이 작품은 프랑스어 근육질 영양 장애 협회 (AFM)에 의해 AD에 건강 보조금 AR055686과 AR060836 및 박사 학위 취득 후 친교의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 이 연구에서 사용 된 세포 이미징 시설은 건강 보조금 HD040677의 국립 연구소에 의해 지원됩니다.

1. 이미징 세포막 수리 대량 사용 (유리 구​​슬) 부상 이 프로토콜은 별도로 부상 세포 치료에 실패하는 사람들을 표시 할 수 있습니다. 세포의이 인구의 양을 세 가지 조건의 사용이 필요합니다 : 1. 테스트 (C1) - 세포는 칼슘 2 +, 2의 존재에 복구 할 수 있습니다. 제어 1 (아무 부상 C2) - 세포는 칼슘 이온의 존재 하에서 배양,하지만 부상하지, 3됩니다. 제어 2 (노 수리 C3)는 - 세포는 칼슘 2 +의 부재에 복구 할 수 있습니다. <ol><li> 세 멸균 커버 슬립에&gt; 50 %의 합류로 세포 성장과 실리콘 O-링에 37 ° C 및 전송의 coverslips에서 PBS와 37 ° C 및 C3에서 CIM 회 C1과 C2를 씻어. </li><li> C1과 C2 또는 PBS에서 C3에 CIM에서 데워진 FITC 덱스 트란 용액 100 μl를 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 수동 틸팅 커버 슬립에 의해 상온에서 커버 슬립에 40 밀리그램의 유리 구슬을 회전에 의해 C1과 C3에 세포막을 손상30 °의 각도로 앞으로 6 ~ 8 시간. 참고 : 가벼운 부상, 따라서 반복 부상을 최소화, 유리 구슬이 균일하게 확산되도록. 샘플 사이 부상의 재현성을 향상시키기 위해, 동시에 비교 될 다른 샘플의 유리 구슬 부상을 수행한다. </li><li> 구슬의 추가 흔들림을 방지, 대기 CO 2에서 37 ° C 배양기에 모두 커버 슬립을 전송하고 수리가 5 분 동안 진행 할 수 있습니다. </li><li> 구슬이 굴러시키지 않고, 37 ℃에서 CIM (C1 및 C2) 또는 PBS (C3)로 세척하여 유리 구슬과 FITC 덱스 트란을 제거 </li><li> 장소는 O 링에 다시 커버 슬립과 C1과 C2 또는 PBS에서 C3에 CIM에서 데워진 리신 고칠 TRITC 덱스 트란 용액 100 μl를 추가합니다. </li><li> 주위 CO 2에서 5 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 데워진 CIM로 두 번 커버 슬립을 세척하고 실온에서 10 분 동안 4 % PFA로 고정합니다. </li><li> PBS로 두 번 세척하고 헥스 염료의 실온에서 2 분 동안 품어. </li><li> 세척 SAMPLES PBS로 2 회, 표면 형광 현미경을 사용하여 장착 매체 및 화상 세포를 사용하여 슬라이드 마운트. </li><li> 배경 빨간색과 녹색의 염색 강도를 결정하고, 모든 샘플 (C1-C3)에 대한 임계 빨간색과 녹색 채널에이 값을 사용하는 C2의 세포를 사용합니다. </li><li> ) 녹색 (부상 및 수리) 및 b) 적색 또는 적색과 녹색 (부상을 모두 포함하지만, C1과 C3 샘플에서) 복구하는 데 실패하는 세포의 수를 점수. </li><li> 백작&gt; (100) 그린의 각 조건에 대한 부상의 모든 세포 (녹색, 적색)의 백분율로 복구하는 데 실패 세포의 일부를 발현하는 세포. </li></ol> 2. 레이저 손상 후 세포의 막 수리의 속도론의 라이브 영상 <ol><li> 데워진 CIM으로 세포를 세척 한 다음 FM 염료와 CIM에 커버 슬립을 넣어. </li><li> 37 ℃에서 무대 위에 배양기에서 홀더에 커버 슬립을 배치 </li><li> 세포막의 1-2 MM 2 지역을 선택하고 대한 조사 &lt;, 펄스 레이저와 10 밀리. 피크 파워 40-50 %로 소프트웨어를 통해 레이저 파워를 감쇄. 