저자는이 프로젝트를 수행하기 위해 제공 된 지원에 대해 멕시코 사회 보장 연구소 (IMSS)와 멕시코 아동 병원, 페데리코 고메즈 (HIMFG) 및 IMSS 연구 조정의 Bioterio 직원에게 감사드립니다. AOC (815290) 장학금에 대한 국립 과학 기술위원회와 시청각 자료에 대한 기술 지원에 대해 Antonio Duarte Reyes에게 감사드립니다.

모든 실험 절차는 국제 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexico)의 권장 사항에 따라 멕시코 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 Instituto Mexicano del Seguro Social의 건강 연구 윤리 위원회(R-2021-785-092)에서 검토, 승인 및 등록했습니다.
1. 외과적 절제술에 의한 쥐의 지방조직 제거
<ol><li>20mL의 멸균 1x 인산염 완충 식염수-항생제 항진균제(PBS-AA) 용액(1x PBS, 겐타마이신[20μg/mL] 및 암포테리신[0.5μg/mL])으로 두 개의 원뿔형 튜브를 준비하고 얼음 위에 유지합니다.</li>
	<li>건강 상태가 양호한 성인 수컷 Sprague Dawley 쥐 (R. norvegicus) 두 마리를 선택합니다. 쥐가 생후 3-4개월 사이이고 코랄 무게가 350-450g인지 확인하십시오.</li>
	<li>자일라진 염산염 20mg/kg으로 진정을 진행하고 5분 후 케타민 염산염 120mg/kg을 복강 주사하여 마취제를 투여합니다. 건조를 방지하기 위해 안과 용 연고로 양쪽 눈을 윤활하십시오. 그런 다음 페달 반사 부족을 통해 마취 깊이를 확인합니다.</li>
	<li>복부와 사타구니 부위를 요오드 용액으로 면도하고 소독하십시오. 무균 상태를 유지하기 위해 외과 용 커튼을 적용하십시오. 그런 다음 흉골에서 고환 부위까지 중앙 세로 절개를합니다.</li>
	<li>멸균 겸자로 부고환과 신장을 둘러싼 지방 조직을 제거하고 1x PBS-AA 용액에 넣습니다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>기관 지침에 따라 필요한 경우 절개 부위를 봉합하고 40mg/kg 펜토바르비탈 나트륨의 심장 내 용량으로 동물을 안락사시킵니다. 사망이 확인되면 제도적 절차에 따라 시체를 처리한다. 참고: 죽음은 중간엽 세포의 면역 표현형, 분화 능력 및 측분비 효과에 영향을 미치는 신호 전달 메커니즘을 유도합니다. 따라서 조직 수집은 안락사 전에 수행됩니다. </li>
</ol>2. 지방조직에서 중간엽 세포의 분리
<ol><li>생물 안전 캐비닛 내에서 멸균 집게로 지방 조직을 제거하고 100mm 직경의 페트리 접시에 멸균 여과지에 올려 과도한 PBS를 흡수합니다.</li>
	<li>지방 조직을 다른 페트리 접시로 옮기고 10mL 피펫을 사용하여 1x PBS-AA 용액 10mL로 각각 5분 동안 3회 세척을 수행합니다.</li>
	<li>가위와 메스를 사용하여 조직을 약 1cm2 의 조각으로 기계적으로 분해합니다.</li>
	<li>보충되지 않은 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 20mL에 콜라게나제 IV형(0.075%)을 준비합니다. 0.22μm 주사기 필터를 통해 여과하고 37°C에서 유지합니다.</li>
	<li>단계 2.4에서 제조된 콜라게나제 용액(20 mL)을 파편화된 조직과 마그네틱 바가 있는 크리스탈 비이커에 넣는다. 용기를 밀봉하고 37°C에서 서서히 연속적인 교반 하에 배양한다. 참고: 효소 분해에는 약 90분이 소요됩니다(세포막의 무결성을 유지하기 위해 천천히 저어줍니다).</li>
	<li>100mm 페트리 접시의 스테인리스 스틸, 40메쉬, 0.38mm 조리개 필터를 통해 균질액을 여과하고 멸균된 50mL 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다.</li>
	<li>따뜻하게 하고 보충된 DMEM(10% 소 태아 혈청[FBS], 2mM 글루타민, 2mM 피루브산나트륨, 100x 비필수 아미노산 용액 및 100x 항생제 항진균 용액[AA]) 20mL를 추가합니다. 기질 혈관 분획 (SVE)을 조심스럽게 중단하십시오.</li>
	<li>세포 현탁액을 290 x g 에서 10분 동안 원심분리하고, 25 mL 피펫으로 상청액을 버리고, 40 mL의 비보충 DMEM 배지로 세포를 부드럽게 세척한다.</li>
