이 작품은 NIH 감독의 새로운 혁신 상 수상 (제에 의해 투자 되었다 DP2HD091793)입니다. NSF 대학원 연구 장학 프로그램 (보조금 번호 Q.D.M.는 지원 DGE-1650044). B.A.H는 국립 연구소의 건강 GT BioMAT 훈련 그랜트 보너스 번호 5T32EB006343에서 조오지 아 기술 대통령의 친교에 의해 지원 됩니다. G.A.K.는 버로우즈 환영 기금에서 과학적인 인터페이스에서 경력 수상을 보유 하고있다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

연구원의 교육 기관에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 기관 승인 다음 동물 실험을 수행 하는 데 필요한입니다. 또한, 표준 동물 보호 시설 (예를 들어, 챔버, 무 균 동물 후드, anesthetization, isofluorane 챔버 및 윤리적인 끝점 euthanization에 대 한 공동2 챔버)는이 제대로 수행 하는 데 필요한 실험입니다. 특별 한 교육 및 이러한 시설 지원 하나의 기관에 생리 연구 실험실 (PRL) 하 여 제공할 수 있습니다. 모든 동물 일 조지아 공대에 IACUC에 의해 승인 되었다 (프로토콜: A14100).
1. 산화 철 나노 입자 (IONP) 합성
참고: 안전: 전체 산화 철 나노 입자 합성 개인 보호 장비를 사용 하 여 수행 해야 합니다 및 아래 화학 증기 두건.
<ol><li>15 mL 원뿔 튜브에 1 mL의 30%는 30 분 동안 얼음 양동이에 수산화 암모늄을 진정.</li>
	<li>250 mL 삼각 플라스 크 이온된 수로 세척 하 고 10 mL 두 배 증류수 (ddH2O) 추가. 볶음/열 접시에 얼음 목욕에서 플라스 크의 외부 잠수함 DdH2O는 플라스 크에 흐름 N2 가스에 플라스틱 피 펫을 사용 합니다. N2 deoxygenate 15 분간 거품이 있다.</li>
	<li>Dextran의 224 µmol (4.5 그램) 무게 (분자량 (MW) = 20 kDa) 50 mL 원뿔 튜브로. Dextran를 포함 하 여 혼합물의 최종 볼륨은 20 mL를 h 조2O를 추가 합니다. 소용돌이 dextran을 해산 하기 위해 적극적 으로입니다.</li>
	<li>Iron(III) 염화 물 hexahydrate의 290 µmol (78.5 그램) 무게를 다 십시오, dextran 솔루션 및 분해 하는 소용돌이를 추가 합니다.</li>
	<li>0.2 µ m 필터를 통해 결과 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	<li>Deoxygenated 물 9 mL에 1 mL 냉장 수산화 암모늄을 전송 합니다. 4 ° c.에 반환</li>
	<li>산소 무료 ddH2O의 1 mL에 용 해 그리고 0.2 µ m 필터를 통해 필터링, iron(II) 염화 물 tetrahydrate의 367 µmol (73.0 그램) 무게.</li>
	<li>250 mL 삼각 플라스 크에 dextran-iron(III) 솔루션을 전송 하 고 얼음에 15 분 동안 N2 와 deoxygenate. 1600 rpm 회전 막대 자석 저 어 혼합.</li>
	<li>균질 성 질소 분위기를 만들려면 고무 격 막으로 플라스 크 모자. 펑크는 18와 심장 플라스 크에 흐름 N2 바늘 게이지. 흐름 콘센트로 별도 18 게이지 바늘을 삽입 합니다.</li>
	<li>1 mL 주사기, 1600 rpm에서 자기 저 어 바 교 반 dextran-iron(III) 솔루션 iron(II) 솔루션의 467 µ L를 추가 합니다. Iron(III) iron(II)의이 비율 결과 균형된 반응 자 철 광, 또는 Fe3O4를 생산할 예정 이다.</li>
	<li>냉장 희석 수산화 암모늄 dropwise nucleation 과정21시작 하 철 (II)-철 (III)-dextran 솔루션에 추가 합니다. 있는지 확인 하십시오 각 방울 다른 놓기 전에 잘 섞는다. 수산화 암모늄의 1-2 mL의 추가 후 반응 완료.</li>
	<li>N2 의 흐름을 중지 하 고 제거 고무 격 막. 얼음 목욕을 제거 하 고 솔루션을 저 어 하면서 따뜻한 물 목욕을 바꿉니다. 솔루션의 온도가 75 ° C에 도달 하면 확인 하 고 75 분 동안 품 어.</li>