최적의 전력이 일치하지만, 치명적 부상을 허용하고이 사용되는 각각의 악기와 세포 라인에 대한 시행 착오에 의해 결정되어야한다. </li><li> 이전에 부상을 시작, 표면 형광 및 시야에 수리, 이미지마다 10 초를 모니터링하고 손상 후 3 ~ 5 분 동안 계속합니다. 참조 : 수리 컨트롤의 반복 PBS의 부상 세포가 FM 염료를 함유하는 2.1-2.4 단계를 반복합니다. </li><li> 수리의 반응 속도를 정량화하기 위해 휴대 FM 염료의 형광을 측정 및 이미징의 과정 동안 강도 (ΔF/F0)의 변화를 플롯. 이 데이터는 각 조건에서 10 셀에 대한 평균과 필요에 따라, 평균 또는 개별 셀의 값으로 그릴 수 있어야합니다. </li></ol> 3. 영상 벌크 (유리 구​​슬) 상해 유도 리소좀 세포 외 유출 샘플은&gt; 50 %로 성장 다음 세포를 포함합류 : 1. 테스트 (C1) - 칼슘 2 +, 2의 존재에 복구 할 수 세포. 제어 1 (C2, 아니 부상) - 세포 손상되거나 차 항체와 함께 배양, 3 어느 쪽도. 제어 2 (C3, 아니 수리) - 칼슘 2 +의 부재에 복구 할 수 세포. <ol><li> 세탁은 37 ° C에서 PBS와 37 ° C 및 C3에서 CIM 회 C1과 C2를 커버 슬립 실리콘 O-링에 전송할 수 있습니다. </li><li> C3에 C1과 C2에 CIM과 PBS에서 데워진 리신 고칠 TRITC 덱스 트란의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 단계 1.3에서와 같이 C1과 C3에 세포막을 손상. </li><li> 구슬의 추가 흔들림을 방지, 대기 CO 2에서 37 ° C 배양기에 모두 커버 슬립을 전송하고 수리가 5 분 동안 진행 할 수 있습니다. </li><li> 다시 세포에 유리 구슬의 더 롤링을 보장하지, 차가운 성장 매체에 커버 슬립을 세척하여 유리 구슬과 TRITC 덱스 트란을 제거합니다. </li><li> 차가운 성장 매체로 두 번 커버 슬립을 씻어 O-링에 전송할 수 있습니다. </li><li> C1과 C3에차가운 완벽한 성장 미디어 쥐 반대로 마우스 램프 1 항체의 100 μl를 추가하고 C2에 감기, 완전 성장 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 항체를 4 ℃에서 30 분 동안 품어 커버 슬립을 결합 수 있도록하려면 </li><li> 차가운 CIM과 커버 슬립을 세 번 세척하고 실온에서 10 분 동안 4 % PFA 모두의 coverslips를 해결하고 CIM으로 배를 씻어. </li><li> 실온에서 15 분 동안 차단 솔루션의 100 μL의 모든 커버 슬립을 품어 </li><li> 4 ℃에서 알렉사 플 루어 100 μL에 15 분 동안 488 안티 쥐의 항체를 모두 커버 슬립을 품어 </li><li> PBS로 두 번 세척하고 훽스트에서 실온에서 2 분 동안 품어. </li><li> PBS로 두 번 세포를 세척, 표면 형광 현미경을 사용하여 설치 미디어 및 이미지를 사용하여 슬라이드에 탑재합니다. </li><li> C2 셀의 이미지를 사용하여 비특이적 배경 빨간색으로 염색 (TRITC 덱스 트란)과 녹색 (알렉사 플 루어 488 항체) 채널을 결정하고 모든 샘플 (C1-C3)의 빨간색과 녹색 채널 임계 값이 배경 염색 값을 사용합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 손상된 세포의 램프 1 염색 (녹색)의 강도를 측정하기 위해 C1과 C3에서&gt; (100) 레드 라벨 ​​세포를 사용합니다. 성공적인 실험을 위해 C3의 세포에있는 램프 1 염색은 C1의 세포에 비해 크게 낮은 것입니다. </li></ol> 4. 