우리는 FACS 분류에 대한 지원을 위해 메이요 클리닉 현미경 세포 분석 코어 흐름 세포 분석 시설을 인정합니다.

모든 동물 실험 절차는 메이요 클리닉 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아 수행되었습니다.
1. 솔루션 준비 
<ol><li>콜라게나아제 2% (w/v) 용액을 100mL 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)으로 콜라게나아제 II 2g을 용해시켜 준비합니다. Aliquot 200 μL 각 사용에 대 한.</li>
	<li>84mL F-12 배지, 15mL 말 혈청, 1mL 페니실린/연쇄절제술을 혼합하여 중화 매체를 준비한다.</li>
	<li>덜베코의 인산완충식식염(DPBS)의 100mL에서 소 세럼 알부민(BSA)과 0.5M EDTA의 400 μL을 용해하여 유동 세포측정 버퍼를 준비한다.</li>
</ol>2. 부피성 지방 패드 및 조직 해리의 해부
<ol><li>인간적으로 안락사 (이소플루란 / 자궁 경부 탈구) 하나의 남성 마우스. 이 프로토콜에서는 4개월 된 FVB 마우스가 사용되었습니다.</li>
	<li>복부에 70% 에탄올을 바르고 깨끗한 가위와 집게를 사용하여 하복부를 노출시합니다.</li>
	<li>부피성 지방 패드(상반된 지방 패드/고환에 부착)를 찾습니다. 무딘 집게와 고환과 고환 지방 패드 사이의 접합을 잡고 부피 지방 패드를 해방부드럽게 당깁니다.</li>
	<li>실온에서 50mL 원피스 튜브에서 3%의 BSA로 보충된 HBSS5mL에서 가위를 사용하여 절단하여 고환을 제거하고 5mL 의 부피성 지방 패드를 15분 동안 제거합니다.</li>
	<li>원심분리기는 4°C에서 7분 동안 150 x g의 원심분리기.</li>
	<li>50mL 원뿔관에서 부동 부피 지방 패드를 가지고 깨끗한 가위를 사용하여 조직을 잘게 다진다.</li>
	<li>13mL 배양 튜브에 200 μL 콜라게나아제 2% 용액을 3.8mL의 HBSS에 추가합니다. 다진 조직을 추가하고 37 °C에서 1 시간 동안 5 rpm에서 회전 인큐베이터에 인큐베이션을 넣습니다. 회전 인큐베이터 대신 37°C의 세포 배양 인큐베이터는 가끔 동요와 함께 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>전체 내용을 50mL 원문 튜브로 옮기고 10mL의 중화 매체를 추가합니다. 튜브를 2-3번 반전시켜 부드럽게 섞는다.</li>
	<li>70 μm 세포 스트레이너가 장착된 또 다른 50mL 원전 튜브를 준비합니다. 소화된 조직을 세포 여과기를 사용하여 새로운 튜브로 필터링합니다.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 350 x g에서 15mL 원심분리기및 원심분리기로 유동을 전달합니다.</li>
	<li>조심스럽게 상체를 제거하고 DPBS의 5 mL로 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 4°C에서 10분 동안 350 x g의 원심분리기.</li>
	<li>상체를 조심스럽게 제거하고 50 μL의 유동 세포 측정 버퍼를 추가합니다. 부드럽게 파이펫으로 잘 섞어서 얼음 위에 세포를 보관하세요. 세포 펠릿의 부피와 소량의 잔류 상류체로 인해, 유동 세포 분석 버퍼내의 총 세포 부피는 50 μL(약 100 μL)을 초과할 것이다.</li>
</ol>3. 항체 라벨링 및 형광 활성화 셀 정렬(FACS)
<ol><li>세포를 부드러운 파이펫팅과 잘 혼합한 후 셀 서스펜션의 54 μL을 1.7mL 마이크로센심분리기 튜브로 옮기습니다. FcR 블로킹 시약 6μL을 추가하고 부드럽게 파이펫팅하여 잘 섞습니다. 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오. 54 μL을 복용한 후 남은 세포를 저장하고 얼음에 보관하여 3.5 단계 및 3.6 단계에서 스테인드 컨트롤로 사용하십시오.</li>
	<li>3.1 단계에서 의 배양 중에, 마이크로센티립후지 튜브에 각각 11 μL의 안티-Sca1-APC, 안티-테르119-FITC, 안티 CD31-FITC 및 안티 CD45-FITC 항체를 결합하여 항체 칵테일을 준비한다. 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞어서 빛으로부터 보호되는 얼음을 유지하세요.</li>
	<li>FcR 블로킹 시약으로 10분 동안 배양한 후 항체 칵테일의 40 μL을 추가하고 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>염색된 셀에 DAPI 1 μg/mL로 보충된 500 μL의 유동 세포분석 버퍼를 추가합니다. 셀 스트레이너 스냅 캡이 있는 5mL 테스트 튜브를 사용하여 부드러운 파이펫팅및 필터 셀로 잘 섞으세요. 얼음에 세포를 유지합니다.</li>
	<li>3.1 단계에서 남은 셀에 500 μL의 유동 세포 측정 버퍼를 추가하고 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 셀 스트레이너 스냅 캡이 있는 5mL 테스트 튜브를 사용하여 셀을 필터링합니다. 이 세포를 얼음위에 유지하고 다음 단계에서 스테인드 컨트롤로 사용하십시오.</li>
	<li>스테인드 셀과 스테인드 컨트롤을 FACS 분석 또는 정렬 기기로 가져 가라.<ol>
