>Luer 잠금 열고 50 mL 원뿔 관으로 흐름을 분리 된 세포를 허용 합니다. 스 트레이너 10 세척 세척 버퍼 각 시간의 1 mL x.</li>
	<li>커넥터와 여과기 취소 및 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 샘플을 원심 문화에 대 한 완전 한 EGM-2 미디어의 2 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 참고:이 시점에서의 그램 당 세포의 평균 수는: (a) 옴 창 고: 5.92 x 103 ± 4.27 x 103; (b) SC 디포: 4.12 x 103 ± 2.1 x 103. 두 플랫폼에서 셀의 90% 이상 이었다.</li>
</ol>4. 지질 격리 된 내 피 세포에서의 유도
<ol><li>37 ° C, 5% CO2 배양 기에서에서 완전 한 EGM-2 미디어와 6 잘 조직 문화 취급 플레이트에 셀 성장. 대체 미디어 셀 80-90%의 합류를 도달할 때까지 매 3-4 일. 참고: 2-3 일 사이 배로 인구.</li>
	<li>100 mm 페 트리 접시에 그들을 도금 하 여 셀을 확장 하 고 1:3 번 셀을 분할. 이 단계에서 세포 통행 2에 있습니다.</li>
	<li>수 자동 셀을 사용 하 여 셀 카운터 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>6 잘 플레이트 각 서비스 센터와 문화 그들에 2 일 동안 EGM-2 미디어를 완료에 대 한 중복 우물 보장으로 씨 약 100-200, 000 셀입니다.</li>
	<li>어떤 성장 매체 떨어져 발음 하 고 5 %DMEM / F12의 2 mL FBS 50 µ g/mL 페니실린/스 컨트롤에 대 한 세포 및 지질 미디어 (단계 1.4 참조) 치료 세포의 2 mL와 함께 그것을 대체 하 고.</li>
	<li>37 ° c 습도 5%에서 세포를 품 어 CO2 인큐베이터 13 일에 대 한 대체 해당 미디어 매 3 ~ 4 일. 참고: 셀 치료의 4 일 후 지질 축적 시작 됩니다.</li>
	<li>오로 빨간 게시 방법15-17에 따라 얼룩 나 일을 수행 합니다.</li>
	<li>RNA 추출에 대 한 셀을, 6-잘 유도 오븐에서 미디어를 제거 하 고 살 균 PBS의 1 mL와 함께 그것을 씻어.</li>
	<li>Guanidium 안산 클로 페 놀 프롬-솔루션의 350 µ L 추가 ( 재료의 표참조) 각 음을 5-10 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.</li>
	<li>셀 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 격판덮개 떨어져 긁 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 세포를 전송. 참고: 샘플 RNA 추출 및 추가 나중에 처리-80 ° C 냉동 실에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>적응된 RNA 추출을 사용 하 여 샘플에서 mRNA를 추출 ( 재료의 표참조) 프로토콜.</li>
	<li>실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 다음 프로브를 사용 하 여 유전자 발현을 평가 하기 위해 수행: adiponectin, UCP-1, 그리고 CIDEA ( 재료의 표참조). 참고: 여기, RT-PCR 절차 실행 되었다 다음과 같은 표준 프로토콜을 사용 하 여: 변성 (95 ° C, 15 s), 어 닐 링, 그리고 40 사이클에 대 한 확장 (60 ° C, 1 분). CT 값으로 유전자 표현 샘플 > 35 탐지 여겨졌다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 종이의 초점 절연, 확장 및 adipogenic CD34 + CD31 + 인간 지방 조직의 내장과 피하 창 고에서 내 피 세포의 유도 대 한 방법론을 제공 하는 것입니다.
설치류 또는 인간 CD31 항 체 붙일 표시 또는 자석 구슬18, 결합을 사용 하 여 주로 기법을 포함 하는 다양 한 혈관 침대에서 내 피 세포의 고립에 대 한 보고 된 방법론 19 , <sup class...