	<li>볶음/핫 플레이트에서 플라스 크를 제거 하 고 이중 거친 입자를 제거 하 0.2 µ m 다음 0.1 µ m 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	<li>버퍼는 ddH2O, 초과 dextran 매우 점성 해야 솔루션에서 제거 하려면 100 kDa 분자량 차단 (m.w.c.o.) 집중 장치를 사용 하 여 입자를 교환 합니다. 통해 흐름 여전히 어두운 이후에 2-3 회전, 필터 수 있습니다 깨진 있다 나타내는 경우 필터를 교체 합니다.<ol>
<li>에 스핀 필터와 exchange를 버퍼링 하 고, 4800 X g에서 4 ° C에서 15 분간 원심 하 고 흐름을 통해 삭제 한 IONP 솔루션에 새 버퍼를 추가할. 3-5 회 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분 광 광도 계/플레이트 리더를 사용 하 여 나노 입자의 농도 결정 합니다. 받아 400 nm 및 사용이이 파장에 IONP의 어 금 니 absorptivity에서 흡 광도 측정 (ε = 2.07 × 106 c m-1 M-1) IO 입자의 농도 결정 하.</li>
	<li>DdH2O (일반적으로 전체 볼륨은 3 mL) 10 mg/ml IONPs resuspend 그리고 화학 호환성에 대 한이 단계에 대 한 폴 리 프로필 렌 튜브를 사용할 수 있는지 확인. 1.6 볼륨 5 M NaOH의 추가 다음 epichlorohydrin의 0.65 볼륨을 추가 합니다. 엄격 하 게 crosslink dextran 12 시간 동안 실내 온도에 판 통에 혼합.</li>
	<li>18-게이지 바늘 20 mL 주사기를 사용 하 여 IONP 솔루션 50 kDa m.w.c.o. 투 석 막으로 전송. 4 L ddH2O로 투 석 막 놓고 H2O 몇 시간 (2-3 시간 마다)를 교체 합니다. 밤새 품 어.</li>
	<li>측정 농도 IONPs 5 mg/mL (1.15 단계 참조). 20% (v/v)에 도달 하는 IONPs의 표면 aminate 하 > 12 시간 동안 실내 온도에 흔들어 수산화 암모늄을 추가 합니다. 버퍼 교환 30 kDa m.w.c.o. 필터 (1.14 참조)를 사용 하 여.</li>
	<li>2.5-3.5 mL 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC, 젤 여과 열에 대 한 재료의 표 참조)에 의해 최종 정화 하기 전에 아래로 볼륨을 조정 합니다.</li>
	<li>동적 산란 (DL)을 사용 하 여 IONPs (예상된 범위 10-100 nm, 평균 크기 40-50 nm)의 유체역학 반지름을 결정. Aliquoting는 베트에 희석된 IONP 샘플 X 100의 1 mL에 의해 이렇게 기계에 놓고 제조업체의 소프트웨어를 사용 하 여 측정을 합니다. 참고: IONPs의 전체 인구는 DL 측정에 의해 10와 100 nm 사이 있을 것입니다 하지만 대부분의 인구는 평균 직경 40-50 nm에서 범위는 주위. 한 크기 범위를 제한 하 고 싶다면, 하나 더 다른 직경을 가진 분수를 분리 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 수 있습니다. 4 ° c.에 IONPs는 저장 한다</li>
</ol>2. 펩 티 드 디자인, IONP, 및 생체 외에서 유효성 검사를 활용
<ol><li>Fluorescein isothiocyanate (FITC) 같은 터미널 N 형광 기자와 C 터미널 시스테인 잔류물 thiol 중재 커플링 허용 대상 protease에 대 한 (예를 들어, 핵심 시설 또는 상업적으로) 펩 티 드 기질을 음성 합성. 참고: 경우 MMP9에 대 한이 연구, 사용 펩 티 드는 FITC-PLGVRGK-C, k고양이/Km ~ 105 M-1의-1x 2.0.</li>
	<li>약 0.5 밀리 그램 (1 mg/mL)에서 IONP 및 버퍼를 커플링으로 버퍼 교환 수 (50mm 나트륨 붕 산 염 1 m EDTA, pH = 8.5) 10 kDa m.w.c.o. 스핀 필터링 (단계 1.14 참조)를 사용 하 여.</li>
	<li>Dimethylformamide ~ 30 mg/mL의 농도 도달 (DMF)에서 Succinimidyl iodoacetate (SIA)를 녹이 고 500 SIA:IONP의 몰 비율에 IONP을 SIA를 추가할. 참고: SIA는 한 heterobifunctional 교차 하는 링커 펩 티 드 기질에 sulfhydryl 그룹에 IONPs에 아민의 커플링을 중재 하.</li>
