이 작품 경력 재통합 부여 제도 (젊은 연구원을 위한 RLM 프로그램)를 통해 대학과 연구 (MIUR)의 이탈리아 정부에 의해 지원 되었습니다 학교 어쩔 레에서. 미네소타의 대학, 미국에서 교수 마이클 리는 Prp 인간 A53T αS Tg 마우스는 집계는 격리를 제공 하는 감사 합니다.

WT 및 Tg 동물의 사용 승인 되었고 전체 국가 의해에 실험 동물 복지 및 실험 (EEC 위원회 지시 86/609, 1987 년 12 월 월 12 일 및 지침 2010/63/EU, 22 9 월 2010)에 대 한 국제 법률 준수. 이 문서에 설명 된 모든 프로토콜의 우리의 기관 동물 관리 지침을 따르십시오.
1. 격리 병 A53T αS Tg 마우스에서 Microsomes 관련 된 αS의
<ol><li>250 m m 자당, 20 mM HEPES, 10mm KCl, 1.5 m m MgCl2, 2 mM EDTA, 그리고 1 x 인산 가수분해 효소/효소-억제제의 구성 되는 균질 버퍼를 준비 합니다. 얼음에 버퍼를 유지 합니다.</li>
	<li>균질 신선한 또는 테 플 론을 사용 하 여 차가운 균질 버퍼 (w/v) 양의 유 봉 균질 화기, 10 15의 치기와는 1시 10분에서 조직을 냉동.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브 및 냉장된 원심 분리기를 사용 하 여 결과 펠 릿 (P1)에 핵 및 손상 되지 않은 세포를 제거 하는 4 ° C에서 10 분 1000 × g에서 원심 분리기를 초기 homogenate (1-2 mL)를 전송 합니다. P1 삭제 합니다.</li>
	<li>깨끗 한 microcentrifuge 튜브를 상쾌한 (S1)를 전송 및 S1 냉장된 원심 분리기를 사용 하 여 두 번째 상쾌한 (S10)과 펠 릿 (P10) 4 ° C에서 20 분 동안 10000 × g에서 원심. 참고: P10 원유 막 펠 릿 미토 콘 드리 아 및 synaptosomes를 포함 하는. P10 삭제 합니다.</li>
	<li>폴 리 탄산염 병에 상쾌한 (S10)를 전송 (> 1 mL) 및 S10는 ultracentrifuge와 고정된 각도 터를 사용 하 여 4 ° C에서 1 시간에 대 한 100000 × g에서 원심 (90 Ti). 참고:는 상쾌한 순수 cytosol 분수는 펠 릿, P100, αS microsomes 관련 된 집계를 포함 하는 동안.</li>
	<li>균질 버퍼의 500 µ L로 P100 펠 릿 resuspend 깨끗 한 microcentrifuge 튜브 및 냉장된 원심 분리기에 4 ° C에서 20 분 동안 10000 × g에서 원심 분리기 P100 전송.</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 P100 균질 버퍼의 100 µ L 함께 resuspend. 참고:이 분수는 αS microsomes 관련 된 집계.</li>
	<li>2에 대 한 샘플을 sonicate 얼음 [설정된 출력 전력 1 와트 (RMS)]에 대 한 s. -80 ° c.에 샘플 저장</li>
	<li>다음날, BCA 분석을 사용 하 여 단백질 양을 확인 합니다.</li>
</ol>2. 서쪽 오 점
참고: αS microsomes 관련 된 집계의 생 화 확 적인 특성은 서쪽 오 점 하 여 평가 됩니다.
<ol><li>수직 전기 기구에 그라데이션 4-20% 트리 스-글리신 polyacrylamide 젤을 캐스팅.</li>
	<li>Microsomes 관련 αS 분수, 변성 샘플 버퍼에 녹아의 1 µ g를 로드 합니다.</li>
	<li>다른 우물에서 5 µ L의 단백질 표준 마커를 로드 합니다.</li>
	<li>100 V는 트리 스/글리신/SDS 단백질 마커 젤의 끝에 도달할 때까지 버퍼를 실행에 젤을 실행 합니다.</li>
	<li>기본적인 탄산 버퍼를 사용 하 여 니트로 막 단백질을 전송 (10 m m NaCO3, 3 m m NaHCO3, 20% 메탄올) O/N 4 ° C에서, 200 mA, 상수.</li>
	<li>차단 막 PBS 비와 실시간에서 30 분 동안 궤도 통에 5% 비 지방 건조 우유와 계면 활성 제 0.05% (PBS-T)</li>
	<li>간단히, PBS-t.로 막 씻어</li>
	<li>Syn-1 (1:5, 000) 또는 pSer129 αS 항 체 (1:5, 000) PBS-T, O/N 궤도 통에 4 ° C에서에 2.5% 비 지방 건조 우유에 막 품 어.</li>
	<li>10 분 막 궤도 셰이 커에 PBS-T와 RT에 씻는 다.</li>
	<li>반대로 마우스 또는 반대로 토끼 HRP 활용 된 이차 항 체 (1:3, 000) 2.5% 비 지방 건조 우유 PBS-T에서 1 h 실시간에 대 한에 막 품 어</li>
	<li>10 분 막 궤도 셰이 커에 PBS-T와 RT에 씻는 다. 3 배를 반복 합니다.</li>
	<li>일반 화학 키트를 통해 신호를 얻을.</li>
</ol>3. 기본 신경 문화
참고: 기본 신경 문화 WT 신생아 (P0) 마우스 해 마 나 피 (C57BL/6 호선)에서 준비 되었다. 원심 분리 단계 마이너스 전체 절차 후드를 셀 문화, 메 마른 조건에서 수행 됩니다.
<ol><li>실시간에서 적어도 12 h 65% 질 산 솔루션으로 coverslips (18 밀리미터 Ø) 치료</li>
	<li>질소 산을 제거 합니다. Coverslips 두 번 PBS 10 배와 함께 여러 번 증류수 린스.</li>
	<li>24 잘 요리에 coverslips를 삽입 하 고 폴 리-D-리와 코트 (멸 균 증류수 또는 PBS 1 0.1 mg/mL x) 37 ° c.에 1 시간에 대 한</li>
	<li>폴 리-D-라이 신을 제거 하 고 증류수로 세 번 coverslips 세척. 필요할 때까지 4 ° C에서 그들을 저장 합니다.</li>
	<li>잘린 여 마우스 강아지를 안락사 하 고 시체에서 머리를 분리. 요리에 머리를 놓고 부드럽게 피부를 해 부 합니다.</li>
	<li>좋은 위를 사용 하 여 두뇌의 기지에서 절 개 하 여 두개골을 엽니다. 두개골의 두 반쪽을 분리 하 고 신중 하 게 그들을 제거 합니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 기초에서 두뇌를 꼬집어 하 고 피 질과 해 마를 분리 합니다. 1% 페니실린/스를 포함 하는 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 매체를 포함 하는 두 개의 별도 요리에 그들을 전송.</li>
	<li>각 동물에 대 한 3.6-3.7 단계를 반복 합니다. 전체 과정은 30-45 분 이상 걸리지 않을 다는 것을 유의 하십시오.</li>
	<li>수집 된 조직 말하다 고 HBSS 매체 포함 된 트립 신 0.1%의 10 mL와 함께 두 50 mL 원뿔 튜브 (해 마)와 피 질에 대 한 하나에 그들을 전송. 37 ° c.에 7 분 물 목욕에서 품 어 참고: 아무 동요는 필요 합니다.</li>
	<li>차단 trypsin 활동 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)과 10 µ g/mL DNase는 homogenate에 포함 된 DMEM의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>원심 분리기에 RT에 5 분 동안 200 × g에서 결과 천연된 조직 하 고는 상쾌한을 제거 합니다. 참고: 펠 릿 조직에서 해 부 셀을 나타냅니다.</li>
	<li>2 %B27, 2mm 글루타민, 포도 당 6 mg/mL, 10%를 포함 하는 도금 매체에 셀 resuspend FBS, 12.5 µ M 조미료 및 10 µ g/mL gentamicin.</li>
	<li>플레이트 해리 폴 리-D-리 신 coverslips 비율에 따라 24 잘 접시에서에 뉴런: 1 피/12 우물과 1 해 마/6 웰 스, 잘 당 약 150000/200, 000 셀에 결과. 37 ° c.에 인큐베이터에서 세포를 유지</li>
	<li>하루 후 (하루에서 생체 외에서DIV 1), 2 %B27, 10 µ g/mL gentamicin 2mm 글루타민을 포함 하는 매체 도금 매체를 바꿉니다.</li>
	<li>DIV 2에서 매체의 1/3를 제거 하 고 48 h glial 오염 감소를 위한 2.5 µ M 시 토 신 arabinoside 포함 된 신선한 매체의 1/3를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° C에서 신경 세포를 유지 하 고 매체의 절반 3 일 마다 교체.</li>
</ol>4. 신경 치료
참고: 치료 DIV 7에서 수행 되었습니다. 모든 단계는 무 균 조건에서 세포 문화 후드 아래 수행 됩니다. DIV 7에서 대뇌 피 질의 신경 문화 밀도의 예는 그림 1에서 그림입니다.