최근의 증거는 쥐와 인간에서 지방 조직 맥 관 구조에 있는 셀의 하위 집합 분화 될 수 있다 중 흰색 또는 베이지색/브라운 adipocytes1,2,3으로 보여줍니다. 이러한 세포의 표현 형은 내 피 세포, 평활 근/pericyte, 또는 중간 고기4,5,,67의 스펙트럼을 지 원하는 증거와 함께 논쟁의 주제 이다. 이 방법론을 개발의 범위 CD34 + CD31 + 비만 인간에서 다른 지방 저장소에서 분리 된 내 피 세포의 adipogenic 잠재력을 테스트 했다. 문학에서 다른 연구는 잠재적인 또는 알려진된 체형 창시자2,,89의 총 stromal 혈관 분수의 adipogenic에 초점을 맞추고. 현재 기존 기술 마약 배달10에 대 한 내 피 세포를 지방 조직 구체적으로 타겟팅 할 수 있습니다, adipogenic을 같은 세포의 잠재력을 이해 흰색 또는 베이지색 adipocytes 향해 유도 이므로 중요 한 미래 치료 대상.
다른 그룹 보고 인간 지방 조직11,,1213에서 내 피 세포를 분리 하는 대리 모 알선으로 CD31와 CD34 마커의 조합. 일반적으로, 고립 2 개의 일련의 단계와 긍정적인 선택 마그네틱 비즈를 사용 하 여 사용 하 여 수행 됩니다. 이 보고서에서 immunoseparation CD34 + 자석 구슬 CD31 플라스틱 구슬과 결합을 사용 하 여 이용 되었다. 우리는이 기술은 전형적인 조약돌 내 피 형태학의 보존에 관하여 순차적 자석 immunoseparation에 우수한 발견. 또한, 확장 및 adipogenic 유도에서 작은 지방 1-2 g로 시작에 필요한 충분 한 세포를 생성할 수 있었습니다. 피하 지방의 작은 샘플 생 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 셀의 필요한 수량을 생산 하기 위해 충분 하다. 이 점은 잠재적으로 중요 한 경우에 특히이 방법은 인체에 adipogenic 유도에 응답에 대 한 심사에 활용 됩니다.
다른 시스템과 달리 문학에서 보고,이 방법 활용 CD34 + CD31 + 세포의 adipogenic 유도 대 한만 두 재료: 가진 주 작동 근-rosiglitazone-및 인간의 인슐린. 중요 한 것은, 사용 하는 인슐린의 양을 순환 인간14post-absorptive 인슐린의 정상/높은 범위 내에서 넘어진다. 세포에는 생체 외에서Akt 인 산화에 의해 측정의 인슐린 응답의 정도 칵테일 유도에 대응 하는 능력 연결 되지 않습니다. 흥미롭게도,이 유도 칵테일 및 실험 조건을 사용 하 여, 흰색과 베이 지/브라운 셀의 혼합 얻은 했다 크기와 세포내 지질 방울과 분자 마커의 식의 숫자에 의해 결정 된 대로. 잠재적으로 차별화 된 베이지색의 균형을 변경할 수 있는 에이전트의 심사에 대 한 응답자 셀 (베이 지 화이트 대 )의 표현 형의 양적 평가 함께이 간단 하 고 비용 효율적인 유도 프로토콜 허용 : 화이트 adipocytes.
이 메서드는 또한 인간 지방 조직에서 혈관 내 피 창시자의 지질의 근본적인 메커니즘을 이해 하기 위한 변환 방법을 제공 합니다. 이 특정 격리/차별화 기술을 사용 하 여, 조사 야 위 고 뚱뚱한 인간의 다양 한 지방 창 고에서 책임 지질 혈관 내 피 세포의 하위 집합에 대 한 다양 한 경로 심문 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;Large Equipment&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Biosafety Cabinet&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Nuaire&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;nu-425-400&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Cell Culture Incubator&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;800 DH&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Water Bath&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Forma Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;2568&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Reciprocal Shaker&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;RT-PCR Machine&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;CFX96-C1000&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Electrophoresis Box&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Mini PROTEAN 3 Cell&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Transblot Box&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Mini Trans-Blot Cell&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Electrophoresis Power Supply&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;PowerPac Basic&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;ELISA Reader&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Molecular Devices&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;SpectraMax M5&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Blot Reader&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;LI-COR&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Odyssey&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Near Infrared&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Refrigerated Centrifuge&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Eppendorf&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;5810 R&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Tabletop Centrifuge&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Eppendorf&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;MiniSpin Plus&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Fluorescent Microscope&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Olympus&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BX50&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Inverted Microscope&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Nikon&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;TMS&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;KRBSS Buffer&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;HEPES&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Research Products International&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;H75030&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Sodium bicarbonate&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;792519&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Calcium chloride dihydrate&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;C7902&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Potassium phosphate monobasic&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;P5655&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Magnesium sulfate&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;M2643&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Sodium chloride&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;746398&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Sodium phosphate monobasic monohydrate&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;S9638&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Potassium chloride&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;P9333&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Glucose&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Acros Organics&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;410950010&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Adenosine&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Acros Organics&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;164040250&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Bovine Serum Albumin&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;GE Healthcare Bio-Sciences&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;SH30574.02&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Penicillin/Streptomycin&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;15070063&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;Tissue Digestion&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;20 mL Syringe&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Global Medical&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;67-2020&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Nylon Mesh, 250 &amp;micro;m&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sefar&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;03-250/50&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Pipetting Needles&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Popper&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;7934&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Fine Scissors&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Fine Science Tools&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;14058-11&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Tissue Forceps&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;George Tiemann &amp;amp; Co&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;160-20&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Collagenase, Type I&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Worthington Biochemical&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;LS004196&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Petri Dishes, 100 mm&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;USA Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;5666-4160&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;TC Treated&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Eppendorf Tubes, 1.5 mL&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;USA Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;1615-5500&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Conical Tubes, 15 mL&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Nest Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;601052&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Conical Tubes, 50 mL&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Nalgene&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;3119-0050&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Scintillation Vials&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Kimble&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;74505-20&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Tissue Dicing&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;Cell Isolation&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Cellometer&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Nexcelom&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Auto 2000&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Cellometer Slides&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Nexcelom&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;CHT4-SD100-002&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Cellometer Viability Stain&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Nexcelom&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;CS2-0106-5mL&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Acridine Orange/Propidium Iodine&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Anti-CD34 Magnetic Beads&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;StemCell Technologies&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;18056&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Kit&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;EasySep Magnet&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;StemCell Technologies&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;18000&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Anti-CD31 Plastic Beads&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;pluriSelect USA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;19-03100-10&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;pluriSelect 10x Wash Buffer&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;pluriSelect USA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;60-00080-10&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;pluriSelect Connector Ring&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;pluriSelect USA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;41-50000-03&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;pluriSelect