	<li>어둠 속에서 실 온에서 1 ~ 2 시간 품 어. 만약 하룻밤을 떠나, 4 ° c.에 품 어</li>
	<li>Exchange unreacted SIA를 제거 하려면 버퍼를 커플링으로 10 kDa m.w.c.o. 회전 필터를 사용 하 여 버퍼 (단계 1.14 참조).</li>
	<li>1 mg/mL (0.5 mL 해결책)을 최종 제품 솔루션을가지고. 20 kDa thiol 종료 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 어 금 니 비율 20:1 (말뚝: IONP)의 90:1 (펩 티 드: IONP)의 어 금 니 비율에 대 한 관심의 펩 티 드 믹스. 이 펩 티 드 못 솔루션 IONP 믹스.</li>
	<li>최고 속도, 형광 분자의 photobleaching를 방지 하기 위해 호 일에 관을 덮고에 판 통에 실 온에서 하룻밤를 품 어.</li>
	<li>L-시스테인 500: 1 (C:IONP) 어떤 unreacted SIA 분자를 중화의 어 금 니 비율에 추가 합니다. 실 온에서 최고 속도로 통에 25 ° C에서 1 시간 동안 품 어.</li>
	<li>FPLC를 통해 정화 (1.1.19 참조). 분 광 광도 계를 사용 하 여 샘플 솔루션의 흡 광도 측정 하 고 다음에 따라 비율을 펩 티 드: IONP. 정화, 후 PBS에 4 ° C에서 1 mg/mL에서 제품을 저장 합니다.<ol>
<li>400에서 샘플 용액의 흡 광도 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 (샘플, 400) 및 인 488 fluorophore 사용에 대 한 최대 흡 광도 파장 nm FITC (샘플, 488)에 대 한. 재고 아민 IONP 솔루션 같은 두 파장에서의 흡 광도 측정 (400 nm, 488 nm)는 각각NP, 400와 NP, 488로표시 됩니다.</li>
		<li>방정식 1과 2는 정규화 된 계산에 A400 488 값을 사용 합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq1.jpg">공식 1 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq2.jpg">공식 2</li>
		<li>400 와488 샘플의 정규화 된 값을 나타냅니다. 펩 티 드: IONP 방정식 3의 비율을 계산 하기 위해이 값을 사용 합니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq3.jpg">식 3</li>
		<li>어디 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq4.jpg"> 와 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq5.jpg"> 는 IONP와, fluorophore의 어 금 니 absorptivities는 각각. 이 입자에 대 한 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq4.jpg"> x 106 M-1c m-1 와 FITC 2.06 = <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq5.jpg"> = 72000 M-1c m-1, 그래서의 값 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq6.jpg"> 28.75 이어야 한다. 전형적인 펩 티 드: IONP 비율 50: 1 20: 1의 범위에 있어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>생체 외에서 분열 분석 결과 수행 하 여 시험의 기능을 확인 합니다.<ol>
<li>PBS와 (1 %BSA), 펩 티 드의 200 nM 농도와 18 µ L 나노 솔루션. 관심의 효소의 2 µ L 믹스 (MMP9; 0.1-1 mg/mL).</li>
		<li>형광 측정 1 시간 동안 37 ° C에서 플레이트 리더에서 품 어 (적절 한 여기 및 방출 파장을 사용 하는 485 nm와 528 nm FITC에 대 한 각각) 분열을 모니터링 하는 데 1-2 분 마다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Nanosensors 및 소변 감지 암 관리
참고:에 대 한 자세한 내용은 예제 모델, 우리의 이전 보고서13참조.