<ol><li>ΑS microsomes 관련 집계 희석에 대 한 원래 균질 버퍼를 사용 하 여 1 µ g / µ L 솔루션을 위해 3 다른 질병 안내 쥐의 척수에서 얻은 풀.</li>
	<li>매체의 1/3를 제거 하 고 2 %B27, gentamicin와 2 mM 글루타민 x 1 포함 된 신선한 매체 부드럽게 바꿉니다.</li>
	<li>셀 중간에 풀링된 microsomes 관련 된 αS의 1 µ g을 추가 합니다. 37 ° c.에 인큐베이터에서 뉴런을 반환</li>
	<li>1 주, 3 일 마다 신선한 매체의 1/3를 추가 합니다. 매체를 대체 하지 않습니다. 그냥 추가.</li>
	<li>1 주일 후 치료, 매체의 1/3를 제거 하 고 2 %B27, 10 µ g/mL gentamicin 2mm 글루타민을 포함 된 신선한 매체 부드럽게 바꿉니다. 3 일 마다 반복 합니다.</li>
	<li>신경 치료 (DIV 21)의 2 주 후 수정.</li>
</ol>5입니다. 면역 형광 검사
<ol><li>PBS에서 2 %paraformaldehyde 뉴런을 수정 1 x와 5% 자당 해결책 없이 떨고, RT에 15 분 동안 화학 물질에서 증기 후드.</li>
	<li>담합 솔루션을 제거 합니다. 간단히, x, 3 회 PBS 1 씻어. 참고: 기본 신경 스틱을 하지 않는 확실히을 폴 리 리 신 coverslips 때문에 부드럽게 세척의 모든 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>PBS 1 비 계면의 0.3% 신경 세포를 permeabilize 실시간 5 분에 대 한 x</li>
	<li>간단히, x, 3 회 PBS 1 씻어.</li>
	<li>3%와 뉴런을 품 어 PBS 1에서에서 FBS x RT, 궤도 통에 불특정 바인딩 사이트 차단에서 30 분.</li>
	<li>3%에 용 해 하는 적절 한 기본 항 체와 신경 세포를 품 어 PBS 1에서에서 FBS x, O/N 궤도 통에 4 ° C에서. 참고: syn303 (1:1, 000), 마우스 αS (1: 200), pser129-αS (1:1, 000)와 타우 (1:10, 000) 항 체 사용 되었다.</li>
	<li>X, 3 회 PBS 1 가진 항 체 솔루션 및 세척, 짧게, 제거 합니다.</li>
	<li>3%에 녹아 적절 한 형광 이차 항 체와 신경 세포를 품 어 FBS 궤도 셰이 커에 어둠 속에서 RT에 1 시간에 대 한 PBS에.</li>
	<li>X, 3 회 PBS 1 가진 항 체 솔루션 및 세척, 짧게, 제거 합니다.</li>
	<li>DAPI 솔루션 뉴런을 얼룩 (0.1 µ g/mL PBS 1에에서 x) 궤도 셰이 커에 어둠 속에서 RT에서 15 분.</li>
	<li>X, 3 회 PBS 1 가진 항 체 솔루션 및 세척, 짧게, 제거 합니다.</li>
	<li>Antifade 설치 매체를 사용 하 여 슬라이드에 coverslips를 탑재 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=100+years+of+Lewy+pathology.">100 years of Lewy pathology.</a> Nat. Rev. Neurol. 9, 13-24 (2012).</li><li>Visanji, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein-Based+Animal+Models+of+Parkinson's+Disease:+Challenges+and+Opportunities+in+a+New+Era.">&#945;-Synuclein-Based Animal Models of Parkinson's Disease: Challenges and Opportunities in a New Era.</a> Trends Neurosci. 39, 750-762 (2016).</li><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+&#945;-Synuclein+Transmission+Initiates+Parkinson-like+Neurodegeneration+in+Nontransgenic+Mice.">Pathological &#945;-Synuclein Transmission Initiates Parkinson-like Neurodegeneration in Nontransgenic Mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li><li>Rey, N. L., Petit, G. H., Bousset, L., Melki, R., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+human+&#945;-synuclein+from+the+olfactory+bulb+to+interconnected+brain+regions+in+mice.">Transfer of human &#945;-synuclein from the olfactory bulb to interconnected brain regions in mice.</a> Acta Neuropathol. (Berl). 126, 555-573 (2013).</li><li>Guo, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+inoculation+of+pathological+&#945;-synuclein+initiates+a+rapidly+progressive+neurodegenerative+&#945;-synucleinopathy+in+mice.">Intracerebral inoculation of pathological &#945;-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative &#945;-synucleinopathy in mice.</a> J. Exp. Med. 209, 975-986 (2012).</li><li>Mougenot, A. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+acceleration+of+a+synucleinopathy+in+a+transgenic+mouse+model.">Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model.</a> Neurobiol. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+seed+the+formation+of+Lewy+body-like+intracellular+inclusions+in+cultured+cells.">Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 20051-20056 (2009).</li><li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramuscular+injection+of+&#945;-synuclein+induces+CNS+&#945;-synuclein+pathology+and+a+rapid-onset+motor+phenotype+in+transgenic+mice.">Intramuscular injection of &#945;-synuclein induces CNS &#945;-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 10732-10737 (2014).</li><li>Lee, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+Biological+Compatibility+with+Host+Alpha-Synuclein+Influences+Fibril+Pathogenicity.">Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity.</a> Cell Rep. 16, 3373-3387 (2016).</li><li>Volpicelli-Daley, L. A., Kirik, D., Stoyka, L. E., Standaert, D. G., Harms, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+rAAV-&#945;-synuclein+and+the+fibril+&#945;-synuclein+models+advance+our+understanding+of+Parkinson's+disease.">How can rAAV-&#945;-synuclein and the fibril &#945;-synuclein models advance our understanding of Parkinson's disease.</a> J. Neurochem. 139, 131-155 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