셀 멤브레인 손상의 라이브 영상은 세포 내 인신 매매를 트리거 <ol><li> 형광 라벨 (리소좀 8에 대한 예를 들어, CD63-GFP) 또는 형광 염료 (9)를 사용하여 해당 기자를 형질 전환하여 관심의 구획. </li><li> 형광 염료와 라벨 리소좀를 들어, FITC-덱스 트란을 포함하는 성장 매체에 50 %의 합류로 성장 세포를 배양 </li><li> CO 2 인큐베이터 (관심 세포주로 덱스 트란과 충분한 엔도 좀의 표시에 필요한 이상) 덱스 트란 2 시간 동안 endocytosed 할 수 있습니다. </li><li> 수 있도록 데워진 성장 매체와 세포를 세척하고 CO 2 배양기에서 2 시간 동안 그 안에 품어 모든리소좀 축적하는 덱스 트란을 endocytosed. </li><li> 촬영하기 전에 예비 가온 CIM에서 커버 슬립을 씻어 37 ℃에서 무대 위에 인큐베이터에 커버 슬립 홀더에 장착 </li><li> (셀에 걸쳐 이동) 위드 또는 TIRF (세포 표면 및 세포 외 유출에 운동) 이미징을 수행 - FITC 덱스 트란 혼잡이없는 세포가 표시 리소좀 개별 리소좀의 이동과 세포 외 유출 이미징에 이상적입니다. </li><li> 영상 현미경에 대한 TIRF 레이저 정렬 : 사용 60X 또는&gt; 1.45 NA와 100X의 목표를. 제조업체의 접근 방식을 사용하여 사건 TIRF 레이저 빔의 각도를 설정합니다. </li><li> 40~50% 감쇠의 펄스 레이저로, &lt;100 밀리 위해 작은 (1-2 MM 2) 영역을 조사함으로써 세포막을 손상. </li><li> 관심의 세포에서 세포 외 유출의 역학에 따라 최소 2 분 이상 4-6 프레임 / 초에 부상, 이미지 셀 셀에 리소좀의 반응을 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing.">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li><li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site.">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li><li>Miyake, K., McNeil, P. 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B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis.">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 .</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li><li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. 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Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds.">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li><li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li><li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells.">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li><li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. 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K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li><li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+events+at+the+cell+membrane.">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li></ol>