<ol><li>96 잘 접시의 상단에 원통형 슬리브를 확보 하 여 소변 컬렉션에 대 한 대사 케이지를 만듭니다. 소변 수집 하는 동안 소매와 동물의 탈출을 방지 하기 위해 페 트리 접시 커버 커버 안에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>멸 균 식 염 수에 펩 티 드에 의해 3000 mg/kg (50 ~ µmol)의 농도에 nanosensors를 포함 하는 주입 솔루션 (200 µ L 최대 볼륨)를 준비 합니다.</li>
	<li>여성, 8 주 오래 된, 누드 마우스 ~ 100-300의 부담에이 종이 식 LS174T colorectal 종양을 베어링에 m m3, 약 발생 해야 하는 하루 10, 꼬리 정 맥 주입을 통해 nanosensor 솔루션 관리. 주입 직후 대사 케이지로 마우스를 배치 하 고 각 마우스에 대 한 주입의 시간 합니다.</li>
	<li>주사 후 60-90 분, 96 잘 접시에서 원통형 슬리브를 제거 합니다. 마우스를 억제 하 고 접시에 남아 있는 소변을 무효화 하는 쥐를 유도 하기 위해 방광에 약간의 압력을 적용. 모든 소변 (200-500 µ L)를 수집 합니다.</li>
	<li>Immunoprecipitation 소변에서 FITC를 정화 하 고 감도 증가 하 여 소변 샘플을 분석 합니다. 마그네틱 구슬 안티 FITC 항 체와 결합 하 여 사용 합니다.<ol>
<li>먼저, 3 회 코팅 버퍼와 자석 구슬의 25 mg을 세척 하 고 225 µ L를 최종 볼륨을가지고. 참고: 각 시간과 각 약 20 mL는 필요한 신선한 코팅 버퍼 (0.1 M 나트륨 붕 산 염, pH 9.5), 블로킹 버퍼 (PBS, BSA는 0.5%, 0.05% 트윈 20, pH 7.4), 그리고 세척 버퍼 (PBS, 0.1 %BSA, 0.05% 트윈 20, pH 7.4)을 만들기 위해 중요 하다.</li>
		<li>안티-FITC (5 mg/mL)의 200 µ L과 황산 암모늄 (3 M)의 200 µ L를 추가 합니다. 회전자에 37 C에서 16-24 시간 동안 품 어.</li>
		<li>자석 분리기에 솔루션을 추가, 제거는 상쾌한, 625 대체 <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq7.jpg"> </img>Λ, 버퍼 및 37 C에서 밤새 품 어. 다음 워시 버퍼와 3 번 세척 하 고 1.25 mL 워시 버퍼에 저장.</li>
		<li>마그네틱 구슬 (20 mg/mL)의 5 µ L와 소변의 2 µ L를 품 어와 총 볼륨 PBS 가진 50 µ L가지고 (0.01% 트윈 20). 60 분 동안 품 어.</li>
		<li>50 µ L PBS로 두번 세척 (0.01% 트윈 20) 각 세척 후 자기 비즈를 수집 하는 자석 분리기를 사용 하 여.</li>
		<li>5% 빙 초 산의 32.5 µ L로 두 번 elute. 35 µ L 2 M 트라이앵글 ~ 7의 최종 pH를 달성 하기 위해 함께 풀링된 차입 (70 µ L)를 중화.</li>
		<li>플레이트 리더에서 읽기 ( 재료의 표참조) 소변 형광 계량에 적합 한 여기 및 방출 파장에. 무료 fluorophore의 알려진된 농도의 사다리에 대 한 형광 기자의 농도 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+spatiotemporally-responsive+nanosensors+of+in+vivo+protease+activity.">Photoactivated spatiotemporally-responsive nanosensors of in vivo protease activity.</a> ACS Nano. 9 (12), 11708-11717 (2015).</li><li>Palmacci, S., Josephson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+polysaccharide+covered+superparamagnetic+oxide+colloids.">Synthesis of polysaccharide covered superparamagnetic oxide colloids.</a> US patent. , (1991).</li><li>Choi, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+clearance+of+nanoparticles.">Renal clearance of nanoparticles.</a> Nature Biotechnology. 25 (10), 1165-1170 (2007).</li><li>Harris, T. J., von Maltzahn, G., Derfus, A. M., Ruoslahti, E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+actuation+of+nanoparticle+self-assembly.">Proteolytic actuation of nanoparticle self-assembly.</a> Angewandte Chemie (International edition in English). 45 (19), 3161-3165 (2006).</li><li>Kwon, E. J., Dudani, J. S., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+tumour-penetrating+nanosensors+of+protease+activity.">Ultrasensitive tumour-penetrating nanosensors of protease activity.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).</li><li>Villanueva, J., Nazarian, A., Lawlor, K., Tempst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Peptidase+activities+in+complex+proteomes+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Monitoring Peptidase activities in complex proteomes by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1167-1183 (2009).</li><li>Villanueva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+exoprotease+activities+confer+tumor-specific+serum+peptidome+patterns.">Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome patterns.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (1), 271-284 (2006).</li></ol>

박사 Kwong 공동 설립자 이며 Glympse 바이오, 제품 개발은 컨설턴트가이 문서에서 설명 하는 연구와 관련 된 역할을 한다. 이 연구는 그의 개인 재정 상태에 영향을 수 있습니다. 이 계약 조건 검토 되었고 조지아 공대의 상충 정책에 따라 승인

이 방법은 나노 코어를 활용 하는 프로 테아 제 기판으로 구성 된 활동 기반 nanosensors의 개발을 설명 합니다. 쪼개진된 펩 티 드 제품은 5 nm23 및 비 침 투 적인 신호를 생성 하는 소변으로 필터의 신장 크기 여과 한계 보다 작은 때문에 분해 분열의 이벤트 "pharmacokinetic 스위치", 불리는. 따라서, 그것은 유체역학 반경 5 보다 큰 나노 입자 또는 운반대를 사용 하는 것이 중요, 아무것?...