우리를 αS Tg 동물 모델에서 격리 순화 microsomes 관련 된 αS의 추가 통해 WT 쥐에서 신경 주 문화 두뇌 파생 된 αS 포함의 형성을 받는 방법을 설명 합니다.
이 프로토콜의 중요 한 단계는 다음: αS microsomes 관련 된 집계/뉴런의 µ g과 αS의 소스 비율. 그것은 이후 조 세포 죽음 또는 너무 부족 한 세포내 집계 이어질 수 있는 최적이 조건에서 작업 αS microsomes 관련 된 집계/신경의 수의 µ g의 비율을 최적화 하는 중요 한 결과 세션 같이 (참조는 대표적인 결과 섹션)입니다. 이 때문에, 그것은 매우 치료를 시작 하기 전에 신경 문화 사업부 7 ( 그림 1참조)에서 밀도 평가 하는 것이 중요. 또한, αS 집계 병 αS 안내 쥐, 즉에서 정화 해야 합니다. 누적 된 동물 모델에서 파운드 같은 포함 특징 phosphorylated 세제 불용 성 αS HMW 소.
이 프로토콜에 대 한 가능한 수정에 대해 조직, 냉동 또는 신선한, 어떤 microsomes 격리 될 수 있습니다 및 시작에서. 우리 αS 불 용해성의 높은 내용 때문에 SpC의 안내 마우스를 사용, 지역 αS 집계에 있는 높은 콘텐츠를 프로토콜을 어떤 조직에서 microsomes 관련 집계를 분리 하 적당 하다. 동결의 microsomes 관련 된 집계를 집계 라기보다정화 단계를 영향을 주지 않으므로 냉동된 샘플도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 microsomes에서 얻기를 위해 적합 한 조직에 대 한 권장된 시작 무게는 약 100-150 mg, 원료 (최대 중량 제한 없음)의 50 밀리 그램으로 낮은. 그러나 100 mg 보다 낮은 금액의 경우, 적합 한 균질 비율 있을 것입니다 1:20 (w/v) 적어도 1 mL의 표면에 뜨는 S10 ultracentrifuge 강 수에 대 한 폴 리 탄산염 병에 로드 하는 순서. 사실, 1 mL 보다 작은 볼륨을 로드 튜브 및 샘플 손실의 붕괴 될 수 있습니다. 더 희석된 상쾌한 이어질 것입니다 균질 볼륨 증가 하지만 microsomal 펠 릿의 농도 영향을 받지 유지 됩니다.
이 프로토콜의 한계는 비효율적인 크로스-시드 αS 포함 최근 보고 된 인간 근원의 αS PFFs의 사례 관리에 마우스 αS PFFs24반대 murine 신경 문화 형성에 염려 한다. 다른 αS 변종 또는 다른에서 소의 관리의 경우 microsomes 관련 집계의 양을 정밀 하 게 조정 하는 것이 좋습니다 murine 문화에 주어진 세 αS 소의 양을 늘리면이 문제를 무시할 수 있습니다, 이후 우리가 설명 보다 마우스 신경 문화 종.
문화 미디어에 추가 하는 외 인 αS 집계는 서로 다른 소스에서 수 있습니다. ΑS PFFs 체 외에서 세포 배양, 기본 신경 세포 및 동물 모델3,7,,815에 세포내 αS의 시드 템플릿으로 이전 사용 되었습니다. 어디 αS microsomes 관련 집계는 몇 시간에서 고립 될 수 있다 우리의 방법에 비해 PFFs의 형성은 길고 힘 드는, purifications, αS confomations25 집계 확인 하기 추가 분석 실험에 의해 다음의 여러 단계를 요구 . 또한, PFFs 박테리아 표현 인간 또는 마우스 αS에서 취득 되 고, 즉 부족 posttranslational 수정, 진핵생물의 전형적인 수 다른 conformations와 현재 선택적 시드 병원 성 속성에 따라 nucleation 프로토콜 (예: 리본 vs 소)5,8 다른 결과 및 결론에 따 랐 다. 대신, αS 집계에 vivo에서 정화의 단일 관리 동물 모델 및 PD 환자에서 αS 포함의 형성 과정을 밀접 하 게 흉내 낸 더 본격적인 병원 서식 파일의 전송을 보장 합니다.
이 기술의 미래 응용 프로그램,으로 우리 믿는 것이 프로토콜 사용할 수 있습니다 성공적으로 PD 환자의 뇌 또는 다른 αS Tg 동물 모델에서 αS 병원 성 종자를 격리 하 병에 걸리는 지역에서 microsomes 격리 된 풍부한 αS에 제공 흠입니다.
우리의 지식, vivo에서 PD 모델 시드 αS 포함 주 뉴런에서의 형성을 얻기 위해 서식 파일으로 사용할 수에서 αS의 기본 독성의 정화를 허용 하는 첫 번째 방법입니다.
우리는이 방법은 매우 다목적 이며 αS 집계 및 셀 이상에 미치는 영향의 다양 한 측면을 연구 하는 뛰어난 셀 기반 모델을 제공할 수 있습니다 믿습니다. ΑS 포함 형성 대표 배양된 세포에서 복제 하기 어려운 복잡 한 과정, 때문에 우리는이 모델 급성 병원 성 기계 장치, 만성 및 더 정교한 식별 하드에 큰 통찰력을 제공할 것입니다 희망 시스템은과 같은 동물 모델은.