	<li>이 단계를 반복합니다. 단계 사이에 새로운 멸균 원추형 튜브를 사용하여 세포 찌꺼기와 지방을 최소한으로 끌어냅니다.</li>
	<li>펠릿을 5mL 피펫으로 보충된 DMEM 5mL에 현탁하고 T-25cm2 병으로 옮깁니다. 37°C 및 5%CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>다음 날, 5mL의 데워진 1x PBS-AA로 3회 세척하고 보충되지 않은 DMEM으로 2회 세척하여 세포 파편과 비부착성 세포를 제거합니다. 5mL 피펫으로 신선하고 따뜻하게 보충된 DMEM 5mL를 추가하고 3-4일마다 배지를 교체합니다.</li>
</ol>3. ASC 1차 문화의 유지 및 확장
<ol><li>세포가 90%-100% 합류(8± 2일)에 도달하면 보충되지 않은 DMEM 5mL로 두 번 세척합니다. 데워진 0.025% 트립신-2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 1mL를 넣고 37°C에서 5-7분 동안 배양합니다.</li>
	<li>세포 단층이 분리되면 보충된 DMEM 4mL를 추가하고 세포 현탁액을 부드럽게 분해합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 5mL의 따뜻하고 보충된 DMEM을 추가하고 부드럽게 현탁하여 균질화합니다.</li>
	<li>290 x g 에서 5분 동안 원심분리기. 상층액을 버리고 펠릿을 보충된 DMEM 1mL에 부드럽게 혼합합니다. Trypan blue로 염색한 후 Neubauer 챔버에서 세포를 계수합니다.</li>
	<li>마지막으로 T-75 플라스크에서 2.5 x 103 cells/cm 2 를 1:4의 분할 비율로 시드합니다. 이 단계는 집락 형성과 높은 증식 속도를 보장합니다.</li>
</ol>4. ASC 1차 배양의 형태학적 특성
<ol><li>도립 현미경으로 ASC의 형태를 관찰합니다. 알림: 조직학 및 ASC 식별을 위해 장착하기 전에 커버슬립을 1% 젤라틴 용액으로 처리하십시오. UV를 15분 동안 조사합니다.<ol><li>70% 에탄올 용액에서 커버슬립을 제거하고 5분 동안 건조시킵니다.</li>
		<li>커버슬립을 멸균된 1% 젤라틴 용액에 담그고 물기를 빼고 실온(RT)에서 건조합니다.</li>
		<li>각 커버슬립을 6웰 플레이트의 각 웰에 넣고 플레이트에 15분 동안 UV 광선을 조사합니다.</li>
		<li>웰 중앙에 25 x 103 세포가 들어 있는 한 방울을 시딩하고 1분 정도 기다린 후 보충된 DMEM 배지 1mL를 추가합니다. 37°C 및 5%CO2에서 96시간 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>배지를 제거하고 이송 피펫을 사용하여 1x PBS-AA로 3회 세척을 수행합니다.</li>
		<li>3.5% 중성 포르말린 1mL를 각 웰에 넣고 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 포르말린을 조심스럽게 제거하고 차가운 70% 에탄올 1mL를 각 웰에 추가합니다.</li>
		<li>건조를 방지하기 위해 사용할 때까지 파라필름으로 플레이트를 밀봉하십시오. 참고: ASC의 세포 형태는 또한 다른 계대 동안 헤마톡실린-에오신 염색에 의해 평가됩니다.</li>
		<li>각 웰로부터 70% 에탄올을 제거하고, 증류수로 5분 동안 세포를 수화시킨다. 한편, 염색 용액을 여과한다.</li>
		<li>물을 제거하고 Harris의 헤마톡실린 용액으로 15분 동안 천천히 교반하면서 세포를 염색합니다.</li>
		<li>염색 용액을 제거하고 1x PBS로 두 번 세척합니다.</li>
		<li>에오신 용액으로 세포를 1분 동안 천천히 교반하여 염색합니다. 그런 다음 용액을 제거하고 1x PBS로 두 번 세척합니다.</li>
		<li>각 웰에서 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 PBS-글리세롤 장착 용액(1:1 v/v) 한 방울에 슬라이드를 장착합니다.</li>
		<li>커버슬립 주위에 네일 바니시를 한 줄 붙이고 광학 현미경으로 조직학적 슬라이드를 관찰합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 면역형광법에 의한 ASC의 발현 마커
<ol><li>1x PBS-0.05% Tween 20을 함유하는 세척 완충액을 준비한다. RT에서 천천히 흔들어 세탁하십시오. 2mL의 완충액/웰로 플레이트를 세 번 세척합니다(세척할 때마다 3분 동안 배양).</li>