Detachment Buffer&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;pluriSelect USA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;60-00046-12&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;pluriSelect Incubation Buffer&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;pluriSelect USA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;60-00060-12&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;pluriSelect S Cell Strainer&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;pluriSelect USA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;43-50030-03&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;Cell Culture&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;6-well Plates&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;USA Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;CC7682-7506&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;TC Treated&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;4-well chambered slides&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Corning Life Sciences&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;354559&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Fibronectin coated&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;4-well chambered slides&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;154526PK&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Uncoated glass&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sciencell Research Laboratories&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;7200&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Primary cell line&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Endothelial Cell Media (ECM)&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;ScienCell Research Laboratories&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;1001&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Complete Kit&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;DMEM/F12 Basal Media&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;11320082&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Fetal Bovine Serum (FBS)&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Rocky Mountain Biologicals&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;FBS-BBT&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Insulin&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Lilly&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;U-100&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Humalog&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Rosiglitazone&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;R2408&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;Cell Analysis&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Oil Red O Dye&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;O0625&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Prepared in isopropanol&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;96 well plates&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;USA Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;1837-9600&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;96 well PCR plates&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Genesee Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;24-300&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;RNA Extraction&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Zymo Research&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;R2072&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Kit&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;cDNA Synthesis&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;1708841&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Supermix&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;JumpStart PCR Polymerase&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;D9307-250UN&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Hot start, with PCR Buffer N&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Magnesium Chloride Solution&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;M8787-5ML&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;3 mM final in PCR reaction&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;dNTPs&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Promega&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;U1515&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;TaqMan AdipoQ&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Hs00605917_m1&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;TaqMan CIDEA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Hs00154455_m1&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;TaqMan RPL27&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Hs03044961_g1&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;TaqMan UCP1&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Hs00222453_m1&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;BCA Assay&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;QPBCA-1KT&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Kit&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Bis-acrylamide&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;1610146&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;40% stock solution&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Ammonium Persulfate&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;1610700&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;TEMED&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;1610800&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Tris&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;T1503&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Glycine&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;1610718&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Sodium Dodecal Sulfate&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;L3771&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;EDTA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;S311-100&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Bromophenol Blue&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;B8026&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Blot Membrane&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;EMD Millipore&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;IPFL00010&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Methanol&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;A452-SK4&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Odyssey Blocking Buffer, Tris&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;LI-COR&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;927-50000&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Anti-AKT antibody&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Cell Signaling Technology&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;2920S&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Mouse monoclonal&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Anti-pAKT antibody&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Cell Signaling Technology&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;9271S&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Rabbit polyclonal&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Anti-UCP1 antibody&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Abcam&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;ab10983&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Rabbit polyclonal&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Anti-Mouse IgG antibody&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;LI-COR&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;926-68070&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Goat Polyclonal, IRDye 680RD&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Anti-Rabbit IgG antibody&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;LI-COR&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;926-32211&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Goat Polyclonal, IRDye 800CW&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Anti-Rabbit IgG antibody&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Jackson ImmunoResearch&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;111-025-003&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Goat Polyclonal, TRITC&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Phosphate Buffer Saline&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;10010049&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;37% Formaldehyde Solution&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Electron Microscopy Sciences&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;15686&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;4% solution for cell fixation&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Normal Goat Serum&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Vector Laboratories&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;S-1000&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;10% blocking solution&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Triton X-100&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;X-100&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;0.1% permeabilization solution&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;DAPI&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;D1306&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Calcein AM&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;65-0853-39&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Cell fluorescent visualization&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Matrigel Basement Membrane Matrix&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Corning Life Sciences&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;356231&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Growth factor reduced&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;DiI labeled Acetylated LDL&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;L3484&lt;/p&gt; </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, expansion, and adipogenic induction of cd34+cd31+ endothelial cells from human omental and subcutaneous adipose tissue