<li>도 1에표시된 게이팅 전략으로 APC+FITC-/DAPI- 인구를 식별하고 격리합니다. 이 세포는 실행 가능한 Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- 세포를 나타냅니다. 파편 및 셀 응집체는 전방(FSC) 및 측면 분산(SSC) 플롯을 사용하여 고갈됩니다. 그런 다음, DAPI- 인구가 문이 닫힌 다음 APC+/ FITC- 인구의 게이팅이 뒤따릅니다. 스테인드 컨트롤은 게이팅 매개 변수를 설정하는 데 사용되어야 합니다.</li>
		<li>1.5mL 마이크로센트심리후지 튜브에서 500μL의 유동 세포분석 완충제로 세포를 수집한다. 앞으로 모든 절차는 오염을 최소화하기 위해 멸균 조건에서 수행되어야합니다. 대략 50,000 - 100,000 세포는 1개의 마우스에서 집합됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 생존가능성을 평가하기 위해 혈종계를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포 집계는 추가 다운스트림 분석을 방해할 수 있기 때문에 셀 집계의 존재도 평가되어 이러한 응재의 최소 존재(실행 가능한 셀 수의 5%)를 보장합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution.">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li><li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+obesity+in+man:+cellular+character+of+the+adipose+tissue.">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li><li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue.">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li><li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+as+a+Disease.">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li><li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment:+going+back+to+the+future.">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li><li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling.">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).</li><li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling.">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li><li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice.">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636 (2018).</li><li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue.">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501 (2019).</li><li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots.">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li><li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues.">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li><li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells.">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li><li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples.">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219 (2020).</li><li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice.">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057 (2018).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair.">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li><li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects.">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li></ol>