	<li>1mL의 블로킹 시약(1:10)을 넣고 20분 동안 천천히 교반하면서 배양합니다.</li>
	<li>CD9(단클론 마우스), CD34(다클론 토끼) 및 항-CD63(다클론 염소)과 같은 1차 항체 200μL(1:50 희석)를 각 웰에 추가합니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
	<li>플레이트를 다시 세 번 세척하고 다음 2차 항체의 200μL(1:50 희석)와 함께 배양합니다: 항-마우스 IgG FITC 접합 염소, 당나귀 항-염소 IgG DyeLight 550 및 염소 항-토끼 IgG Cy3.</li>
	<li>1x PBS-0.05% Tween 20으로 3회 세척하고 100μL의 DRAQ-7(희석: 이중 증류수 1mL에 17μL)로 세포핵을 20분 동안 대조염색합니다.</li>
	<li>세 번 더 씻고 4.1.12-4.1.13 단계에 따라 슬라이드를 장착합니다. 샘플을 빛으로부터 보호하고 사용할 때까지 냉동하십시오.</li>
	<li>에피형광 컨포칼 현미경 하에서 이 장비에 권장되는 적절한 설정과 소프트웨어를 사용하여 샘플을 시각화합니다.</li>
</ol>6. 유세포 분석에 의한 ASC의 발현 마커
<ol><li>트립신 처리 또는 해동된 세포(하위 계대 3 또는 4)의 단일 세포 현탁액을 1x PBS-5% FBS의 1 x 106 cells/mL 농도로 조정합니다. 1.5mL 원심분리기 튜브에 100,000개 세포와 함께 100μL를 분취합니다. 자동 형광 제어를 위해 라벨링 없이 하나의 분취량을 사용합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 적절한 양의 Anti-CD105 AF-594 및 Anti-CD31 AF-680을 모두 추가합니다. 4°C에서 20분 동안 어두운 곳에서 배양합니다.</li>
	<li>250 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 1mL의 1x PBS-5% FBS로 초과 염색을 세척하고 1% 포르말린 300μL에 현탁합니다.</li>
	<li>유세포 분석기에서 시료 수집을 수행합니다. 셀의 게이팅 전략은 FSC-A 대 SSC-A 게이팅, SSC-H 대 SSC-A를 사용하여 게이팅된 단일 셀, FSC-A 대 FSC-H를 기반으로 합니다.</li>
	<li>CD105 AF-594에는 Y610-mCherry-A 검출기를 사용하고 CD31 AF-680에는 R660-APC-A 검출기를 사용합니다.</li>
</ol>7. ASC와 지방 생성 계통의 분화
<ol><li>6-웰 플레이트에서, 시드 1 x 10 cm2 당 4 세포 (P-4) 및 60-80% 합류(~72-96 h)까지 37°C, 5%CO2에서 인큐베이션한다. 4 μM 인슐린, 1 μM 덱사메타손 21-아세테이트(Dxa) 및 0.5 mM의 3-이소부틸-1-메틸크산틴(MIX)을 배양 배지에 직접 적용하여 분화를 유도합니다. 분화 배지는 2-3일마다 교체하십시오.</li>
	<li>멸균 초순수 2mL에 800μM 인슐린 원액을 준비하고(완전한 용해를 위해 1N HCl 20μL 추가) -20°C에서 보관합니다. 이전에 1:100으로 희석한 인슐린 스톡 10μL를 추가하고 웰당 2mL의 최종 부피로 10μL를 적용합니다.</li>
	<li>멸균 초순수 5mL에 1mM Dxa의 원액을 준비합니다(완전 용해가 일어나지 않음). 4 °C에서 보관하십시오. 40 μL/well의 1:4 희석 Dxa 스톡을 추가합니다.</li>
	<li>2.5mL의 0.1N NaOH에 100mM의 MIX를 준비하고, 와동하고, 완전한 용해를 위해 40μL의 1N NaOH를 추가합니다. -70 °C에서 보관하십시오. 10 μL/well의 MIX 스톡을 추가합니다.</li>
	<li>보관하기 전에 0.22μm 멸균 주사기 필터를 통해 저장 용액을 여과합니다.</li>
	<li>12일째에, 세포를 1x PBS로 3회 세척하고, RT에서 1시간 동안 4% 포르말린 500 μL로 인큐베이션한다. 증류수로 각 웰을 2회 세척하고, 이어서 60% 이소프로판올을 5분 동안 건조시켰다.</li>
	<li>60% 이소프로판올(500μL/웰)로 희석한 0.5% 오일 레드 O를 넣고 RT에서 20분 동안 배양합니다. 증류수 1mL로 3회 세척하고 도립 현미경으로 관찰합니다. 알림: 필요한 시약, 장비 및 재료는 재료 표를 참조하십시오.</li>
</ol>

