Name: imaging fitc-dextran as a reporter for regulated exocytosis
Uploaded: 2018-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis at JoVE.com

CDNA의 관대 한 선물에 감사 박사 미 Ashery 하 고. 우리 박사 G. 질량, L. Mittleman, M. Shaharbani, 및 Y.Zilberstein Sackler 세포질 & 분자 영상 센터에서 현미경으로 그들의 귀중 한 도움에 대 한 감사. 이 미국-이스라엘 Binational 과학 재단 (그랜트 2013263 R. Sagi-아이젠 버그, I. Hammel, 및 S.J.Galli)에 의해 지원 되었다 일과 933/15 이스라엘 아카데미 과학 (R.Sagi-아이젠 버그에 의해 설립 된 이스라엘 과학 재단에서 부여 )와 NIH 교부 U19 AI 104209 및 R01 AR067145 (하 스 Galli).

1입니다. 준비
<ol><li>RBL 문화 미디어의 준비<ol>
<li>낮은 포도 당 Dulbecco의의 믹스 500 mL 페니실린-스-nystatin 솔루션, L-글루타민 200 m m 솔루션의 5.5 mL의 5.5 mL 소 태아 혈 청 (FBS)의 56 mL와이 글의 중간 (DMEM)를 수정합니다. 낮은 포도 당에서이 결과 DMEM와 10 %FBS, 100 µ g/mL 스, 100 단위/mL 페니실린, 12 단위/mL nystatin, 2 mM L-글루타민 보충.</li>
		<li>4 ° c.에 0.22 μ m 기 공 크기 및 저장소의 최고 진공 필터를 사용 하 여 미디어를 필터링</li>
	</ol>
</li>
	<li>RBL 세포의 유지 보수입니다.<ol>
<li>10 cm 접시에 90%의 최대 confluency RBL 세포 성장. 건강 한 세포 배양의 경우 셀 가끔 돌출 된 스핀 들 모양이 있어야 합니다.</li>
		<li>셀 분할 분리 접시에서 셀 미디어를 발음 하 고 37 ° c.에 5% CO2 의 습도 분위기에서 5-10 분에 대 한 trypsine/EDTA 솔루션 B. 품 2 mL와 함께 교체</li>
		<li>셀을 분리 했으면 일단 한 피 펫을 사용 하 여 문화 미디어의 2 개 mL를 추가 하 여는 트립 신을 중화 하 고 1:2-1 셀 분할: 10 비율.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tyrode의 버퍼 x 20의 준비<ol>
<li>X 54 m m KCl의 솔루션, 20 mM MgCl2, 2.74 M NaCl, 두 배 증류수 (DDW)에서 8 밀리미터 NaH2포4 주식 20를 준비 합니다. 잘 혼합 하 고 4 ° c.에 저장</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 라이브 셀입니다 RBL 세포의 문화
<ol><li>FITC dextran 솔루션의 준비입니다.<ol>
<li>문화 미디어 (1.1.1 단계 참조)의 1 mL 당 FITC dextran 가루 (150 K) 1 mg을 혼합. 전체 연 발된 coverglass 3 mL 준비.</li>
		<li>0.22 μ m 기 공 크기와 셀 루 로스 아세테이트 주사기 필터 단위를 사용 하 여, 녹아 FITC dextran 필터링.</li>
		<li>1 µ g/mL의 농도를 마우스 IgE를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미징에 대 한 시드 RBL 셀<ol>
<li>이미징, 전날 문화 접시에서 미디어를 발음 하 고 37 ° c.에 5% CO2 의 습도 분위기에서 5-10 분에 대 한 trypsine/EDTA 솔루션 B. 품의 2 개 mL를 바꿉니다 셀을 분리 했으면 일단 문화 미디어의 2 개 mL를 추가 하 여는 트립 신을 중화.</li>
		<li>수 RBL 세포는 hemocytometer를 사용 하 여 볼륨을 조정 따라 105/mL x 7.5의 세포 농도를 문화 미디어.</li>
		<li>10 µ L 연 발된 coverglass 미리 가득 신선한 FITC-dextran을 세포 현 탁 액의 보충 (7.5 x 103 셀 챔버에 시드 결과) 문화 미디어를 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° c.에 5% CO2 의 humified 분위기에서 하룻밤 RBL 세포 성장 셀 셀 구분 되 고 쉽게 현미경 개별적으로 각 셀을 식별할 수 있는지 확인 하기 위해 하위 confluent 수준에 있어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfection RBL 세포-옵션 의입니다.<ol>