비만 체형 비 통해 주로 지방 조직에의 개장 하는 광범위 한 함께 제공 됩니다. 극단적인 체형 성장 인슐린, 로컬 hypoxia, 그리고 염증에 빈약한 응답에 결과. 창시자에서 기능 흰색 adipocytes의 분화를 자극 하 여 체형 인구의 급진적인 비를 막을 수 있다, 따라서, 지방 조직의 대사 건강의 감소와 함께 향상 시킬 수 있습니다. 염증입니다. 또한, 베이 지/브라운 adipocytes의 분화를 자극 하 여 몸 전체 에너지 지출을 늘릴 수 있습니다, 체중 감소의 결과로. 이 이렇게 비만 공동 morbidities 2 형 당뇨병 및 심혈 관 질환 등의 개발을 방지할 수 있습니다.
이 종이 절연, 확장, 및 공동 CD31와 CD34 마커를 표현 하는 인간 지방 조직 내 피 세포의 부분 집합에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화에 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 상대적으로 저렴 하 고 노동 집약 되지 않습니다. 그것은 인간의 지방 조직에 대 한 액세스를 요구 한다 고 피하 디포 샘플링에 대 한 적합 합니다. 이 프로토콜에 대 한 병 적으로 뚱뚱한 주제에서 신선한 지방 조직 샘플 [신체 질량 지 수 (BMI) > 35] bariatric 수술 절차 동안 수집 됩니다. Stromal 혈관 분수에서 순차적 immunoseparation를 사용 하 여, 충분 한 셀에서 작은 지방의 2-3 g로 생산 됩니다. 이러한 세포 문화에 10-14 일 동안 확장 될 수 있다, cryopreserved 수 그리고 통로 5-6까지 뿌리고 그들의 adipogenic 속성을 유지 합니다. 세포는 adipogenic 칵테일 인간 인슐린의 조합과 가진 주 작동 근 rosiglitazone을 사용 하 여 14 일에 대 한 처리 됩니다.
이 방법론 지방 내 피 세포에서 adipogenic 응답을 드라이브 하는 분자 메커니즘에 대 한 개념 실험의 증거를 얻기 위해 사용할 수 있습니다 또는 심사는 adipogenic을 향상 시킬 수 있는 새로운 약물에 대 한 응답도 흰색으로 감독 또는 베이 지/브라운 체형 차별화입니다. 작은 피하 biopsies을 사용 하 여,이 방법론을 화면 베이 지/브라운과 흰색 adipocytes 비만 공동 morbidities의 치료에 대 한 자극을 목적으로 하는 임상 시험에 대 한 응답자 비 과목으로 사용할 수 있습니다.