지방 조직 유래 줄기세포 분리 및 특성 분석

<ol>
	<li>Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+\anatomic+site+and+age+on+the+replication+and+differentiation+of+rat+adipocyte+precursors+in+culture.">Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).</li><li>Greenwood, M. R., Hirsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+adipocyte+cellularity+in+the+normal+rat.">Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat.</a> Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).</li><li>Gonz&#225;lez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , (2014).</li><li>Oedayrajsingh-Varma, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+insulin+sensitivity+and+reversal+of+age-dependent+glucose+intolerance+with+inhibition+of+ASIC3.">Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).</li><li>Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue-derived+stem+cells+for+cell+therapy+of+airway+allergic+diseases+in+mouse.">Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse.</a> Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).</li><li>Haasters, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+immunocytochemical+characteristics+indicate+the+yield+of+early+progenitors+and+represent+a+quality+control+for+human+mesenchymal+stem+cell+culturing.">Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing.</a> Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+pig+adipose-derived+progenitor+cells.">Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells.</a> Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).</li><li>Varma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypical+and+functional+characterization+of+freshly+isolated+adipose+tissue-derived+stem+cells.">Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells.</a> Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolation,+characterization+and+expansion+of+human+adipose-derived+stem+cells+(ASCs):+An+overview.">Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).</li><li>Yu, B., Zhang, X., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+mesenchymal+stem+cells.">Exosomes derived from mesenchymal stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).</li><li>Maumus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+human+adipose+stromal+cells:+localization,+morphology,+and+phenotype.">Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype.</a> International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).</li><li>Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+primary+isolation+and+culture+of+adipose-derived+stem+cells+and+their+phenotypic+profile.">A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile.</a> Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).</li><li>He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+mesenchymal+stem+cells+from+rat+bone+marrow+and+adipose+tissue.">Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue.</a> Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).</li></ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

중간엽 줄기세포가 발견된 이후 지난 40년 동안 여러 그룹의 연구자들이 다양한 조직과 종에서 중간엽 줄기세포를 얻는 절차를 설명했습니다. 쥐를 동물 모델로 사용하는 장점 중 하나는 유지 관리가 쉽고 발달이 빠르며 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포를 쉽게 얻을 수 있다는 것입니다. ASC를 얻기 위한 상이한 조직 공급원, 예컨대 내장, 주위지방, 부고환 및 피하 지방 12,13,14,15,16이 기재되어 있다...