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단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 단일 세포 수준에서 다양한 세포 집단을 동시에 연구하는 강력한 도구로서 빠르게 견인력을 얻고 있다. 시료 준비와 높은 처리량 시퀀싱과 관련된 높은 비용으로 인해 실험 성공 가능성을 높이기 위해 세포 입력(높은 생존가능성 및 순도)을 최적화하는 것이 필수적입니다. 일부 세포 준비 프로토콜은 FACS 정렬14없이 낮은 스핀 세차및 컬럼 기반 분리?...

지방 조직은 에너지 대사에 중요한 역할을합니다. 과도한 에너지는 지질의 형태로 저장되며, 지방 조직은 영양 상태와 에너지 수요에 따라 상당한 확장 또는 후퇴가 가능합니다. 지방 조직의 확장은 지방 세포 크기 (비대) 및 /또는 지방 세포 수 (hyperhyperasia)의 증가에서 발생할 수 있습니다. 후자의 과정은 지방 선조 세포의 증식 및 분화에 의해 단단히조절된다 1,2. 비만 도중, 지방 조직은 과도하게 확장되고, 조직 기능 장애 – 저산소증을 포함하여, 염증 및 인슐린 저항 - 수시로3,4를개발합니다. 이러한 합병증은 고혈압, 당뇨병, 심혈관 질환, 뇌졸중 및 암5를포함한 많은 만성 질환에 대한 위험 요소입니다. 따라서 통제되지 않는 지방 조직 확장을 제한하고 지방 조직 병리학을 완화하는 것이 최고의 생체 의학 연구 우선 순위입니다. 지방 조직 팽창 동안, 상주 지방 조직 유래 줄기 세포 (ASC)는 증식하고 preadipocytes로 순차적으로 분화 (헌신적 인 전구 세포) 다음 성숙한 지방 세포6로분화한다. 최근 단세포 RNA-시퀀싱(scRNA-seq) 연구는 이러한 지방 선조 세포(APC) 집단(ASC 및 preadipocytes)이 상당한 분자 및 기능성 이질성7,8,9,10,11,12를나타낸다는것을 보여준다. 예를 들어, ASC는 감소된 사이포겐화 분화 능력을 표시하는 동시에, 또한 지방세포7에비해 더 높은 증식 및 확장 기능을 나타낸다. 추가 분자 다름은 ASC 및 preadipocyte 인구 내에서 보고됩니다, 그러나 이 다름의 기능적인 관련성은 불분명남아7. 함께, 이러한 데이터는 지방 선조 세포 풀의 복잡성을 강조하고 더 나은 이해하고 이러한 중요한 세포 인구를 조작하기 위해 도구를 개발하고 표준화 할 필요성을 강조한다.
이 프로토콜은 단일 세포 연구 (scRNA-시퀀싱) 및 세포 배양을 포함하여 민감한 다운스트림 분석에 적합한 마우스 상피 지방 패드에서 높은 생존성 Sca1+ 지방 전구 집단의 분리를 자세히 설명합니다. 상고체 지방 패드의 격리 및 해리는 이전에 설명된 바와 같이 수행되었다7,13 격리 된 APC의 생존가능성을 개선하는 약간의 수정. 간단히 말해서, 상고성 지방 패드에서 해리된 세포는 Sca1에 대한 항체, ASC 및 프리디포사이클6,7및기타 계보(Lin) 마커모두에 대한 마커로 염색됩니다: Ter119(적혈구), CD31(내피 세포), CD45(leukocytes). 실행 가능한 Sca1+/ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- 세포는 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 의해 정렬됩니다. 중요한 것은, 이 프로토콜은 ASC 및 프레디포세포7내의 기능적으로 이질적인 하위 집단을 확인한 최근 단세포 RNA 시퀀싱 연구에서 보고된 실행 가능한 Sca1 +/Lin-분면 전구 세포의 성공적인 격리 및 분석에 의해 검증되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="799">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">87003-294</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">13 mL culture tube</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-809-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5 mL test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">70 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-CD31-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-CD45-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-Sca1-APC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-Ter119-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-112-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">BSA</td>
			<td style="width:181px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DAPI</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">F-12 medium</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">FcR blocking reagent</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hanks&#39; balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Horse serum</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues