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생체 내에서 세포막 손상으로 인해 생리적 스트레스 요인의 다양성과 여러 가지 실험 방법이 모방하기 위해 개발되었습니다 발생합니다. 이러한 요리를 긁어 또는 좁은 구멍 주사기 9,10 통해 계대에 의해 부착 세포의 세포막을 손상 있습니다. 등의 부상에 따라 세포 현탁액 치유하고 그들이 일반적으로 조직에서와 마찬가지로 세포 외 기질을 준수하지. 이러한 기공 형성 독소의 사...

세포막은 세포와 세포 외 환경 사이의 장벽을 제공함으로써 세포의 무결성을 유지한다. 정상적인 생리 임계 값뿐만 아니라 병원균 침입의 존재를 초과, 화학, 전기, 기계적인 자극이 세포막에 상해에있는 각 결과와이 상처를 복구 이후의 세포 반응을 트리거 할 수 있습니다. 세포막에 이러한 부상을 살아 남기 위해서, 세포 복구를위한 효율적인 메커니즘을 가지고있다. 이 메커니즘은 칼슘 의존하고 다른 사람의 사이에 같은 annexins과 MG53 같은 단백질의 세포 내 인신 매매뿐만 아니라 손상된 세포막 1-7 엔도 좀, 리소좀, 골지체 파생 소포와 미토콘드리아 같은 세포 내 구획을 포함한다. 그러나 손상된 세포막을 복구에 관련된 분자 및 세포 내 일련의 이벤트의 세부 사항이 제대로 이해 남아 있습니다. 세포의 수리 응답은 귀으로 분리 할 수​​ 있습니다LY 늦게 반응. 분 시간 단위로 초 이내에 발생하는 초기 반응은 성공적으로 세포 수리 또는 세포 사망에 이르는 늦게 응답의 성격을 결정하는 데 대단히 중요하다. 대량 생화학 및 세포 분석을 기반으로 엔드 포인트 분석은 수리 분자 및 세포 프로세스의 참여를 설정 도움이있다. 그러나, 셀룰러 인해 복구 응답 이질성 및 신속성으로, 종점 분석법 복구를 초래하는 이벤트의 시퀀스의 운동 및 공간 세부 정보를 제공하지 못한다. 세포막의 부상 제어를 가능하게하고 세포막 수리 및 높은 공간 및 시간적 해상도에 관련된 세포 내 반응을 모니터링 할 수 있도록 접근은 이상적으로 그러한 연구를 위해 적합하다. 여기, 이러한 접근 방법이 제시되었다. 프로토콜의 두 레이저 INJ 따라 세포막 수리의 실시간 동역학 및 생균의 복구 과정과 연관된 세포 내 반응을 모니터링하는 방법을 설명URY. 이러한 라이브 세포 이미징 기반의 분석에 대한 보완으로, 엔드 포인트 분석은 개별 세포와 관련된 세포 내 반응의 모니터링 수리를 위해 인구를 기반으로 측정을 제공하는 기술되었다. 이러한 접근은 세포막 손상에 응답 매매 및 리소좀의 세포 외 유출을 모니터링하는 데 사용 된 그들의 실용성을 입증.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="814" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1387</td>
			<td>Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP410</td>
			<td>Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC dextran (Lysine fixable)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1820</td>
			<td>2 mg/ml in CIM or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC dextran (Lysine fixable)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1818</td>
			<td>2 mg/ml in CIM or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1/10 000 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td>1 &#181;g/&#181;l in CIM or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FD40S</td>
			<td>2 mg/ml in growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMP1&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-19992</td>
			<td>1/300 in growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21470</td>
			<td>1/500 in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petridish</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone O ring</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>1943-33315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holder</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>1943-11111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12001-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MP1400-500H</td>
			<td>Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Sreptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12001-350</td>
			<td>Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5405</td>
			<td>5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Ca2+ and Mg2+ free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12001-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus America, PA</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF illuminator&#160;</td>
			<td>Olympus America, PA</td>
			<td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence illuminator</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato CA</td>
			<td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics, Tucson, AZ</td>
			<td>Evolve 512 EMCCD&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition and anaysis software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td>
			<td>Slidebook 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed laser</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td>
			<td>Ablate (3iL13)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokaihit, Japan</td>
			<td>INUBG2ASFP-ZILCS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair

치유 손상균의 능력은 기본적인 세포 과정이지만 치유 손상균 개인 세포 및 분자 메커니즘은 불완전하게 이해되어있다. 여기에 분석은 현지화 된 손상 후 배양 된 세포의 치유의 능력과 반응 속도를 모니터링 할 수 있도록 서술되어있다. 첫 번째 프로토콜은 동시에 수백 개의 셀의 세포막 수리 능력을 평가하기 위해 엔드 포인트 기반의 접근 방식에 대해 설명합니다. 제 2 프로토콜은 펄스 레이저와 지역화 부상 다음 개별 세포의 세포막 수리의 동력학을 모니터하는 실시간 이미징 방법을 설명한다. 치유 부상 세포가 상해의 사이트에 특정 단백질과 세포 내 구획의 매매를 수반으로, 세 번째 프로토콜은 동시에 부상 수백 개의 셀에 하나의 인신 매매 사건 (리소좀 세포 외 유출)을 평가하기 위해 위의 엔드 포인트 기반의 접근 방식을 사용하고 마지막 프로토콜을 설명합니다 TIRF의 마이크로 함께 펄스 레이저 부상의 사용에 대해 설명높은 공간과 시간적 해상도로 부상 세포에서 각각의 세포 내 구획의 역학을 모니터에 복사합니다. 여기 프로토콜 세포막 수리 배양 근육 세포의 리소좀 세포 외 유출 간의 링크를 연구하는 이러한 접근법의 사용을 설명하지만, 이들은 임의의 다른 부착 배양 세포 및 선택의 세포 내 구획을 위해 등을 적용 할 수있다.

단일 세포 이미징 여기에 설명 된 프로토콜은 능력과 반응 속도 세포막 수리 (프로토콜 1, 2) 및 복구하는 동안 세포 내 인신 매매와 리소좀의 융합 모니터링 할 수 있습니다 (프로토콜 3, 4). 프로토콜 1은 모든 부상 세포를 표시하고 복구하는 데 실패하는 부상 세포를 식별 할 수있는 대량 분석을 보여줍니다. 손상되지 않은 세포 (그림 1A)가 레이블을 유지하면서, F...

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Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

치유 손상균의 처리는 세포막 손상의 사이트에 특정 단백질과 세포 내 구획의 매매를 포함한다. 이 프로토콜은 이러한 프로세스를 모니터링하는 분석을 설명합니다.

이미징 세포 막 상해 및 수리에 관여하는 세포 내 프로세스

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.9K 조회수.  Children's National Medical Center.  치유 손상균의 처리는 세포막 손상의 사이트에 특정 단백질과 세포 내 구획의 매매를 포함한다. 이 프로토콜은 이러한 프로세스를 모니터링하는 분석을 설명합니다. 

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Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

사용 MG53 - 중재 세포막 수리의 시각화 생체내에과 체외에서 시스템

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

연구

생물학

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

쥐의 장간막의 Exteriorization : Angiogenesis에 관련된 세포 역학을 조사하기위한 모델

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

CA의 역할을 평가하기위한 영상 분석을 라이브<sup&gt; 2 +</sup기공 형성 독소 상처의 수리에&gt;와 Sphingomyelinase

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 슈퍼 해상도 영상

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

세포 전 형 구조의 슈퍼 해상도 라이브 세포 이미징

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light represents a revolutionary advance for studies of the neural basis of behavior. However, a downside of this development is its tendency to focus investigators on a very small number of &#8220;designer&#8221; organisms (e.g., C. elegans and Drosophila), potentially negatively impacting the pursuit of comparative studies across many species, which is needed for identifying general principles of network function. The present article illustrates how optical recording with voltage-sensitive dyes in the brains of non-transgenic gastropod species can be used to rapidly (i.e., within the time course of single experiments) reveal features of the functional organization of their neural networks with single-cell resolution. We outline in detail the dissection, staining, and recording methods used by our laboratory to obtain action potential traces from dozens to ~150 neurons during behaviorally relevant motor programs in the CNS of multiple gastropod species, including one new to neuroscience &#8211; the nudibranch Berghia stephanieae. Imaging is performed with absorbance voltage-sensitive dyes and a 464-element photodiode array that samples at 1,600 frames/second, fast enough to capture all action potentials generated by the recorded neurons. Multiple several-minute recordings can be obtained per preparation with little to no signal bleaching or phototoxicity. The raw optical data collected through the methods described can subsequently be analyzed through a variety of illustrated methods. Our optical recording approach can be readily used to probe network activity in a variety of non-transgenic species, making it well suited for comparative studies of how brains generate behavior.