중간엽 줄기세포(MSC)는 자가 재생, 증식, 이동 및 다른 세포 계통으로의 분화 능력이 높기 때문에 재생 의학에 큰 영향을 미쳤습니다 1,2. 현재 많은 연구가 다양한 질병의 치료 및 진단 가능성에 초점을 맞추고 있습니다.
중간엽 세포의 출처는 골수, 골격근, 양수, 모낭, 태반, 지방 조직 등 다양합니다. 그들은 인간, 생쥐, 쥐, 개, 말3을 포함한 다양한 종에서 얻습니다. 골수 유래 중간엽 줄기세포(BMSC)는 재생 의학에서 줄기세포의 주요 공급원이자 배아 줄기 세포 사용의 대안으로 수년 동안 사용되어 왔다4. 그러나 지방 유래 중간엽 줄기 세포 또는 지방 유래 줄기 세포 (ASC)는 수집 및 분리가 용이하고 지방 조직 5,6 그램 당 얻은 세포의 수율로 인해 큰 이점을 가진 중요한 대안입니다. ASCs의 수확량은 일반적으로 BMSCs의 수확량보다 높다고 보고되었다7. 처음에는 ASC의 회복/재생 능력이 다른 세포 계통으로 분화할 수 있는 능력 때문이라고 제안되었다8. 그러나 최근 몇 년 동안의 연구는 ASC가 회복 잠재력에서 방출하는 측분비 인자의 주요 역할을 강화했습니다 9,10.
지방 조직(AT)은 에너지를 비축할 뿐만 아니라 내분비계, 신경계 및 심혈관계와 상호 작용합니다. 또한 출생 후 성장 및 발달, 조직 항상성 유지, 조직 복구 및 재생에 관여합니다. AT는 지방세포, 혈관 평활근 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 단핵구, 대식세포, 림프구, 지방전구세포 및 ASC로 구성됩니다. 후자는 면역 원성이 낮기 때문에 재생 의학에서 중요한 역할을합니다11,12. ASC는 효소 분해 및 기계적 처리 또는 지방 조직 외식편에 의해 얻을 수 있습니다. ASC의 기본 문화는 유지 관리, 성장 및 확장이 쉽습니다. ASC의 표현형 특성 분석은 면역형광 및 유세포 분석과 같은 방법을 사용하여 특정 막 마커의 발현을 평가함으로써 세포의 정체성을 검증하는 데 필수적이다13. IFATS(International Federation for Adipose Therapeutics and Science)와 ISCT(International Society for Cellular Therapy)는 ASC가 CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 반면 CD11b, CD14, CD19, CD45 및 HLA-DR14의 발현은 부족하다고 정의했습니다. 따라서 양성 및 음성 모두 이러한 마커는 ASC의 특성화에 신뢰할 수 있는 것으로 간주됩니다.
이 프로젝트는 쥐의 AT에서 추출한 성체 중간엽 세포의 분리 및 식별 절차를 설명하는 데 중점을 두었는데, 이 세포 공급원은 배아 줄기 세포와 달리 윤리적 문제를 나타내지 않기 때문입니다. 이것은 골수 유래 줄기 세포에 비해 접근이 용이하고 최소 침습적 방법으로 인해 실행 가능한 옵션으로 절차를 굳건히 합니다. 
이 조직 공급원의 중간엽 세포는 면역 조절 능력과 낮은 면역 거부 반응으로 인해 재생 의학에서 중요한 역할을 합니다. 따라서 본 연구는 그들의 세크레톰과 당뇨병과 같은 대사 질환을 포함한 다양한 질병에서 재생 요법으로서의 적용에 대한 향후 연구의 근본적인 부분입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30078.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>AX224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti- CD9 (C-4)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-13118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-CD34 (C-18)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-7045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-C63</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-5275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 </td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-18838A594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-18916AF680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 </td>
			<td>Novus</td>
			<td>NB 120-6939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA5-10087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab&#180;)</td>
			<td>RD Systems.</td>
			<td>No. F103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Filter Sterile</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>10718003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell and Tissue Culture Flasks</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>170718-312B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides</td>
			<td>SIGMA Aldrich </td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell wells: 6 well with Lid</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge conical tubes</td>
			<td>HeTTICH</td>
			<td>ROTANA460R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge eppendorf tubes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>M0018242_44797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV </td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>SPL Life Science</td>
			<td>43112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One </td>
			<td>191180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytExpert 2.0</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Free version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFlex LX cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>FLOW-2463VID03.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td> 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DraQ7 Dye</td>
			<td>Thermo Sc. </td>
			<td>D15106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin yellowish</td>
			<td>Hycel</td>
			<td>300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Baker</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One </td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One </td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum </td>
			<td>CORNING</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>128111163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15750045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin-High Purity</td>
			<td>Herschi Trading </td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>AMRESCO </td>
			<td>0701-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i CO2 Incubator </td>
			<td>Thermo Sc.</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)</td>
			<td>Aranda</td>
			<td>SV057430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine </td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc. </td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM software Zen 2009 V5.5</td>
			<td></td>
			<td>Free version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>12082100801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent microscope </td>
			<td>Zeiss Axiovert 100M</td>
			<td>21.0028.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Olympus CK40</td>
			<td>CK40-G100 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids 100X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 2 mL </td>
			<td>Sarstedt </td>
			<td>72695400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 1,5 mL</td>
			<td>Sarstedt </td>
			<td>72706400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 0.2-2 &#956;L</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>E97743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 2-20 &#956;L</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>F54167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 20-200 &#956;L</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>G32419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 100-1000 &#956;L</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>FJ39895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen tank liquid</td>
			<td>Taylor-Wharton</td>
			<td>681-021-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>SLBC3029V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin </td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc. </td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish Cell culture</td>
			<td>CORNING Inc</td>
			<td>480167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-03-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pisabental (pentobarbital sodium)</td>
			<td>PISA Agropecuaria</td>
			<td>Q-7833-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride </td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>2139900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 Pipette Fillers</td>
			<td>Thermo Sc</td>
			<td>9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>L010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>L010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride </td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>15368426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td>11840-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Sterile</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>431222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>PerkinElmer Lambda 25</td>
			<td>L6020060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titer plate shaker</td>
			<td>LAB-LINE</td>
			<td>1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipets</td>
			<td>Samco/Thermo Sc</td>
			<td>728NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>1198566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin From Porcine Pancreas</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>102H0234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Blocking Reagent 10x</td>
			<td>BioGenex</td>
			<td>HK085-GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)</td>
			<td>Pet&#39;s Pharma</td>
			<td>Q-7972-025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue of sprague dawley rats