당뇨병, 심장병 및 암과 같은 비만 및 대사 장애는 모두 극적인 지방 조직 리모델링과 관련이 있습니다. 조직 거주자 지방 선조 세포 (APC)는 조직 항상성에 중요한 역할을하고 조직 병리학에 기여할 수 있습니다. 단세포 RNA-염기서열 분석 및 단세포 프로테오믹스를 포함한 단일 세포 분석 기술의 사용이 증가하고 있으며, 인구 또는 조직 전반의 변화의 맥락 내에서 개별 세포 발현 변화의 전례 없는 해결을 허용함으로써 줄기/전구 세포 분야를 변화시키고 있다. 이 문서에서는 마우스 부피 지방 조직을 해부하고, 단일 지방 조직 유래 세포를 분리하고, 형광 활성화 세포 정렬(FACS)을 수행하여 실행 가능한 Sca1 +/CD31-/CD45-/Ter119- APC에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 프로토콜을 통해 조사관은 단일 세포 RNA 염기서열분석과 같은 다운스트림 분석에 적합한 고품질 APC를 준비할 수 있습니다.

4개월 된 남성 FVB 마우스는 이 실험에서 사용되었다. FSC/SSC 플롯을 사용하여 파편과 이중을 제외한 후 실행 가능한 세포(DAPI-인구)가 게이트되었고, 그 다음으로 APC+/FITC-인구(도1)의선택이 뒤따랐다. DAPI, APC 및 FITC 게이트는 스테인드 컨트롤을 기반으로 그려졌습니다. 게이팅 전략은 그림 1에표시됩니다.
1h ?...

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Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

우리는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 마우스 전도성 지방 패드에서 매우 실행 가능한 지방 전구 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다.

마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

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Research

JoVE Journal

Biology

5.5K 조회수.  Mayo Clinic. 우리는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 마우스 전도성 지방 패드에서 매우 실행 가능한 지방 전구 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다.

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Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

연구

생물학

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. Adipogenic differentiation of progenitor cells is a major mechanism driving adipose tissue expansion and dysfunction in response to obesity. Understanding changes to perivascular adipose tissue (PVAT) is thus clinically relevant in metabolic disease. However, previous studies have been predominately performed in the mouse and other animal models. This protocol uses human thoracic PVAT samples collected from patients undergoing coronary artery bypass graft surgery. Adipose tissue from the ascending aorta was collected and used for explantation of the stromal vascular fraction. We previously confirmed the presence of adipose progenitor cells in human PVAT with the capacity to differentiate into lipid-containing adipocytes. In this study, we further analyzed the differentiation potential of cells from the stromal vascular fraction, presumably containing multi-potent progenitor cells. We compared PVAT-derived cells to human bone marrow MSC for differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages. Following 14 days of differentiation, specific stains were utilized to detect lipid accumulation in adipocytes (Oil red O), calcific deposits in osteogenic cells (Alizarin Red), or glycosaminoglycans and collagen in chondrogenic cells (Masson&#8217;s Trichrome). While bone marrow MSC efficiently differentiated into all three lineages, PVAT-derived cells had adipogenic and chondrogenic potential, but lacked robust osteogenic potential.

The goal of this protocol is to test the ability of progenitor cells derived from human perivascular adipose tissue to differentiate into multiple cell lineages. Differentiation was compared to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, which is known to differentiate into adipocyte, osteocyte, and chondrocyte lineages.

인간의 대동맥 혈관 주위 지방 조상 세포의 분화 능력

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, uncoupling of metabolism to generate heat, and secretion of adipokines to regulate whole-body homeostasis and immune responses. Emerging research is identifying important regional differences in the developmental, molecular, and functional profiles of adipocytes located in discrete depots throughout the body. Different properties of the depots are medically relevant since metabolic diseases often demonstrate depot-specific effects. This protocol will provide investigators with a detailed anatomic atlas and dissection guide for the reproducible and accurate identification and excision of diverse mouse adipose tissues. Standardized dissection of discrete adipose depots will allow detailed comparisons of their molecular and metabolic characteristics and contributions to local and systemic pathologic states under various nutritional and environmental conditions.

Adipocytes exist in discrete depots and have diverse roles within their unique microenvironments. As regional differences in adipocyte character and function are uncovered, standardized identification and isolation of depots is crucial for advancement of the field. Herein, we present a detailed protocol for the excision of various mouse adipose depots.