우리의 프로토콜 CD34 + CD31 + 다른 플랫폼의 인간 지방 조직에서 혈관 세포의 adipogenic 잠재력을 결정 하기 위해 생체 외에서 접근을 제공 하는 것을 목표로. 간단한 순서도 다이어그램 그림 1A에 표시 됩니다. 셀을 표현 CD34의 긍정적인 선택을 사용 하 여 첫 번째 단계 갓 고립 된 세포 (그림 1A)의 인구에서 CD34 + 세포 > 95%에?...

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Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

지방 조직 혈관 창시자에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화는 비만에 대사 개선 위한 잠재력을 맺는 다. 우리는 CD34 + CD31 + 인간의 지방에서 내 피 세포 격리 및 후속 시험관에 확장 및 차별화 흰색과 베이지색 adipocytes에 프로토콜을 설명합니다. 여러 다운스트림 응용 프로그램을 설명 합니다.

절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

isolation-expansion-adipogenic-induction-cd34-cd31-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.7K 조회수.  Eastern Virginia Medical School. 지방 조직 혈관 창시자에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화는 비만에 대사 개선 위한 잠재력을 맺는 다. 우리는 CD34 + CD31 + 인간의 지방에서 내 피 세포 격리 및 후속 시험관에 확장 및 차별화 흰색과 베이지색 adipocytes에 프로토콜을 설명합니다. 여러 다운스트림 응용 프로그램을 설명 합니다.

비디오: Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

연구

발생학

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the development of hypertension during obesity. The extent of hypertrophy and hyperplasia depends on depot location, sex, and the type of Adipocyte Progenitor Cell (APC) phenotypes present. Techniques used for APC and preadipocytes isolation in the last 10 years have drastically improved the accuracy at which individual cells can be identified based on specific cell surface markers. However, isolation of APC and adipocytes can be a challenge due to the fragility of the cell, especially if the intact cell must be retained for cell culture applications.
Magnetic-activated Cell Sorting (MCS) provides a method of isolating greater number of viable APC per weight unit of adipose tissue. APC harvested by MCS can be used for in vitro protocols to expand preadipocytes and differentiate them into adipocytes through use of growth factor cocktails allowing for analysis of the prolific and adipogenic potential retained by the cells. This experiment focused on the aortic and mesenteric PVAT depots, which play key roles in the development of cardiovascular disease during expansion. These protocols describe methods to isolate, expand, and differentiate a defined population of APC. This MCS protocol allows isolation to be used in any experiment where cell sorting is needed with minimal equipment or training. These techniques can aid further experiments to determine the functionality of specific cell populations based on the presence of cell surface markers.

Here we report a method for isolation of Adipocyte Progenitor Cell (APC) populations from Perivascular Adipose Tissue (PVAT) using Magnetic-activated Cell Sorting (MCS). This method allows for an increased isolation of APC per gram of adipose tissue when compared to Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS).

자기 활성화 세포 정렬에 의해 분리 된 혈관 주위 지방 조직으로부터의 지방 전구 세포 전구 세포의 확장 및 지방 생성 유도

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute functionally to the expansion and remodeling of WAT in adulthood. A tremendous barrier to studying the implications of this cellular heterogeneity is the inability to readily isolate functionally distinct cell subpopulations from WAT SVF for in vitro and in vivo analyses. Single-cell sequencing technology has recently identified functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic PDGFR&#946;+ perivascular cell subpopulations in intra-abdominal WAT depots of adult mice. Fibro-inflammatory progenitors (termed, &#8220;FIPs&#8221;) are non-adipogenic collagen producing cells that can exert a pro-inflammatory phenotype. PDGFR&#946;+ adipocyte precursor cells (APCs) are highly adipogenic both in vitro and in vivo upon cell transplantation. Here, we describe multiple methods for the isolation of these stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal WAT depots. FIPs and APCs can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by taking advantage of biotinylated antibody-based immunomagnetic bead technology. Isolated cells can be used for molecular and functional analysis. Studying the functional properties of stromal cell subpopulation in isolation will expand our current knowledge of adipose tissue remodeling under physiological or pathological conditions on the cellular level.

This protocol describes the technical approach to isolate adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal white adipose tissue (WAT) depots by fluorescence-activated cell sorting or immunomagnetic bead separation.

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

면역학 및 감염병학

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

생물학

<meta charset="utf8"></head><body>인간 SATMVEC: 분리 및 지방세포 누화 연구

Studying Adipose Endothelial Cell/Adipocyte Cross-Talk in Human Subcutaneous Adipose Tissue