성인 중간엽 세포는 최근 수십 년 동안 분자 및 세포 생물학에 혁명을 일으켰습니다. 그들은 자가 재생, 이동 및 증식을 위한 큰 능력 외에도 다양한 특수 세포 유형으로 분화할 수 있습니다. 지방 조직은 중간엽 세포의 가장 침습적이지 않고 가장 접근하기 쉬운 공급원 중 하나입니다. 또한 다른 공급원에 비해 수율이 높고 면역 조절 특성이 우수한 것으로 보고되었습니다. 최근에, 상이한 조직 공급원 및 동물 종으로부터 성체 중간엽 세포를 얻기 위한 상이한 절차가 발표되었다. 일부 저자의 기준을 평가한 후 다양한 목적에 적용할 수 있고 쉽게 재현할 수 있는 방법론을 표준화했습니다. 신장 주위 및 부고환 지방 조직의 기질 혈관 분획(SVF) 풀을 통해 최적의 형태와 기능을 갖춘 1차 배양을 개발할 수 있었습니다. 세포는 24시간 동안 플라스틱 표면에 부착된 것으로 관찰되었으며, 연장 및 콜로니 형성 경향과 함께 섬유아세포와 유사한 형태를 나타냈습니다. 유세포 분석 (FC) 및 면역 형광 (IF) 기술을 사용하여 막 마커 CD105, CD9, CD63, CD31 및 CD34의 발현을 평가했습니다. 지방 유래 줄기 세포(ASC)가 지방 유래 계통으로 분화하는 능력은 또한 인자 칵테일(4μM 인슐린, 0.5mM 3-메틸-이소-부틸-크산틴 및 1μM 덱사메타손)을 사용하여 평가되었습니다. 48시간 후, 섬유아세포양 형태의 점진적인 손실이 관찰되었고, 12일째에 오일 레드 염색에 양성인 지질 방울의 존재가 확인되었습니다. 요약하면, 재생 의학에 적용하기 위한 최적의 기능적 ASC 배양을 얻기 위한 절차가 제안됩니다.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have strongly impacted regenerative medicine due to their high capacity for self-renewal, proliferation, migration, and differentiation into different cell lineages1,2. Currently, a great deal of research is focusing on their potential for the treatment and diagnosis of various diseases.
There are different sources of mesenchymal cells: bone marrow, skeletal muscle, amniotic fluid, hair follicles, placenta, and adipose tissue, among others. They are obtained from different species, including humans, mice, rats, dogs, and horses3. Bone marrow-derived MSCs (BMSCs) have been used for many years as a major source of stem cells in regenerative medicine and as an alternative to the use of embryonic stem cells4. However, adipose-derived MSCs, or adipose-derived stem cells (ASCs), are an important alternative with great advantages due to their ease of collection and isolation, as well as the yield of cells obtained per gram of adipose tissue5,6. It has been reported that the harvest rate of ASCs is generally higher than that of BMSCs7. It was initially proposed that the reparative/regenerative capacity of ASCs was due to their ability to differentiate into other cell lineages8. However, research in recent years has reinforced the primary role of paracrine factors released by ASCs in their reparative potential9,10.
Adipose tissue (AT), in addition to being an energy reserve, interacts with the endocrine, nervous, and cardiovascular systems. It is also involved in postnatal growth and development, the maintenance of tissue homeostasis, tissue repair, and regeneration. The AT is composed of adipocytes, vascular smooth muscle cells, endothelial cells, fibroblasts, monocytes, macrophages, lymphocytes, preadipocytes, and ASCs. The latter possess an important role in regenerative medicine due to their low immunogenicity11,12. ASCs can be obtained by enzymatic digestion and mechanical processing or by adipose tissue explants. Primary cultures of ASCs are easy to maintain, grow, and expand. Phenotypic characterization of ASCs is essential to verify the identity of the cells by assessing the expression of specific membrane markers using methods such as immunofluorescence and flow cytometry13. The International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT) have defined that ASCs express CD73, CD90, and CD105, while lacking the expression of CD11b, CD14, CD19, CD45, and HLA-DR14. These markers, both positive and negative, are therefore considered reliable for the characterization of ASCs.
This project was focused on describing a procedure for the isolation and identification of adult mesenchymal cells extracted from rats' AT, as this source of cells does not present ethical challenges, unlike embryonic stem cells. This solidifies the procedure as a viable option because of the ease of access and minimally invasive method compared to bone marrow-derived stem cells. 
Mesenchymal cells from this tissue source have an important role in regenerative medicine because of their immunomodulatory capabilities and low immune rejection. Therefore, the present study is a fundamental part of future research into their secretome and their application as regenerative therapy in different diseases, including metabolic diseases such as diabetes.

저자 스포트라이트: Sprague Dawley Rats의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별  

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

Mesenchymal stem cells have a really broad role in cellular communication due to their paracrine function. This protocol obtains adipose-derived mesenchymal stem cells with morphological, immunophenotypical, and adequate functionality for use in studying therapies for pancreatic regeneration and diabetes. There has been increased use of cell therapies in the treatment of diabetes.These therapies include allogenic transplants of pancreatic cells, autologous stem cell-derived products of insulin-producing cells, and 3D-printed pancreatic tissue using biological inks. Most research primarily studied the secretome components and the role in the regulation of different cellular processes. New techniques like microarrays and next-generation sequencing can investigate the function of miRNAs.A challenge in this area is to achieve greater stimulation of mesenchymal cells, reaching precise molecular composition in the secretome, and directing it to the treatment of a specific conditions. We will be evaluating how an miRNAs contribute to pancreatic tissue degeneration exposed to oxidative stress. The study will involve usage of stem cells from adipose tissue.