<li>함께 다른 붙일 태그가 단백질 exocytic 이벤트 영상, transfection 프로토콜 RBL 셀 Azouz 그 외 여러분 에 대 한 참조 67
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 라이브 셀 Exocytosis의 현미경 검사 법
<ol><li>솔루션의 준비:<ol>
<li>1시 20분에서 DDW에서 재고 솔루션을 diluting 하 여 최종 Tyrode의 버퍼 솔루션 준비 희석 및 20 mM Hepes ph 7, 1.8 m m CaCl2, BSA, 1 mg/mL 및 5.6 m m 포도 당 보충.</li>
		<li>Tyrode의 버퍼에 20 x 간접적인 시 갓 준비 [1 µ g/mL dinitrophenyl 인간 혈 청 알 부 민을 활용 (DNP-은 (Ag)) 50 ng/mL 1 배 농도 대 한 우리의 경우에].</li>
		<li>Tyrode의 버퍼에 분말을 용 해 하 여 400 m m 염화 암모늄 솔루션을 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀의 준비입니다.<ol>
<li>상공에서 미디어를 발음 하 고 37 ° c prewarmed Tyrode의 버퍼의 300 µ L로 그것을 채우는 여 연 발된 coverglass 3 번 씻어 마지막으로, Tyrode의 버퍼, 37 ° c.에 prewarmed의 300 µ L와 챔버를 보충</li>
		<li>현미경의 보육 실에서 연 발된 coverglass를 놓습니다. 챔버는 안정 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>현미경을 설정<ol>
<li>추적에 대 한 관심의 영역을 선택 하려면 형광 광원 (전통적으로 수은 램프) 설정 하 고 적절 한 형광 필터 선택 (FITC dextran을 보기 위한 녹색 fluorophores에 대 한 필터를 선택). 일단 관심 영역 초점 보기의 필드는가 사진-표백 및 독성을 피하기 위하여 광원을 해제. 참고: 일부 셀에 FITC dextran의 형광을 유지 수 있습니다. 이 때문에 FITC dextran endosomes 같은 비 lysosomal 구획에도 정렬할 수 있습니다.</li>
		<li>FITC 여기에 대 한 적절 한 조명 설정. 레이저 기반 현미경을 사용 하는 경우 488 nm 레이저를 켭니다. 방출 주위 수집 해야 500-550 nm (510-520 nm에서 FITC 방출 봉우리).</li>
		<li>Confocal 현미경을 사용 하는 경우 최대에 작은 구멍을 엽니다. 이 표백 피하기 위해 저전력 레이저 및 독성을 사용 하 고 셀의 모든 비행기에서 exocytosis 이벤트 캡처를 보장 합니다.</li>
		<li>보정 이미지 인수 사이의 시간 간격.<ol>
<li>다른 세포는 규제 exocytosis68의 그들의 활동에서 달라질 수 있습니다. 복합 exocytosis의 특정 이미지에 대 한 시간 간격을 5 초 이상 하는 것이 좋습니다. 그러나, 엄지손가락의 규칙으로 서 빠른 이미징 있도록 확인 단일 프레임의 획득 시간 빠릅니다.</li>
			<li>레이저 검사 confocal 현미경을 사용할 때 스캔 방향을 양방향으로 설정, 평균, 수 없고 512 x 512에서 해상도 설정 (권장, 후자의 두 조항 또한 표백 및 독성을 최소화 하기 위해 도움이 될 것입니다).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exocytosis의 이미지입니다.<ol>
<li>이미지 셀의 셀 또는 간접적인 유형에 따라 원하는 기간에 대 한. RBL 세포 IgE/Ag와 발생, 대부분의 exocytic 이벤트 활성화의 15-20 분 이내 발생.</li>
		<li>세포의 활성화, 대 한 상공 회의소 간접적인 솔루션 x 20에서 16 µ L을 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀에 FITC dextran 존재 확인.<ol>
<li>존재와 FITC-dextran SGs에의 지역화를 확인 하려면 추가 염화 암모늄 솔루션의 16 µ L (초점을 잃게 하기에서 챔버를 이동 하지 않도록 주의 수) 챔버를 부드럽게 (이 20 m m의 최종 농도 만들 것입니다). 이 SGs의 자율 및 초 이내 발생 합니다 FITC 형광의 dequenching을 유발 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자 선언 경쟁 금융 관심