다양한 마우스 지방 창고의 식별 및 해부

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone regulation, barrier functions, and angiogenesis. Endothelial cell dysfunction is a hallmark predictor and major driver for the progression of severe cardiovascular diseases, yet the underlying mechanisms remain poorly understood. The ability to isolate and perform analyses on endothelial cells from various vascular beds in their native form will give insight into the processes of cardiovascular disease. This protocol presents the procedure for the dissection of mouse subcutaneous and mesenteric adipose tissues, followed by isolation of their respective arterial vasculature. The isolated arteries are then digested using a specific cocktail of digestive enzymes focused on liberating functionally viable endothelial cells. The digested tissue is assessed by flow cytometry analysis using CD31+/CD45&#8722; cells as markers for positive endothelial cell identification. Cells can be sorted for immediate downstream functional assays or used to generate primary cell lines. The technique of isolating and digesting arteries from different vascular beds will provide options for researchers to evaluate freshly isolated vascular cells&#160;from arteries of interest and allow them to perform a wide range of functional tests on specific cell types.

This protocol details a method for the dissection of mouse adipose depots and the isolation and digestion of respective arteries to liberate and then identify the endothelial cell population. Freshly isolated cells used in downstream applications will advance the understanding of vascular cell biology and the mechanisms of vascular dysfunction.

다운스트림 적용을 위한 별개의 지방 저장소에서 혈관 내피 세포의 분리 및 식별

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

지방 조직 유래 줄기세포 분리 및 특성 분석

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in addition to their great capacity for self-renewal, migration, and proliferation. Adipose tissue is one of the least invasive and most accessible sources of mesenchymal cells. It has also been reported to have higher yields compared to other sources, as well as superior immunomodulatory properties. Recently, different procedures for obtaining adult mesenchymal cells from different tissue sources and animal species have been published. After evaluating the criteria of some authors, we standardized a methodology that is applicable to different purposes and easily reproducible. A pool of stromal vascular fraction (SVF) from perirenal and epididymal adipose tissue allowed us to develop primary cultures with optimal morphology and functionality. The cells were observed adhered to the plastic surface for 24 h, and exhibited a fibroblast-like morphology, with prolongations and a tendency to form colonies. Flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF) techniques were used to assess the expression of the membrane markers CD105, CD9, CD63, CD31, and CD34. The ability of adipose-derived stem cells (ASCs) to differentiate into the adipogenic lineage was also assessed using a cocktail of factors (4 &#181;M insulin, 0.5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine, and 1 &#181;M dexamethasone). After 48 h, a gradual loss of fibroblastoid morphology was observed, and at 12 days, the presence of lipid droplets positive to oil red staining was confirmed. In summary, a procedure is proposed to obtain optimal and functional ASC cultures for application in regenerative medicine.

저자 스포트라이트: Sprague Dawley Rats의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별  

This protocol describes a methodology for isolating and identifying adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) from Sprague Dawley rats.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Murine Perivascular Adipose Tissue에서 분리된 지방세포(preadipocytes) 배양

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown adipocytes. Recent discoveries have shed light on the central role of PVAT in regulating vascular homeostasis and participating in the pathogenesis of cardiovascular diseases. A comprehensive understanding of PVAT properties and regulation is of great importance for the development of future therapies. Primary cultures of periaortic adipocytes are valuable for studying PVAT function and the crosstalk between periaortic adipocytes and vascular cells. This paper presents an economical and feasible protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, which can be useful for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro. The protocol outlines tissue processing and cell differentiation for culturing periaortic adipocytes from young mice. This protocol will provide the technological cornerstone at the bench side for the investigation of PVAT function.

저자 스포트라이트: 마우스 혈관 주위 지방 조직에서 SVF 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방형성 유도의 중요성 

Here, we describe the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, allowing for the study of perivascular adipose tissue function and its relationship with vascular cells.

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue(마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도)