This protocol presents a method for imaging neuronal population activity with single-cell resolution in non-transgenic invertebrate species using absorbance voltage-sensitive dyes and a photodiode array. This approach enables a rapid workflow, wherein imaging and analysis can be pursued over the course of a single day.

비 트랜스제닉 무척추 동물의 단일 신경 해상도를 가진 네트워크 역학을 기록하기위한 포토다이오드 기반 광학 이미징

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, propulsive contractions. Regular RP contractions rely on pacemaker activity, which originates from the most proximal region of the RP at the pelvis-kidney junction (PKJ). Due to the difficulty in accessing and preserving intact preparations of the PKJ, most investigations on RP pacemaking have focused on single-cell electrophysiology and Ca2+ imaging experiments. Although important revelations on RP pacemaking have emerged from such work, these experiments have several intrinsic limitations, including the inability to accurately determine cellular identity in mixed suspensions and the lack of in situ imaging of RP pacemaker activity. These factors have resulted in a limited understanding of the mechanisms that underlie normal rhythmic RP contractions. In this paper, a protocol is described to prepare intact segments of mouse PKJ using a vibratome sectioning technique. By combining this approach with mice expressing cell-specific reporters and genetically encoded Ca2+ indicators, investigators may be able to more accurately study the specific cell types and mechanisms responsible for peristaltic RP contractions that are vital for normal urine transport.

The goal of this protocol is to isolate intact pacemaker regions of the mouse renal pelvis using vibratome sectioning. These sections can then be used for in situ Ca2+ imaging to elucidate Ca2+ transient properties of pacemaker cells and other interstitial cells in vibratome slices.

진동 및 이미징 라이브, 진동 절제에 의해 마우스 신장 골반의 그대로 페이스 메이커 영역

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

전기 생리 학적 연구를위한 성체, 청소년, 애벌레 및 배아 제브라 피쉬에서 심장 및 혈관 평활근 세포 분리

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first immune cells to reach the site of inflammation and to participate in the innate immune response during infection or tissue damage. So far, neutrophil migration has been successfully visualized using various in vitro experimental systems based on uniform stimulation, or confined migration under agarose, or micro-fluidic channels. However, these models do not recapitulate the complex microenvironment that neutrophils encounter in vivo. The development of multiphoton microscopy (MPM)-based techniques, such as intravital subcellular microscopy (ISMic), offer a unique tool to visualize and investigate neutrophil dynamics at subcellular resolutions under physiological conditions. In particular, the ear of a live anesthetized mouse provides an experimental advantage to follow neutrophil interstitial migration in real-time due to its ease of accessibility and lack of surgical exposure. ISMic provides the optical resolution, speed, and depth of acquisition necessary to track both cellular and, more importantly, subcellular processes in 3D over time (4D). Moreover, multi-modal imaging of the interstitial microenvironment (i.e., blood vessels, resident cells, extracellular matrix) can be readily accomplished using a combination of transgenic mice expressing select fluorescent markers, exogenous labeling via fluorescent probes, tissue intrinsic fluorescence, and second/third harmonic generated signals. This protocol describes 1) the preparation of neutrophils for adoptive transfer into the mouse ear, 2) different settings for optimal sub-cellular imaging, 3) strategies to minimize motion artifacts while maintaining a physiological response, 4) examples of membrane remodeling observed in neutrophils using ISMic, and 5) a workflow for the quantitative analysis of membrane remodeling in migrating neutrophils in vivo.

Neutrophil migration relies on the rapid and continuous remodeling of the plasma membrane in response to chemoattractant and its interactions with the extracellular microenvironment. Described herein is a procedure based on Intravital Subcellular Microscopy to investigate the dynamic of membrane remodeling in neutrophils injected in the ear of anesthetized mice.

생리학적 조건에서 세포하막 리모델링을 조사하기 위해 마우스 피부의 호중구 이동을 이미징합니다.

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...