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. Significant heterogeneity in endothelial cell (EC) genotype and phenotype depends on their vascular bed and host disease state. The ability to isolate MVECs from tissue-specific vascular beds and individual patient groups offers the opportunity to directly compare MVEC function in different disease states. Here, using subcutaneous adipose tissue (SAT) taken at the time of insertion of cardiac implantable electronic devices (CIED), we describe a method for the isolation of a pure population of functional human subcutaneous adipose tissue MVEC (hSATMVEC) and an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.
hSATMVEC were isolated following enzymatic digestion of SAT by incubation with anti-CD31 antibody-coated magnetic beads and passage through magnetic columns. hSATMVEC were grown and passaged on gelatin-coated plates. Experiments used cells at passages 2-4. Cells maintained classic features of EC morphology until at least passage 5. Flow cytometric assessment showed 99.5% purity of isolated hSATMVEC, defined as CD31+/CD144+/CD45-. Isolated hSATMVEC from controls had a population doubling time of approximately 57 h, and active proliferation was confirmed using a cell proliferation imaging kit. Isolated hSATMVEC function was assessed using their response to insulin stimulation and angiogenic tube-forming potential. We then established an hSATMVEC-subcutaneous adipocyte co-culture model to study cellular cross-talk and demonstrated a downstream effect of hSATMVEC on adipocyte function.
hSATMVEC can be isolated from SAT taken at the time of CIED insertion and are of sufficient purity to both experimentally phenotype and study hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 피하 지방 조직 미세혈관 연구를 통한 심장 대사 질환에 대한 통찰력

Here, we describe a protocol for isolating, culturing, and phenotyping microvascular endothelial cells from human subcutaneous adipose tissue (hSATMVECs). Additionally, we describe an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

인간 피하 지방 조직에서 지방 내피 세포/지방 세포 누화 연구

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. ...

의학

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone regulation, barrier functions, and angiogenesis. Endothelial cell dysfunction is a hallmark predictor and major driver for the progression of severe cardiovascular diseases, yet the underlying mechanisms remain poorly understood. The ability to isolate and perform analyses on endothelial cells from various vascular beds in their native form will give insight into the processes of cardiovascular disease. This protocol presents the procedure for the dissection of mouse subcutaneous and mesenteric adipose tissues, followed by isolation of their respective arterial vasculature. The isolated arteries are then digested using a specific cocktail of digestive enzymes focused on liberating functionally viable endothelial cells. The digested tissue is assessed by flow cytometry analysis using CD31+/CD45&#8722; cells as markers for positive endothelial cell identification. Cells can be sorted for immediate downstream functional assays or used to generate primary cell lines. The technique of isolating and digesting arteries from different vascular beds will provide options for researchers to evaluate freshly isolated vascular cells&#160;from arteries of interest and allow them to perform a wide range of functional tests on specific cell types.

This protocol details a method for the dissection of mouse adipose depots and the isolation and digestion of respective arteries to liberate and then identify the endothelial cell population. Freshly isolated cells used in downstream applications will advance the understanding of vascular cell biology and the mechanisms of vascular dysfunction.

다운스트림 적용을 위한 별개의 지방 저장소에서 혈관 내피 세포의 분리 및 식별

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

지방 조직 유래 줄기세포 분리 및 특성 분석

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in addition to their great capacity for self-renewal, migration, and proliferation. Adipose tissue is one of the least invasive and most accessible sources of mesenchymal cells. It has also been reported to have higher yields compared to other sources, as well as superior immunomodulatory properties. Recently, different procedures for obtaining adult mesenchymal cells from different tissue sources and animal species have been published. After evaluating the criteria of some authors, we standardized a methodology that is applicable to different purposes and easily reproducible. A pool of stromal vascular fraction (SVF) from perirenal and epididymal adipose tissue allowed us to develop primary cultures with optimal morphology and functionality. The cells were observed adhered to the plastic surface for 24 h, and exhibited a fibroblast-like morphology, with prolongations and a tendency to form colonies. Flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF) techniques were used to assess the expression of the membrane markers CD105, CD9, CD63, CD31, and CD34. The ability of adipose-derived stem cells (ASCs) to differentiate into the adipogenic lineage was also assessed using a cocktail of factors (4 &#181;M insulin, 0.5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine, and 1 &#181;M dexamethasone). After 48 h, a gradual loss of fibroblastoid morphology was observed, and at 12 days, the presence of lipid droplets positive to oil red staining was confirmed. In summary, a procedure is proposed to obtain optimal and functional ASC cultures for application in regenerative medicine.

저자 스포트라이트: Sprague Dawley Rats의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별  

This protocol describes a methodology for isolating and identifying adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) from Sprague Dawley rats.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

자기 활성화 세포 정렬에 의해 분리 된 혈관 주위 지방 조직으로부터의 지방 전구 세포 전구 세포의 확장 및 지방 생성 유도

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마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

인간 피하 지방 조직에서 지방 내피 세포/지방 세포 누화 연구

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다운스트림 적용을 위한 별개의 지방 저장소에서 혈관 내피 세포의 분리 및 식별

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

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