여기 어떻게 추적 FITC-dextran SGs에 로드의 형광 특히 복합 exocytosis 이벤트를 캡처하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다. 이 인수는 이미지 15 초 마다 현미경을 설정, 따라서 시간이 지남에, 오랫동안 이벤트만 기록 됩니다 하 고 따라서 짧은 것이 해당 하는 이벤트 전체 exocytosis 또는 키스 실행 exocytosis를 제외 하 여 달성 되었다. 메서드를 설정 하려면 우리는 RBL 세포에 표현 되 고 복합 exocytosis 중...

규제 exocytosis를 쉽게 만든된 화물 특정 트리거에 분 비 세포에서 출시 하는 기본 메커니즘입니다. 화물은 미리 형성 하 고 그것까지 트리거 릴레이 SGs의 콘텐츠의 출시에 대 한 신호 저장 되어 있는 분 비 소포에 압수. 다양 한 유형의 신호 규제 exocytosis의 다른 모드에서 발생할 수 있습니다 또는 다른 형태의 규제 exocytosis 동시에 발생할 수 있습니다. 규제 exocytosis의 세 가지 주요 모드 알려져 있습니다: 전체 exocytosis, 원형질 막;와 단일 분 비과 립의 완전 융합을 포함 키스 실행 exocytosis, 재활용; 다음 플라즈마 막으로 분 비과 립의 과도 융합을 포함 그리고 여러 SGs 이전 (즉, multigranular exocytosis)의 homotypic 융합이 특징인 복합 exocytosis 순차적 또는 (즉, 순차 exocytosis) 플라즈마 멤브레인1퓨전 하. 복합 exocytosis 간주 됩니다 화물 릴리스2의 가장 광범위 한 모드는 SGs에서를 포함 하 여 화물의 빠른 분 비에 대 한 수 플라즈마 멤브레인에서 원심. 모두 외 분 비 및 내 분 비 세포3,,45,6,7,8,9에서 복합 exocytosis 문서화 되었습니다. 면역 세포입니다. 면역 세포, 호 산 구는10,,1112 및 호 중구13, 같은 복합 exocytosis 수 같은 침입 병원 체를 죽 일 하는 데 필요한 중재자의 신속 하 고 강력한 출시 박테리아 또는 기생충입니다. 타고 난 면역 반응, 알레르기, 및 다른 알레르기 반응14,,1516 미리 저장 된 염증 성 중재자의 효율적인 릴리스에 대 한 복합 exocytosis를 배포 하는 돛대 세포 (MCs) , 17. exocytosis의 다양 한 모드로18,19를 동시에 발생할 수 있습니다, 이후 그것은 실시간으로 그들을 구별 하거나 그들의 각각 융합 기계, 따라서 elucidating 식별 도전 되고있다 그들의 기본 메커니즘입니다.
여기에 우리가 메서드를 기반으로 현재 라이브 셀에 셀의 이미지 로드 FITC-dextran, exocytic 이벤트의 실시간 추적 및 그들의 다른 모드를 구별 하는. 특히, 우리의 메서드 복합 exocytosis의 독점 모니터링 수 있습니다.
FITC dextran 글 루 칸 다 당 류 dextran와 pH에 민감한 fluorophore FITC 켤레입니다. 붙일 레이블된 dextrans micropinocytosis20,21 , macropinocytosis,2223여 셀 입력 표시 되었습니다. Endocytic 구획 리소좀으로 성숙, 그것은 보였다 FITC dextran 명백한 저하 없이 리소좀 축적. 그러나, FITC는 높은 pH에 민감한 fluorophore24리소좀 루멘은 산 성 때문에, FITC dextran 형광 리소좀24를 도달 하는 즉시 냉각. 따라서, 화물, FITC의 pH 감도 함께 찍은 대상 리소좀으로 dextrans를 설립, 리소좀 exocytosis25,,2627 의 연구에 FITC dextran의 사용을 위한 기초 마련 , 28 , 29.
MCs, 호 중구, 호 산 구는, 세포 독성 T 세포, melanosomes, 및 다른 사람을 포함 한 여러 세포 유형, SGs lysosomal 기능을 표시 하 고 리소좀 관련 세포 (LROs) 또는 분 비 리소좀30,31로 분류 됩니다. . LROs 산 성 luminal pH 때문에, FITC dextran 높은 pH는 LROs의 exteriorization와 관련 된 결과로 그들의 exocytosis 시각화를 사용할 수 있습니다. 실제로, FITC dextran MCs18,,3233exocytosis를 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 이 방법에서는, FITC dextran 세포 배양에 추가, pinocytosis 하 여 셀에 의해 촬영 이며 SGs에 정렬. 그것은 리소좀 때 그들이 셀 내에 SGs에 FITC 형광 침묵 이다. 그러나, 플라즈마 멤브레인 및 외부 환경에 따른 노출 SG 퓨전, 따라 FITC dextran 차릴 SG pH 상승으로 그것의 형광 라이브 셀 현미경 검사 법에 의해 exocytic 이벤트의 간단한 추적 허용. 여기, 우리는 복합 exocytosis의 고유 추적을 사용 하도록이 메서드를 조정.