알파 synuclein (αS) 배치할 포함의 축적은 Parkinson의 질병 (PD)와 알파-synulceinopathies1의 유명 하 고 중요 한 기능입니다. 불행히도, 동물 모델 유도 집계 단계 단백질 소2의 형성에 필요한 충분 한 셀룰러 및 생 화 확 적인 환경을 제공할 수 있습니다, 하는 동안 복제 복잡 한 Lewy 몸 (파운드)의 형성-같은 집계 세포 배양에서 어렵고 도전 이다입니다.
여기는 αS 포함, 유사한 동물 모델 및 PD 환자, 경작된 한 세포에 고립 된 두뇌 마우스 기본 뉴런을 사용 하 여 얻은 단백질 집계의 형성을 유도 하는 방법에 설명 합니다. 우리의 프로토콜 αS 증상 유전자 변형 (Tg) 마우스에서 마우스 hippocampal 또는 대뇌 피 질의 기본 신경 격리 microsomes 관련 된 αS의 외 인 관리를 기반으로 합니다. 이 메서드는 αS 독성 종, 문화 매체에 추가 내 면 되 고 성숙 αS-긍정적인 집계3,4,의 형성을 유발 수 있습니다 확산 및 전파 능력의 활용 5,6,,78.
원래, 셀 문화에서 αS 소의 형성을 얻기 위해 표준 방법 일반 transfection 프로토콜 또는 중재 바이러스 감염9통해 해당 αS cDNA의 overexpression에 근거 했다. 두 번째 프로토콜 감염 에서에서 24-48 h에 고 분자량 (HMW) 종류를 포함 하 여 불용 성 소의 형성에 주도 동안 파운드 같은 αS를 얻는 첫 번째 경우 집계 뜻밖, 낮은 효율, 그리고 셀 형식에 의존 10. 이러한 방법의 형성 아마는 과도 한 때문 이었고 αS 단백질 금액 집계를 지시 하는 αS 나 란의 병 적인 변환 보다 불용 성 되는 불균형. 대신, 우리는 여기에서 제시 하는 기술은 αS 식 수준을 변경 하지 않습니다 하지만 세 소의 국제화로 인해 광범위 한 단백질 집계를 유도. 또한, 외 인 소의 관리를 통해 αS의 형성 하는 과정 일 또는 주 되 철저 한 공부 시간 경과 패션에 αS 포함 형성의 초기 및 중간 단계를 필요로 하 고 에 세포 생화학 변화 상관. 따라서, 우리의 방법은 현미경으로 세포 이상에 관하여 αS fibril 형성 연구에 도움이 되는 αS 집계의 휴대 전화 모델을 만드는 유용한 응용 프로그램입니다.
또한 원시 뇌의 병 αS (Tg) Transgenic 쥐11,에서 추출 하는 있지만12 또는 인간의 PD 두뇌6,13 은 Tg 또는 야생-타입 (WT) 동물, 응용 프로그램에서 αS 증 착을 유도 할 수 세포 배양에 동일한 절차의 가능성이 낮은 양의 집계에서 사용 하는 샘플 및 네이티브 αS 독성 종14분리 표준 절차의 부족 때문에 성공적으로 수 입증 되지 않았습니다. 이 때문에, 생체 외에서 미리 형성 된 소 (PFFs) αS의 지금까지 셀에 αS 포함의 유도 대 한 선택의 집계 소스 그리고 동물 모델3,4,6,7 ,,1516. 그러나 우리의 프로토콜,, 우리 αS microsomes 관련 집계 종 αS Tg 마우스에서 분리 세포내 파운드 같은 αS 포함 주 뉴런에서의 축적을 일으킬 수 있는 효율적으로 보여준다.
우리 실험실에서 αS microsomes 관련 집계 종 [Prp 인간 A53T αS Tg 마우스, g 2-317] 마우스 프리온 단백질 (PrP) 발기인의 통제 인간 A53T αS 유전자 표현 질병 안내 쥐의 척수 (SpC) 조직 으로부터 격리 됩니다. 이러한 마우스 표시 중앙 신경 시스템에 강력한 모터 역 기능 및 포함의 형성을 포함 하는 연령에 따라 신경 표현 형의 만든 phosphorylated, ubiquitinated, 및 나이의 9 달 후에 시작 하는 불용 성 αS. 모터 부전 나타나면, phenotype 마비, 후부 사지에서 시작 2-3 주에 죽음에 이르게 하는으로 급속 하 게 진화. ΑS의 축적 질환 징후를 평행 시킨다. 마우스 모터 장애의 발병에 희생 SpC, 뇌 줄기 및 소 뇌에 αS 집계의 강력한 학위를 보여줍니다. 마비 마우스를 희생 하는 설정 할 때까지 기다릴 필요가 없습니다입니다. Presymptomatic 마우스 모터 역 기능을 표시 하지 않는 9 개월 된 동물에서 가져옵니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:931px;" width="931">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">84097-1KG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Hepes&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887-100ML</td>
			<td>1M pH=7-7.6</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:400px;">EDTA&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">0390-100ml</td>
			<td>pH=8 0.5M</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:400px;">MgCl2</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:400px;">NaCO3</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:400px;">NAHCO3</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Methanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>322415-6X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:400px;">KCl</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:400px;">cOmplete Mini&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">PhosStop&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4906837001</td>
			<td>phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:245px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">EMPO14500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Criterion TGX 4-20% Stain Free, 18 wells</td>
			<td style="width:245px;">Biorad</td>
			<td>5678094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Supported Nitrocellulose membrane&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Biorad</td>
			<td>1620097</td>
			<td>0.2 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Blotting-Grade Blocker&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Biorad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Non-fat dry milk</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">34077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Nitric acid&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>1004411000</td>
			<td align="right">65%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Glass Coverslips&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td>1014355118NR1</td>
			<td>18 mm x&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14170-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>10,000 U/mL, 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D5796-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td align="right">0.50%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">B27 Supplement&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Glutamax&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">DNAse</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:245px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">EC50182L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Glutamate</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>1446600-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10888-022&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytosine arabinoside (AraC)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3350000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">VECTASHIELD antifade mounting medium&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">DAPI</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90 Ti rotor</td>
			<td style="width:245px;">Beckman</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:245px;">Beckman</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Syn-1 antibody, clone 42&#160;</td>
			<td style="width:245px;">BD Biosciences</td>
			<td>610786</td>
			<td>anti-mouse WB: 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Syn303 antibody&#160;</td>
			<td style="width:245px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">824301</td>
			<td>anti-mouse IF: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Tau antibody&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Synaptic Systems</td>
			<td>314&#160;002</td>
			<td>anti-rabbit IF: 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:400px;">pser129-&#945;S antibody&#160;</td>
			<td style="width:245px;">A gift from Fujiwara et al, reference 19</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>anti-rabbit WB: 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">pser129-&#945;S antibody</td>
			<td style="width:245px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab51253</td>
			<td>anti-rabbit&#160; IF: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Mouse &#945;S (D37A6) XP&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">4179</td>
			<td>anti-rabbit IF 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Alexa fluor 555-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A27039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Alexa fluor 488-conjugated anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Microson XL-2000&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Misonix</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sonicator&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Bottles (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, Assembly, Noryl Cap, Beckman-type</td>
			<td style="width:245px;">Science Service EU</td>
			<td style="width:119px;">S4484</td>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AXIO Observer Inverted Light Microscope&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCS SP2 laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:245px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted epi-fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td>Nonionic surfactant&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exogenous administration of microsomes-associated alpha-synuclein aggregates to primary neurons as a powerful cell model of fibrils formation