지방 조직은 생후 3-4개월의 성인 Sprague Dawley 쥐에서 얻었으며 체중은 401g± 41g(기하 평균 ± SD)입니다. 부고환 및 신장 주위 지방 조직의 평균값 3.8 g은 15 개의 실험 추출 분석에 해당한다. 배양 24시간 후, 세포 집단은 플라스틱 표면에 부착된 상태를 유지하고 이질적인 형태를 나타냈습니다. 첫 번째 계대배양은 8 ± 2일째에 실현되었으며, 총 8번의 실험에서 0.6 x 106 세포± 1.4 수율로 실현되?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats at JoVE.com

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

중간엽 줄기 세포는 측분비 기능으로 인해 세포 통신에서 매우 광범위한 역할을 합니다. 이 프로토콜은 췌장 재생 및 당뇨병 치료법 연구에 사용하기 위한 형태학적, 면역표현형 및 적절한 기능을 가진 지방 유래 중간엽 줄기 세포를 얻습니다. 당뇨병 치료에서 세포 요법의 사용이 증가했습니다.이러한 치료법에는 췌장 세포의 동종 이식, 인슐린 생산 세포의 자가 줄기 세포 유래 제품, 생물학적 잉크를 사용한 3D 프린팅 췌장 조직이 포함됩니다. 대부분의 연구는 주로 세크레톰 성분과 다양한 세포 과정의 조절에 대한 역할을 연구했습니다. 마이크로어레이 및 차세대 시퀀싱과 같은 새로운 기술은 miRNA의 기능을 조사할 수 있습니다.이 분야의 과제는 중간엽 세포를 더 많이 자극하여 세크레톰의 정확한 분자 구성에 도달하고 특정 조건의 치료로 유도하는 것입니다. 우리는 miRNA가 산화 스트레스에 노출된 췌장 조직 변성에 어떻게 기여하는지 평가할 것입니다. 이 연구에는 지방 조직의 줄기 세포 사용이 포함됩니다.

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

1.9K 조회수.  Universidad Autónoma Metropolitana. 중간엽 줄기 세포는 측분비 기능으로 인해 세포 통신에서 매우 광범위한 역할을 합니다. 이 프로토콜은 췌장 재생 및 당뇨병 치료법 연구에 사용하기 위한 형태학적, 면역표현형 및 적절한 기능을 가진 지방 유래 중간엽 줄기 세포를 얻습니다. 당뇨병 치료에서 세포 요법의 사용이 증가했습니다.이러한 치료법에는 췌장 세포의 동종 이식, 인슐린 생산 세포의 자가 줄기 ...

비디오: 저자 스포트라이트: Sprague Dawley Rats의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별  

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in addition to their great capacity for self-renewal, migration, and proliferation. Adipose tissue is one of the least invasive and most accessible sources of mesenchymal cells. It has also been reported to have higher yields compared to other sources, as well as superior immunomodulatory properties. Recently, different procedures for obtaining adult mesenchymal cells from different tissue sources and animal species have been published. After evaluating the criteria of some authors, we standardized a methodology that is applicable to different purposes and easily reproducible. A pool of stromal vascular fraction (SVF) from perirenal and epididymal adipose tissue allowed us to develop primary cultures with optimal morphology and functionality. The cells were observed adhered to the plastic surface for 24 h, and exhibited a fibroblast-like morphology, with prolongations and a tendency to form colonies. Flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF) techniques were used to assess the expression of the membrane markers CD105, CD9, CD63, CD31, and CD34. The ability of adipose-derived stem cells (ASCs) to differentiate into the adipogenic lineage was also assessed using a cocktail of factors (4 &#181;M insulin, 0.5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine, and 1 &#181;M dexamethasone). After 48 h, a gradual loss of fibroblastoid morphology was observed, and at 12 days, the presence of lipid droplets positive to oil red staining was confirmed. In summary, a procedure is proposed to obtain optimal and functional ASC cultures for application in regenerative medicine.

This protocol describes a methodology for isolating and identifying adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) from Sprague Dawley rats.

연구

생물학

Murine Adipose Tissue Excision

Shave the abdominal and inguinal regions of two sedated adult male Sprague Dawley rats. Disinfect the shaved regions with an iodine solution. Make a medial longitudinal incision from the sternum to the testicular region, Using a pair of sterile forceps, remove the adipose tissue from the epididymidis and the kidneys.Place the tissue in conical tubes containing 20 milliliters of cold, sterile PBS-AA solution.