다른 두 가지 방법은 이전 복합 exocytosis를 추적 하기 위해 사용 되었습니다. 전자 현미경은 exocytosis의 다른 모드의 발생을 제안 하는 exocytic 구조를 특성화 하기 위해 첫 번째 방법입니다. 특히, "분 비 터널" 췌 장 acinar 셀34 에 MCs35,,3637 의 복합 exocytosis의 가설에 상승을 했다. 그러나, 전자 현미경 검사 법의 높은 해상도 융합된 소포를 공개 하는 힘, 그것은 그들의 융해의 역학을 추적할 수 없습니다. 및 따라서 복합 exocytosis 동안 SG 퓨전 또는 다시 캡처한 알갱이의 융합에 대응 여부를 정의할 수 없습니다. 다음 그들의 endocytosis. 살아있는 세포, 원형질 막 커패시턴스11,13,,3839 또는 amperometry의 패치 클램프 측정 등에서 exocytosis를 측정할 수 있는 다른 방법에이 장애물을 극복 미디어의 40 . 그러나, 패치 죄는 특별 한 설정 필요 하며 모든 세포 유형에 적합 하지 않을 수 있습니다. Amperometry 측정 exocytosis 화물 전극에 매우 가까이에 출시 하는 경우에 추적할 수 있습니다. 따라서, 그것은 뿐만 아니라 허용 exocytosis의 실시간 추적 하지만 그것 또한 모든 셀에서 데이터의 신속 하 고 간단한 수집 수 있습니다 이러한 방법을 통해 이점을 제공 라이브 셀 이미징 사용 하 여 합니다.
라이브 셀 현미경 검사 법에 의해 FITC dextran의 추적 또한 몇 가지 장점을 다른 라이브 셀 이미징 기반 방법을 제공합니다. 예를 들어 널리 사용 되는 방법은 세포 형광 SG 프로브 로드 또는 표현 하는 형광 단백질 태그 SG 화물 또는 막 단백질26,41, 의 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)는 42 , 43.이 방법의 강점 독점적으로 (여기 라고도 발자국), 원형질 막 가까이 발생 하는 이벤트를 모니터링 하는 기능에 따라서 exocytic 이벤트. 그러나, 이것은 또한이 방법의 단점은 셀 일부분만 하는 coverglass에 인접 한 현미경 렌즈에 가까운 수44군데 있기 때문에. 같은 발자국 실제로 전체 세포 막 표면 표시 하는지 여부를 여전히 미해결45,,4647이다. 이와 관련, 오픈 pinhole와 FITC dextran 등 pH에 민감한 염료 및 표준 형광 현미경 confocal 현미경을 사용 하 여 따라서 해당 셀에 발생 하는 총 exocytic 이벤트를 캡처, 전체 셀의 이미지를 수 있습니다.
전체 셀 이미징 또는 TIRFM 규제 exocytosis를 공부 하는 데 사용 되는 추가 pH에 민감한 기자 SG 화물 또는 SG 막 단백질 phlourin, pH에 민감한 GFP 변종 융합을 포함 합니다. 예로 NPY-phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, 및 synapto phluorin48,49,50,,5152있습니다. 이러한 프로브 식 SGs의 내 생 적인 구성을 더 밀접 하 게 나타낼 수, 그것은 세포의 transfection를 수반 고 따라서 덜 어려운 transfect 세포에 적합 있을 수 있습니다. 따라서 때 세포 공부 transfect 어렵다 또는 여러 게놈 조작이 필요로 하는 실험 조건에서 세포 배양의 FITC-dextran 등으로 간단 하 게 보완 될 수 있습니다 화합물의 사용이 유리 . FITC dextran 또한 제공 하는 이점을 acridine 오렌지 (AO), 라이브 셀 현미경53,54,,5556 여 exocytosis의 추적을 위해 사용 된 또 다른 pH에 민감한 염료 , 57 , 58. 아오 소포 실제 분 비와 일치 하지 않는 거짓 플래시에서 결과27처리의 photolysis를 유도 하기 위해 표시 되었습니다. 반면, FITC dextran 반응성 산소27의 그것의 낮은 사진 유도 된 생산 때문에 아마 더 나은 분 비 이벤트를 반영합니다.
특히, exocytosis 공부에 대 한 다른 접근 방법이입니다 융합 기 공이 과정을 통해 SG에 외부 매체에서 염료의 유입에 추적. 이 경우에 염료 분 비 트리거 함께 외부 매체에 추가 됩니다. 다음, 융합 기 공이 열리면 염료 SG59,60으로 확산. 이 방법의 명확한 이점은 이다 그것 또한 가변 크기의 염료의 사용에 의해 융합 기 공 크기를 예측 하는 기능을 제공 합니다. 예를 들어 서로 다른 분자량 (MW), 다른 fluorophores에 활용 된의 dextrans SG를 관통할 수 있다 dextran의 최대 크기 것 융합 공59, 의 크기에 해당 하는 그것에 의하여 extracellular 염료로 사용할 수 있습니다. 61 , 62 , 63 , 64. 또한,이 방법은 pH에 민감한 프로브를 사용 하 여 필요 하지 않습니다. 그러나, 중요 한 불리가 이다 신호 대 잡음 비는 매우 낮은 이기 때문에 많은 양의 염료는 미디어에 높은 백그라운드에서 발생 하는 이미지의 중.
전반적으로, exocytosis 마커로 FITC dextran 사용 신호 소음 비율, 독성, 동적 추적 및 복잡성 등 이전에 보고 된 방법에 몇 가지 단점을 극복 했다.
여기 우리는 FITC-dextran (여기 라고도 RBL, Eccleston 외 에 의해 주로 설립 RBL-2 H 3 돛대 세포 라인에 복합 exocytosis 모니터의 사용 설명 65 Barsumian 그 외 여러분 에 의해 복제 추가 66)에 면역 글로불린 E (IgE) / 항 원 (Ag) 활성화.