년, 셀 문화 흠도 불용 성 알파 synuclein (αS)의 형성을 복제의 무 능력 αS 집계에서 파 킨 슨 병 (PD)의 연구에 큰 제한 되었습니다. 최근, 질병 αS 유전자 변형 쥐 또는 PD 환자에서 뇌 추출의 외 인 접종을 통해 새로운 동물 모델의 개발 αS 집계의 더 적절 한 셀 모델의 가능성을 새로운 희망을 부여 하고있다. 불행히도, 셀 문화에 관해서, 원시 뇌 추출의 쥐에서 성공적으로 입증 되지 않은 그리고 exogenous 집계의 선택의 소스는 아직 생체 외에서 preformed αS 소.
매우 독성 αS 종 유전자 변형 생쥐의 병에 걸리는 지역에서 고립의 네이티브 microsomes 관련 된 αS, 외 인 관리를 통해 기본 신경 세포에서 세포내 αS 포함의 형성을 유도 하는 방법을 개발 했습니다. Microsomes 소포와 연결 되는 αS의이 분수 효율적으로 내 면화 하 고 세포내 포함 집계 및 phosphorylated αS에 대 한 긍정적인의 형성을 유도 한다. 생체 외에서에 비해-재조합 αS, 우리의 방법에서에서 만든 미리 형성한 소 빠릅니다 및 정통 αS 집계로 만든 병원 성 시드 보장 더를 흉내 낸 PD의 질병 동물 모델에서 추출의 종류 밀접 하 게 포함에 비보를 얻을. 그 결과, 조직 αS 포함 풍부한의 가용성은 필수입니다.
우리 믿고이 방법은 αS 집계 및 비보에 관련된 세포 이상의 미세한 측면을 연구 하는 다양 한 셀 기반 모델을 제공 합니다 더 정확 하 고 정교한 세포의 창조를 위한 출발점이 될 것입니다. PD의 패러다임입니다.

