현장 Cryosectioned Zebrafish 배아에서 면역조직화학과 결합된 혼성화

이 프로토콜은 in situ hybridization과 면역조직화학의 조합을 사용하며, 하나의 mRNA와 하나의 단백질을 동시에 분석하는 쉽고 효율적인 방법으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 다른 단계의 배아, 다양한 두께의 조직 절편 및 다른 장기에 적용할 수 있습니다. 시작하려면 섭씨 4도에서 12-14 시간 동안 밤새 섭씨 4 밀리리터의 미세 분리기 튜브에 0.5-1 밀리리터의 신선한 4 % 파라 포름 알데히드로 약 10 개의 배아를 고정시킵니다.

실온에서 각각 5분 동안 PBST에서 25, 50 및 75% 메탄올로 연속적으로 세척하여 배아를 점진적으로 탈수합니다. 그런 다음 배아를 실온에서 5분 동안 100% 메탄올로 세척합니다. 섭씨 영하 20도에서 100% 메탄올로 배아를 적어도 하룻밤 동안, 12-14시간 동안 배양합니다.

실온에서 각각 5분 동안 PBST에서 75, 50 및 25% 메탄올로 연속적으로 세척하여 배아를 점진적으로 재수화합니다. 다시, 배아를 실온에서 각각 5분 동안 PBST로 3회 세척한다. 실온에서 PBST에서 밀리리터당 10마이크로그램의 프로테이나제 K로 배아를 소화하고 5분 동안 PBST로 배아를 세 번 세척합니다.

그런 다음 세척된 배아를 실온에서 4% 파라포름알데히드에 15분 동안 다시 고정합니다. 다시, 배아를 PBST로 세 번 세척하면서 각 세척 동안 5분 동안 배양합니다. 배아를 사전 혼성화하기 위해, 섭씨 65도의 사전 혼성화 용액에서 5분 동안 배양한다.

이어서, 예비-하이브리드화 용액을 하이브리드화 용액으로 교체하고, 적어도 4시간 동안 프리하이브리드화한다. 배아에 추가하기 전에 섭씨 95도에서 5분 동안 하이브리드화 용액에서 프로브를 가열합니다. 배아가 공기와 접촉하지 않도록 가능한 한 많은 사전 혼성화 용액을 제거하십시오.

배아가 들어 있는 튜브에 예열된 프로브를 하이브리드화 용액에 넣고 프로브가 섭씨 50도에서 14-12시간 동안 하룻밤 동안 하이브리드화되도록 합니다. 다음날 피펫으로 프로브 용액을 흡인하고 섭씨 영하 20도의 튜브에 보관하여 여러 번 재사용할 수 있도록 합니다. 배아를 100% 하이브리디제이션 용액으로 세척한 후 섭씨 65도에서 15분 동안 SSCT의 2배 농도로 75, 50, 25% 하이브리디제이션 용액으로 순차적으로 세척합니다.

그 후, 섭씨 65도에서 15분 동안 SSCT 농도의 0.2배로 배아를 2회 세척한다. 실온에서 MABT에서 10 분 동안 배아를 두 번 씻으십시오. 하이브리드화되고 세척된 배아를 실온에서 최소 2시간 동안 차단하고 2% 차단 용액-1로 차단합니다.

새로운 2% 차단 용액-1에서 차단 용액-1을 antidigoxigenin 알칼리성 포스파타제로 교체하고 섭씨 4도에서 12-14시간 동안 밤새 흔들어줍니다. 그런 다음 실온에서 30분 동안 MABT에서 배아를 4회 세척합니다. 다시 말하지만, NTMT에서 배아를 두 번 씻고 피펫을 사용하여 배아에서 가능한 한 많은 NTMT를 제거합니다.

BM 보라색 알칼리성 포스파타제 기질로 교체하고 어둠 속에서 실온에서 배아를 염색합니다. 얼룩이 생기면 NTMT로 짧게 두 번 헹구어 반응을 멈춥니다. in situ 하이브리드화 후, 배아를 PBST로 20분 동안 세 번 헹굽니다.

섭씨 4도에서 12-14시간 동안 PBS의 5% 자당에 배아를 담그십시오. 그런 다음 배아를 덮는 용액을 PBS에서 15 % 자당으로 바꾸고 섭씨 4도에서 12-16 시간 동안 밤새 배양합니다. 다시 말하지만, 배아를 덮는 용액을 PBS에서 30 % 자당으로 바꾸고 섭씨 4도에서 1-2 일 동안 배양하십시오.

배아를 조직을 위한 새로운 cryomold로 옮기고 기포 형성을 피하면서 최적의 절단 온도 매체로 부드럽게 채웁니다. 다음으로, 저온 유지 장치를 사용하여 시편을 12-20 마이크로 미터 두께의 섹션으로 자르고 섹션을 유리 슬라이드로 신속하게 옮깁니다. 샘플이 실온에 도달하도록 하고 후속 사용을 위해 섭씨 영하 80도의 밀봉된 슬라이드 상자에 섹션을 보관합니다.

절편을 포함하는 슬라이드를 PBS로 5분 동안 세척한다. 그런 다음 슬라이드를 버퍼에 넣고 용액을 약 20분 동안 가열하여 끓는 온도 근처를 유지합니다. 여분의 용액을 배출하고 티슈 조각으로 각 섹션 주변을 조심스럽게 건조시킵니다.

그런 다음 발수성 펜으로 섹션 주위에 원을 그려 소수성 장벽을 형성하고 실온에서 차단 용액-2에서 2시간 동안 섹션을 차단합니다. 슬라이드 당 1차 항체 용액을 피펫팅하고 밤새 섭씨 4도의 면역조직화학 습윤 상자에서 슬라이드를 배양합니다. 슬라이드를 PBS로 3회 세척하면서 각 세척 동안 10분 동안 인큐베이션하고, 과량의 PBS를 배출한다.

이어서, 적절한 2차 항체와 함께 슬라이드를 PBS에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 다시, 슬라이드를 PBS로 3회 세척하면서 각 세척 동안 10분 동안 인큐베이션하고, 과량의 PBS를 배출한다. 그런 다음 장착 매체를 슬라이드에 피펫팅하고 슬라이드 커버슬립으로 장착합니다.

중추 신경계에서 5-HT2C 수용체의 발현은 형질전환 foxP2 egfp-caax 라인에서 검출되었습니다. 5-HT2C의 동시 발현은 fluorescein green fluorescent protein에 의해 표지 된 foxP2 뉴런과 함께 형질 전환 라인에서 관찰되었다. 제브라피쉬 척수와 운동 뉴런의 징크-핑거 전사 인자인 insm1a의 발현이 형질전환 계통에서 검출되었습니다.

insm1a의 동시 발현은 플루오레세인 녹색 형광 단백질에 의해 표지된 hb9 뉴런과 함께 형질전환 라인에서 관찰되었습니다. Zebrafish는 갓 준비한 파라포름알데히드로 고정해야 합니다.