<table><tbody><tr><td>DMEM low glucose</td><td>Biological Inductries</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>12657</td><td></td></tr><tr><td>Pen-strep-nystatin solution</td><td>Biological Inductries</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM solution&amp;nbsp;</td><td>Biological Inductries</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>FITC dextran 150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46946-500MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution B</td><td>Biological Inductries</td><td>03-052-1A</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Top-vacuum filter of 0.22 &amp;micro;m pore size&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 &amp;micro;m pore size</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>Chambered coverglass&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Corning tissue-culture treated culture dishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Anti-DNP monoclonal IgE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8406</td><td></td></tr><tr><td>DNP-HSA (Ag)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661&amp;nbsp;</td><td>Avoid direct light exposure</td></tr><tr><td>Hepes buffer 1M, pH 7.4</td><td>Biological Inductries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>MERK</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BDH Laboratories</td><td>284515V</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>MERK</td><td>1145</td><td></td></tr><tr><td>PIPES dipotassium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-27-3</td><td></td></tr><tr><td>Calcium acetate hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114460-21-8</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium acetate tetrahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>MERK</td><td>6346</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MERK</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>MERK</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MERK</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator&amp;nbsp;</td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope, Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>LSM 5 Pascal, Axiovert 200M</td><td>Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled&lt;br/&gt; airstream incubator</td></tr><tr><td>Confocal microscope, Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800, Axio Observer.Z1 /7</td><td>Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled&lt;br/&gt; airstream incubator</td></tr><tr><td>Confocal microscope, Leica</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td>Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)</td></tr><tr><td>RBL-2H3 cells</td><td></td><td></td><td>RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67</td></tr></tbody></table>