쥐 지방 조직 절제

Murine Adipose-Derived Mesenchymal Cell Isolation, Maintenance and Characterization

Inside a biosafety cabinet, remove the murine adipose tissue with sterile forceps. Once excess PBS is removed, transfer the tissue to another petri dish and wash twice for five minutes each with 10 milliliters of PBS AA solution. Add 20 milliliters of prepared collagenase solution into a crystal beaker containing one square centimeter sized fragmented tissue and a magnetic bar.Incubate the sealed beaker at 37 degrees Celsius with continuous agitation. Filter the homogenate through a 40-mesh 0.38-millimeter stainless steel aperture Filter on a petri dish and collect the cell suspension in a sterile 50-milliliter conical tube. Carefully suspend the stromal vascular fraction in 20 milliliters of warm supplemented DMEM and centrifuge the suspension.After discarding the supernatant, gently wash the cells twice with 40 milliliters of non-supplemented DMEM medium. Suspend the palate in five milliliters of supplemented DMEM. Transfer the suspension to a 25-square centimeter T bottle and incubate.Wash cells three times with five milliliters of warm PBS AA and twice with non-supplemented DMEM. To remove any cell debris and non-murine cells add five milliliters of fresh, warm supplemented DMEM and change the medium every three to four days. Once the cells reach 90 to 100%confluency, add one milliliter of warm trypsin EDTA solution to the DMEM washed cells.Incubate for five to seven minutes at 37 degrees Celsius. Add four milliliters of supplemented DMEM to the detached cell monolayer and gently disaggregate the suspension. Suspend the cells in five milliliters of warm supplemented DMEM.After centrifuging and discarding the supernatant, gently mix the pellet in one milliliter of supplemented DMEM. Stain the cells with trypan blue and count them in a Neubauer chamber. Seed cells in T-75 flasks.To ensure colony formation and high proliferation, observe the morphology of the hematoxylin and eosin-stained cells under an optical microscope. hematoxylin and eosin staining reveal extensive cytoplasm with elongated prolongations and abundant intracellular microfilaments.

쥐 지방 유래 중간엽 세포 분리, 유지 및 특성 분석

Immunofluorescent Detection of Adipose-Derived Stem Cell Expression Markers

Begin by washing murine adipose-derived stem cells in a six-well plate with two milliliters of wash buffer. Add one milliliter of blocking reagent after incubating and washing the cells thrice. Incubate the cells with slow agitation for 20 minutes.Add 200 microliters of the primary antibodies to each well and incubate overnight at four degrees Celsius. After washing the plates thrice as demonstrated previously, incubate with 200 microliters of the secondary antibodies. Counterstain the cell nuclei with 100 microliters of DRAQ7 for 20 minutes after washing the plates thrice.Repeat washing and mount slides. Visualize the mounted slides under epifluorescence confocal microscopy. Adipose-derived stem cells were 100%positive for CD9 surface markers in all subpassages tested.All cells expressed CD63 markers in the subpassages one, three and nine, while 49.3%of the cells expressed it in passage seven. CD34 markers were absent in passages one, seven, and nine, but visible in passage three.

지방유래 줄기세포 발현 마커의 면역형광 검출

Flow Cytometric Detection of Adipose-Derived Stem Cell Expression Markers

Begin by adjusting the concentration of thawed murine adipose-derived stem cell suspension using PBS with 5%fetal bovine serum. Aliquot 100 microliters of the suspension containing 100, 000 cells into a 1.5 milliliter centrifuge tube. Add appropriate amounts of anti-CD105 AF594 and anti-CD31 AF680 as per the manufacturer's instructions.Incubate for 20 minutes in the dark at four degrees Celsius. Remove excess stain by washing with PBS/FBS and centrifuge at 250 x g for five minutes. Resuspend the cells in 300 microliters of 1%formalin.Create a dot plot graph by clicking on the polygon symbol to select the subpopulation of interest and exclude the debris areas using FSC-A versus SSC-A gating. Next, click on the polygon symbol to generate a new dot plot and exclude the duplexes and multiples cells using SSC-H versus SSC-A followed by FSC-H and FSC-A. Use Y610-mCHERRY for the AF594 and the R660 APC-A detectors for the AF680 fluorophores, respectively.Click on the quadrant symbol and set each detector's threshold for autofluorescence cells. Select samples labeled with CD105 and positive population to be shown on Q1LR. Next, choose samples labeled with CD31 and positive population to be shown on Q1LR.Immunophenotyping showed that 98.7%of the cell population was positive for CD105, while only 5.88%expressed the CD31 marker.

지방유래 줄기세포 발현 마커의 유세포 검출

Adipose-Derived Stem Cell Differentiation to the Adipogenic Lineage

Begin by seeding a six well plate with 10, 000 adipose-derived stem cells per square centimeter. Once cells become 60 to 80%confluent add the differentiation medium. On day 12, wash the cells trice with PBS and incubate them with 500 microliters of 4%formalin for one hour at room temperature.Once the cells are washed with distilled water, wash them with 60%isopropanol for five minutes and let them dry. Add 500 microliters of 0.5%oil red O staining dye diluted in 60%alcohol. After incubation at room temperature wash the wells twice with one milliliter of distilled water and observe the plate under an inverted microscope.Adipose-derived stem cells differentiated towards the adipogenic lineage showing reduced cell size and rounded shape within 48 hours. After seven days, lipid vesicles were visible, which were positive for oil red staining 12 days after differentiation.