프로토콜에 따라 위에서 설명한 그림 2에 요약, 우리 3 병 A53T αS Tg 쥐 (그림 3)에서 αS microsomes 관련 집계를 정화. Microsomes는 조 막 펠 릿 분수 바인딩과 그물, 골, 작은 시 냅 스 소포를 포함 하는. 다른 부분에 비해 microsomal 펠 릿의 순수성의 정도 특정 세포 기관이 마커18를 사용 하 여 평가 이전 되었습니다.
절연, 일단 αS의 생 화 확 적인 특성은 변성 SDS-페이지, Syn-1 또는 떠들고 129 (pSer129-αS) 항 체에 phosphorylated αS 부 화 뒤를 통해 평가 됩니다. Presymptomatic (PreS)와 일치 하는 나이 비-Tg (nTg) 쥐, microsomes αS 집계 아픈 마우스 공동 침전에서 격리에 비해. Microsomes 관련 된 αS 종 αS 집계 HMW 세제 저항 종, 떠들고 12919 와 C 인 산화의 축적 등의 일반적인 기능을 표시-N 맨끝 파편 (의 전체 특성에 대 한 잘립니다 및 αS microsomes 관련 집계 기준18,,2021참조). 이들은 기본 사항 단위체 αS 않습니다 하지 얻을 효율적으로 내 면 이후 αS 증 착7,,1522를 유도 하지 않습니다. 그것은 P100 펠 릿 세포에 유해한 수 있기 때문에 resuspend를 이온 (비 이온) 어떤 세제를 사용 하지 해야 합니다. 또한, 샘플 변화를 방지 하기 위해 세 가지 다른 병에 걸린 쥐에서 αS microsomes 관련 집계 풀링됩니다 신경 치료에 대 한.
관리의 풀링된 microsomes 관련 αS 병 A53T 쥐에서 피 질 또는 hippocampal 신경 세포의 배양에 1 µ g의 αS 포함와 같은 집계 관련 αS 항 체에 대 한 긍정적인의 시간에 따른 형성 유도 Syn303 (그림 4, 5) 또는 pser129-αS (그림 5). 2 일 후 (2d) 치료 이러한 집계 나중 시간 지점에서 더 풍부한 될 것입니다 작은, 뿌려 진 puncta로 나타납니다. 2 주 후, αS 포함 긴 닮 고 구슬 모양의 구조를 무 겁 게 성숙 neurite 패턴 부분적으로 공동 연 접과 지역화는 신경 문화에 걸쳐 확산 neurites 마커 (그림 5). 때때로, 새로 형성된 된 αS 포함 공동 지역화 및 셀 소마 얼룩 또는 전체 프로세스를 닮은 괴 neurites 커버를 볼 수 있습니다.
ΑS microsomes 관련 집계 분수 신경 문화에서 효율적으로 확산 될 수 있습니다, 그들의 양을 세밀 하 게 신경 도금 (그림 1)의 수를 조정 해야 있다. 사실, 권장된 비율, microsomes 관련 집계의 µ g을 초과: 뉴런의 숫자 microsomes 관련 된 αS의 부족 한 금액으로 이어질 것입니다 하는 동안 며칠 내에 (그림 6), 조 세포 죽음을 유도 것 이다는 무슨 유사한 치료 2 주 후 포함의 부족 및 감소 된 수는 이전 시간 포인트(그림 4)에서 얻은 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig1.jpg"> 그림 1 . 대뇌 피 질의 신경 문화입니다. 대뇌 피 질의 신경 문화 사업부 7에서 밀도 표시 하는 대표 이미지. 이미지는 거꾸로 가벼운 현미경, 10 X 목표와 함께 찍은. 눈금 막대 = 100 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig2.jpg"> 그림 2 . Microsomes 관련 된 αS의 절연 마우스 SpC에서에서 집계. Microsomes 관련 된 αS의 정화 프로토콜의 순서도 병에 걸린 쥐의 SpC에서 집계합니다. <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig3.jpg"> 그림 3 . 질병, presymptomatic A53T αS 안내 및 nTg 쥐에서 microsomes 분수의 절연. 서쪽 오 점 분석 보여주는 정화 αS microsomes 관련 된 집계에서 3 병 (병), 절연 presymptomatic (PreS)와 일치 하는 세 nTg 쥐. 병에 걸린 생쥐는 presymptomatic 동물 건강 한 A53T는 αS 포함의 축적을 포함 하 여 모터 및 신경 장애를 나타내는 A53T αS Tg 마우스 αS 표시 되지 않는 나이 아직 어떤 αS 병리학의 9 개월의 Tgs 관련 표현 형. nTg 마우스 αS transgene를 수행 하지 않는 및 따라서 αS를 개발 하지 않는 병에 걸린 쥐의 littermates 유발 병 리는. 각 정제 분수의 1 µ g 변성 SDS 페이지에서 실행, 니트로 멤브레인에 전송 되었고 Syn-1 또는 pSer129 αS 항 체와 얼룩이. Microsomes 분수 격리 아픈 쥐에서 포함 된 HMW 세제 저항 αS 집계 했다 떠들고 129에 phosphorylated 고 C만-및 N 맨끝 잘림. 이 그림에서 콜라 외 적응 되었습니다. 18. <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig4.jpg"> 그림 4 . 시간에 따라 microsomes 관련 된 αS의 관리 후 αS 증 착의 감 응 작용. (A) 기본 hippocampal 신경 세포의 면역 형광 검사 치료 1 µ g의 microsomes 관련 αS 분수 3 다른 병에 걸린 쥐에서 풀링된 집계. 뉴런 일 2 고정 했다 (제 2), 1 주 (1w) 또는 처리와 syn303와 immunostained의 2 주 (2w) (S303, 1:1000), 항 체에 대 한 특정 산화 및 αS를 집계. 셀은 DAPI와 counterstained 했다. 공초점 이미지 공초점 현미경, 63 X 목표 스캐닝 레이저를 사용 하 여 찍은 사진. 눈금 막대 배경 빼기 후 50 µ m (B) 정량 분석 총 ﬂuorescence, =, 이루어졌다 이미지 J 소프트웨어의 입자 수 플러그인을 사용 하 여. 값 필드 (DAPI 카운트) 핵의 수에 대 한 표준화 되었고 2D에서 S303 형광 신호에 대 한 비율로 표시. 값은 평균 ± SD로 부여 됩니다 (n = 5). * * p < 0.001, * * * p < 0.00001, 단방향 ANOVA, 피셔의 LSD 게시물-특별 시험 다음. <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig5.jpg"> 그림 5 . 대뇌 피 질의 neurites 네트워크와 세포내 αS 포함 colocalize. 대뇌 피 질의 뉴런의 대표적인 confocal 이미지 치료 질병 안내 생쥐에서 얻은 αS microsomes 관련 된 집계. 후 2 주 치료 뉴런의 고정 되었고 이중 집계 특정 항 체 [S303 (A, B) 또는 pser129-αS, 1:1,000 (C)]와 [마우스 αS, 1: 200 (A, B) 또는 타우, 1:10,000 (C)] neurite 마커 스테인드. 공동의 형광 신호 라벨 부분 공동 지역화 neurites 네트워크와 새로 형성된 된 αS 구슬 모양의 구조 설명. 때때로 αS 포함 (A, B, 화살촉) 신경 소마 내 축적. 스택된 이미지 confocal 현미경, 63 X 목표 스캐닝 레이저와 함께 인수 했다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림에서 콜라 외 수정 되었습니다. 20. <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig6.jpg"> 그림 6 . Microsomes 관련 된 αS의 차선 금액의 추가 신경에 독성 이다. 셀 죽음에 이르게 DAPI microsomes 관련 된 αS의 농도 증가 함께 치료 하는 뉴런의 얼룩. (A) 대뇌 피 질의 신경 치료 1, 2 µ g microsomes 관련 된 αS의 병에 걸린 쥐에서 추출 또는 포함 하지 않는 유일한 버퍼 (B)를 집계 하 고 DAPI 스테인드. 형광 이미지는 20 X 목표를 사용 하 여 피 형광 현미경으로 인수 했다. 눈금 막대 = 100 µ m.(B) DAPI 긍정적인 세포 이미지 J 소프트웨어를 사용 하 여 계산 했다. 그래프는 신경 미디어에 추가 된 microsomes 관련 된 αS의 농도 증가 함께 핵의 수에 있는 감소를 보여 줍니다. 값 b의 %로 표현 되 고 평균 ± SD로 받는다 (n = 5), * * * p < 0.0001, 단방향 ANOVA, 피셔의 LSD 게시물-특별 시험 다음. <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

이 프로토콜의 목표는 vivo에서집계 하는 알파 synuclein의 형성을 복제 하는 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 세포내 알파 synuclein 포함은 국제화에 의해 주 뉴런에 시드는 고 세의 전파 관리 네이티브 microsomes 관련 알파 synuclein 집계 병 알파 synuclein 유전자 변형 쥐에서 분리.

소 대형의 강력한 셀 모델로 기본 신경 하 Microsomes 관련 알파 synuclein 집계의 외 인 관리

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

exogenous-administration-microsomes-associated-alpha-synuclein

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.5K 조회수.  Scuola Normale Superiore. 이 프로토콜의 목표는 vivo에서집계 하는 알파 synuclein의 형성을 복제 하는 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 세포내 알파 synuclein 포함은 국제화에 의해 주 뉴런에 시드는 고 세의 전파 관리 네이티브 microsomes 관련 알파 synuclein 집계 병 알파 synuclein 유전자 변형 쥐에서 분리.