imaging fitc-dextran as a reporter for regulated exocytosis

규제 exocytosis는 화물 분 비과 립 (SGs)에 저장 되어 있는 분 비 방 아 쇠에 대 한 응답에 출시 하는 과정 이다. 규제 exocytosis 세포 커뮤니케이션에 대 한 기본 이며 신경 전달 물질, 호르몬, 염증 중재자 및 세포의 다양 한 다른 화합물의 분 비에 대 한 핵심 메커니즘입니다. 적어도 세 가지 메커니즘 규제 exocytosis 알려져 있다: 전체 exocytosis, 단일 SG 키스 실행 exocytosis, 어디 하나의 SG는 뚜렷이 플라즈마 막으로 퓨즈, 그리고 복합 exocytosis, 플라즈마 막으로 완전히 퓨즈 어디 이전에 또는 플라즈마 막으로 SG 퓨전 후 여러 SGs 서로 융합. 셀에 의해 착수 하는 규제 exocytosis 유형의 자주 분 비 트리거 유형에 의해 결정 됩니다. 그러나, 많은 셀에 단일 분 비 트리거를 활성화할 수 있다 규제 exocytosis의 다중 모드 동시에. 그들의 풍요로 움과 세포 유형 및 종 중요성에도 불구 하 고 분 비의 다른 모드를 결정 하는 메커니즘 크게 확인 되지 않습니다. 규제 exocytosis의 다른 모드를 조사 하 고 있는 주요 과제 중 하나입니다 뿐만 아니라 그들을 별도로 탐험으로 그들 사이 구별에 어려움. 여기 우리가 fluorescein isothiocyanate (FITC)를 사용 하 여 설명-dextran exocytosis 기자 및 라이브 셀 이미징, 규제 exocytosis, 복합 exocytosis에 초점의 다른 경로 구분 하는 견고성에 따라 고 exocytic 이벤트의 기간입니다.

그림 1a 는 개요로 exocytosis를 규제 하 고 exocytic 이벤트의 다양 한 모드를 정리 FITC dextran 기자로 서 행동 수 있습니다 얼마나 나타냅니다. 첫째, 세포 FITC-dextran, pinocytosis에 의해 내 면 고 SGs 정렬와 함께 알을 품는. MCs의 SGs LROs 이기 때문에, 그들의 낮은 pH FITC, 그림과 같이 검은 알갱이의 형광을 따 윈 (A-C, 난). 세포는 간접적인 및 플라즈마 막으로 SGs ?...

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Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

이미징 FITC-dextran 규제 Exocytosis 위한 기자로 서

여기 우리는 규제 exocytosis의 라이브 셀 이미징 방법 선발. 이 메서드는 기자로 서 FITC-dextran, 리소좀과 관련 된 세포에 축적을 활용 합니다. 이 간단한 메서드는 또한 유전자 조작 하기 어려운 셀에 규제 exocytosis의 다른 모드 사이 구별 수 있습니다.

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

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Endocytosis and Exocytosis

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12.5K 조회수.  Tel Aviv University. 여기 우리는 규제 exocytosis의 라이브 셀 이미징 방법 선발. 이 메서드는 기자로 서 FITC-dextran, 리소좀과 관련 된 세포에 축적을 활용 합니다. 이 간단한 메서드는 또한 유전자 조작 하기 어려운 셀에 규제 exocytosis의 다른 모드 사이 구별 수 있습니다.

비디오: Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

TIRF 현미경과 망막 바이폴라 세포 이미징 Exocytosis

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

연구

생물학

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

신경과학

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

이미징 세포 막 상해 및 수리에 관여하는 세포 내 프로세스

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and cell debris, through bulk endocytosis. This pathway plays an essential role in a variety of cellular processes, including the regulation of immune responses and cancer cell metabolism. Given this importance in biological function, examining cell culture conditions can provide valuable information by identifying regulators of this pathway and optimizing conditions to be employed in the discovery of novel therapeutic approaches. The study describes an automated imaging and analysis technique using standard laboratory equipment and a cell imaging multi-mode plate reader for the rapid quantification of the macropinocytic index in adherent cells. The automated method is based on the uptake of high molecular weight fluorescent dextran and can be applied to 96-well microplates to facilitate assessments of multiple conditions in one experiment or fixed samples mounted onto glass coverslips. This approach is aimed at maximizing reproducibility and reducing experimental variation while being both time-saving and cost-effective.

Automated assays using multi-well microplates are advantageous approaches for identifying pathway regulators by allowing the assessment of a multitude of conditions in a single experiment. Here, we have adapted the well-established macropinosome imaging and quantification protocol to a 96-well microplate format and provide a comprehensive outline for automation using a multi-mode plate reader.

형광 표기 매크로피노좀의 정량화를 위한 자동화된 이미징 및 분석

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...

An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes involve lipid membrane-bound sacs called vesicles. Knowledge of the molecular architecture and mechanisms of both is key to understanding normal cell physiology, as well as the disease states that arise when they become defective. This video will first briefly review a few pivotal discoveries in the history of endo- and exocytosis research. Next, some key questions will be examined, followed by a discussion of the prominent methods used to investigate these problems, including cell labeling, fusion assays, and fluorescence imaging. Finally, it will explore current research being conducted by scientists in the field today.

Endocytosis and Exocytosis; Clathrin Coated Pits and SNAREs

내표작용 및 세포외배출 소개

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes ...

이미징 FITC-dextran 규제 Exocytosis 위한 기자로 서

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TIRF 현미경과 망막 바이폴라 세포 이미징 Exocytosis

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

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이미징 세포 막 상해 및 수리에 관여하는 세포 내 프로세스

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

TIRF 현미경을 통해 단일 이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

형광 표기 매크로피노좀의 정량화를 위한 자동화된 이미징 및 분석

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

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이미징 FITC-dextran 규제 Exocytosis 위한 기자로 서

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