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Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, the olfactory bulb (OB), the dorsal motor nucleus of the vagus (DMV)3, the intermediolateral nucleus of the spinal cord 4 and the substantia nigra, providing the basis for the neuropathological staging of the disease4,5. The ENS and the OB are the most exposed nervous structures and the first ones to be affected. Interestingly, PD has been related to pesticide exposure6-8. Here we show in detail two methods used in our previous study 9. In order to analyze the effects of rotenone acting locally on the ENS, we administered rotenone using a gavage to one-year old C57/BL6 mice. Rotenone is a widely used pesticide that strongly inhibits mitochondrial Complex I 10. It is highly lipophylic and poorly absorbed in the gastrointestinal tract 11. Our results showed that the administration of 5 mg/kg of rotenone did not inhibit mitochondrial Complex I activity in the muscle or the brain. Thus, suggesting that using our administration method rotenone did not cross the hepatoportal system and was acting solely on the ENS. Here we show a method to administer pesticides using a gavage and the image analysis protocol used to analyze the effects of the pesticide in alpha-synuclein accumulation in the ENS. The first part shows a method that allows intragastric administration of pesticides (rotenone) at a desired precise concentration. The second method shows a semi-automatic image analysis protocol to analyze alpha-synuclein accumulation in the ENS using an image analysis software.

Parkinson's disease has been related to the exposure to pesticides. Here we show a method to deliver pesticides using a gastric tube at the desired concentration and a method to analyze their effect in alpha-synuclein accumulation in the enteric nervous system.

장용 신경계의 알파 synuclein의 흠도의 Gavage 및 이미지 분석을 사용하여 Rotenone의 구강 관리

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

연구

신경과학

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems. The ability to produce highly specific antibodies to target proteins has allowed for very precise biological questions to be addressed. Importantly, antibodies have been implicated in the pathogenesis of a number of human diseases including systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), paraneoplastic syndromes, multiple sclerosis (MS) and human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) 1-9. How antibodies cause disease is an area of ongoing investigation, and data suggests that interactions between antibodies and various intracellular molecules results in inflammation, altered cellular messaging, and apoptosis 10. It has been shown that patients with MS and HAM/TSP produce autoantibodies to the intracellular RNA binding protein heterogeneous ribonuclear protein A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Recent data indicate that antibodies to both intra-neuronal and surface antigens are pathogenic 3, 5-9, 11. Thus, a procedure that allows for the study of intracellular antibody:protein interactions would lend great insight into disease pathogenesis.
Genes are commonly transfected into primary cells and cell lines in culture, however transfection of antibodies into cells has been hindered by alteration of antibody structure or poor transfection efficiency 12. Other methods of transfection include antibody transfection based on cationic liposomes (consisting of DOTAP/DOPE) and polyethylenimines (PEI); both of which resulted in a ten-fold decrease in antibody transfection compared to controls 12. The method performed in our study is similar to cationic lipid-mediated methods and uses a lipid-based mechanism to form non-covalent complexes with the antibodies through electrostatic and hydrophobic interactions 13. We utilized Ab-DeliverIN reagent, which is a lipid formulation capable of capturing antibodies through non-covalent electrostatic and hydrophobic interactions and delivering them inside cells. Thus chemical and genetic couplings are not necessary for delivery of functional antibodies into living cells. This method has enabled us to perform various antibody tracing and protein localization experiments, as well as the analyses of the molecular consequences of intracellular antibody:protein interactions 9.
In this protocol, we will show how to transfect antibodies into neurons rapidly, reproducibly and with a high degree of transfection efficiency. As an example, we will use anti-hnRNP A1 and anti-IgG antibodies. For easy quantification of transfection efficiency we used anti-hnRNP A1 antibodies labelled with Atto-550-NHS and FITC-labeled IgG. Atto550 NHS is a new label with high molecular absorbtion and quantum yield. Excitation source and fluorescent filters for Atto550 are similar to Cy3 (Ex. 556 Em. 578). In addition, Atto550 has high photostability. FITC-labeled IgG were used as a control to show that this method is versatile and not dye dependent. This approach and the data that is generated will assist in understanding of the role that antibodies to intracellular target antigens might play in the pathogenesis of human diseases.

A rapid approach to investigate interactions and effects on molecular mechanisms related to the presence of antibodies in an intracellular environment is described. The method involves transfection of antibodies into live cells using a non-covalent complex formation based on a lipid formulation. The technique is adaptable to immortalized cell lines and primary cells.

질병 Pathogenesis를 공부하는 도구로 뉴런에 항체 Transfection

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, oligomers and fibrils. During disease, &#945;-syn undergoes conformational changes to form oligomers and high molecular weight aggregates that tend to make the protein more insoluble. Abnormally aggregated &#945;-syn is a neuropathological feature of Parkinson&#39;s disease (PD), dementia with Lewy bodies (DLB) and multiple system atrophy (MSA). Biochemical characterization and analysis of insoluble &#945;-syn using buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation provides a powerful tool to determine the development of &#945;-syn pathology associated with disease progression. This protocol describes the isolation of increasingly insoluble/aggregated &#945;-syn from post-mortem human brain tissue. This methodology can be adapted with modifications to studies of normal and abnormal &#945;-syn biology in transgenic animal models harbouring different &#945;-syn mutations as well as in other neurodegenerative diseases that feature aberrant fibrillar deposits of proteins related to their respective pathologies.

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (&#945;-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of &#945;-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein prionoids, which cause neuropathology within the central nervous system (CNS). Here we describe that intraglossal or intraperitoneal injection of alpha-synuclein fibrils into bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which overexpress human alpha-synuclein with the A53T mutation from the prion protein promoter and firefly luciferase from the promoter for glial fibrillary acidic protein (Gfap), is sufficient to induce neuropathologic disease. In comparison to homozygous Tg(M83+/+) mice that develop severe neurologic symptoms beginning at an age of 8 months, heterozygous Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) animals remain free of spontaneous disease until they reach an age of 22 months. Interestingly, injection of alpha-synuclein fibrils via the intraperitoneal route induced neurologic disease with paralysis in four of five Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice with a median incubation time of 229 &#177;17 days. Diseased animals showed severe deposits of phosphorylated alpha-synuclein in their brains and spinal cords. Accumulations of alpha-synuclein were sarkosyl-insoluble and colocalized with ubiquitin and p62, and were accompanied by an inflammatory response resulting in astrocytic gliosis and microgliosis. Surprisingly, inoculation of alpha-synuclein fibrils into the tongue was less effective in causing disease with only one of five injected animals showing alpha-synuclein pathology after 285 days. Our findings show that inoculation via the intraglossal route and more so via the intraperitoneal route is suitable to induce neurologic illness with relevant hallmarks of synucleinopathies in Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice. This provides a new model for studying prion-like pathogenesis induced by alpha-synuclein prionoids in greater detail.

Peripheral injection of alpha-synuclein fibrils into the peritoneum or tongue of Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which express human alpha-synuclein with the familial A53T mutation and firefly luciferase, can induce neuropathology, including neuroinflammation, in their central nervous system.

알파 - 시누 클레인 브릴의 주변 접종 후 형질 전환 마우스의 신경 염증의 생물 발광 영상

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), Huntington&#39;s disease (HD), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Protein aggregates are closely associated with neuropathology in these diseases, although the exact mechanism by which aberrant protein aggregation disrupts normal cellular homeostasis is not known. Emerging data provide strong support for the hypothesis that pathogenic aggregates in AD, PD, HD, and ALS have many similarities to prions, which are protein-only infectious agents responsible for the transmissible spongiform encephalopathies. Prions self-replicate by templating the conversion of natively-folded versions of the same protein, causing spread of the aggregation phenotype. How prions and prion-like proteins in AD, PD, HD, and ALS move from one cell to another is currently an area of intense investigation. Here, a Drosophila melanogaster model that permits monitoring of prion-like, cell-to-cell transmission of mutant huntingtin (Htt) aggregates associated with HD is described. This model takes advantage of powerful tools for manipulating transgene expression in many different Drosophila tissues and utilizes a fluorescently-tagged cytoplasmic protein to directly report prion-like transfer of mutant Htt aggregates. Importantly, the approach we describe here can be used to identify novel genes and pathways that mediate spreading of protein aggregates between diverse cell types in vivo. Information gained from these studies will expand the limited understanding of the pathogenic mechanisms that underlie neurodegenerative diseases and reveal new opportunities for therapeutic intervention.

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Accumulating evidence supports the idea that pathogenic protein aggregates associated with neurodegenerative diseases spread between cells with prion-like properties. Here, we describe a method that enables visualization of cell-to-cell spreading of prion-like aggregates in the model organism, Drosophila melanogaster.

초파리 Melanogaster 에서 프리온과 같은 단백질의 셀 전송 모니터링

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The method is based on the specific binding of a radioligand to its biological target. Therefore, frozen tissue sections are incubated with radioligand solution, and the binding to the target is subsequently localized by the detection of radioactive decay, for example, by using photosensitive film or phosphor imaging plates. Resulting digital autoradiograms display remarkable spatial resolution, which enables quantification and localization of radioligand binding in distinct anatomical structures. Moreover, quantification allows for the pharmacological characterization of ligand affinity by means of dissociation constants (Kd), inhibition constants (Ki) as well as the density of binding sites (Bmax) in selected tissues. Thus, the method provides information about both target localization and ligand selectivity. Here, the technique is exemplified with autoradiographic characterization of the high-affinity &#947;-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in mammalian brain tissue, with special emphasis on methodological considerations regarding the binding assay parameters, the choice of the radioligand and the detection method.

The method of autoradiography is routinely used to study binding of radioligands to tissue sections for determination of qualitative or quantitative pharmacology.

시각화 및 약리 대상의 특성에 대 한 간단 하 고 강력한 방법으로 autoradiography

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the diagnosis still relies only on clinical signs of motor involvement that appear later on in the disease course, when most of the dopaminergic neurons are already lost. Hence, there is a strong need for a biomarker that can identify patients at the beginning of disease or at the risk of developing it. Over the last few years, skin biopsy has proved to be an excellent research and diagnostic tool for peripheral nerve diseases such as small fiber neuropathy. Interestingly, a small fiber neuropathy and alpha synuclein (&#945;Syn) neural deposits have been shown by skin biopsy in PD patients. Indeed, skin biopsy has the great advantage of being an easily accessible, minimally invasive and painless procedure that allows the analysis of peripheral nervous tissue prone to the pathology. Moreover, the possibility of repeating the skin biopsy in the course of the follow-up of the same patient allows studying the longitudinal correlation with the disease progression. We set up a standardized reliable protocol to investigate the presence of &#945;Syn aggregates in skin nerve fibers of the PD patient. This protocol involves few short fixation steps, a cryotome sectioning and then a free-floating immunofluorescence double-staining with two specific antibodies: anti Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) to mark the cutaneous nerve fibers and anti 5G4 for detecting &#945;Syn aggregates. It is a versatile, sensitive and easy to perform protocol that can also be applied for targeting other proteins of interest in skin nerves. The ability to mark &#945;Syn aggregates is another step forward to the use of skin biopsy as a tool for establishing a pre-mortem histopathological diagnosis of PD.

Here, we present a protocol for a free-floating indirect immunofluorescence assay on skin biopsy sections that allows for the identification of disease specific conformation variants of alpha synuclein involved in Parkinson disease and multiple proteins of the peripheral nervous system.

자유 부동 면역 형광 분석에 의하여 절단 말초 신경 섬유에 있는 알파 Synuclein 응집체를 표적으로 하는

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model Parkinson&#39;s disease synucleinopathy and nigrostriatal degeneration. The standardization of &#945;-syn PFF generation and in vivo application is critical in order to ensure consistent, robust &#945;-syn pathology. Here, we present a detailed protocol for the generation of fibrils from monomeric &#945;-syn, post-fibrilization quality control steps, and suggested parameters for successful neurosurgical injection of &#945;-syn PFFs into rats or mice. Starting with monomeric &#945;-syn, fibrilization occurs over a 7-day incubation period while shaking at optimal buffer conditions, concentration, and temperature. Post-fibrilization quality control is assessed by the presence of pelletable fibrils via sedimentation assay, the formation of amyloid conformation in the fibrils with a thioflavin T assay, and electron microscopic visualization of the fibrils. Whereas successful validation using these assays is necessary for success, they are not sufficient to guarantee PFFs will seed &#945;-syn inclusions in neurons, as such aggregation activity of each PFF batch should be tested in cell culture or in pilot animal cohorts. Prior to use, PFFs must be sonicated under precisely standardized conditions, followed by examination using electron microscopy or dynamic light scattering to confirm fibril lengths are within optimal size range, with an average length of 50 nm. PFFs can then be added to cell culture media or used in animals. Pathology detectable by immunostaining for phosphorylated &#945;-syn (psyn; serine 129) is apparent days or weeks later in cell culture and rodent models, respectively.&#160;

The goal of this article is to outline the steps required for the generation of fibrils from monomeric alpha-synuclein, subsequent quality control, and use of the preformed fibrils in vivo.

모노 머 로부터 미리 형성 된 섬유 소의 알파-시 뉴 클레 인 생성 및 생체 내 사용

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...