프로 테아 제 펩 티 드 결합의 가수분해를 전문화 하 고 항상성, 질병1, allostasis, 등 많은 생물 학적 과정을 중요 한 통제가 다기능 효소는. 프로 테아 제 활동의 변경된 상태 질병, 암 및 심장 혈관 질병, 프로 테아 제 임상 생체2,3으로 개발을 위한 매력적인 후보자를 만드는 등의 다양 한 상관 되었다. 또한, 프로 테아 제 활동은 별개에 기능적으로 연결 된 pathogeneses, 환자 결과 및4질병 예 후. 넓게, 바이오 센서 개발 되었습니다 다양 한 생물 학적 현상을 감지 하 고 질병, 암, 신경 질환, 전자 등 처리5,6,,78 , 9. 좀 더 구체적으로, 기판 기반 효소 센서 프로 테아 제 활동을 감지 하 여 진단 이미징10 fluorogenic 프로브 포함 개발 되었고 isotopically 펩 티 드 기질에 시험관 에 대 한 표시 질량 분석11탐지입니다. 또한, 활동 기반 프로브 개발 되었습니다, 바인딩하거나 대상 프로 테아 제12수정 기판 같은 영역을 포함 하는. 이 방법으로 활성 사이트 수정 하며 분석 조직, vivo에서 응용 프로그램을 제한의 수확 때 대상 효소 저해 irreversibly는. 그러나, 효소 활동의 규칙은 내 생 억제제의 존재와 같은 다른 생물 학적 활동의 문맥에 크게 의존 하기 때문에 효소 활동을 vivo에서, 감각을 중요 하다.
이 작품의 목표는 소변에서 측정 신호를 생산 하 여 효소 활동에서 vivo에서 검색 활동 기반 nanosensors의 공식 설명. 이 플랫폼 기능 biomarker로 dysregulated 프로 테아 제 활동을 사용 하 여 암과 같은 복잡 한 질병을 판별 하는 비 침범 성 진단으로 사용 됩니다. 산화 철 나노 입자 (IONP) 효소 기질에 활용 된 nanosensor 플랫폼에 의하여 이루어져 있다. 이러한 기판 프로 테아 제 쪼개 기판 때 출시 되는 형광 기자에 의해 종료 됩니다. 이러한 IONPs vivo에서순환, 질병 사이트, 지역화 및 기판 활성 질병 관련 된 프로 테아 제에 노출. 분열, 후 형광 기자 출시 되 고, 그들의 작은 크기로 인해 필터링 됩니다 소변에는 IONP에 uncleaved 기판 시체에 남아 있는 동안. 따라서, 효소 활동에서 vivo에서 증가 소변 (그림 1)에서 리포터의 높은 농도 발생 합니다. 우리의 플랫폼 소변 검사 이기 때문에, 아무 이미징 플랫폼 필수 이며 진단 신호는 소변에서 풍성 하 게.
이 플랫폼은 다양 한 질병 암, 섬유 증, 혈전 증13,14등을 감지 하 설계 될 수 있다. 여기 우리가 설명 하는 매트릭스 metallopeptidase 9 (MMP9)에서 고도 검색 하기 위해 nanosensors의 디자인 활동으로 대 장 암의 바이오 마커. 대 장 암은 약된 136,800 새로운 사례와 2014 혼자1550,300 죽음, 미국에서 암 사망의 두 번째 주요 원인이. 대 장 종양 세포 생성 MMP9 전이16뿐만 아니라 악성 진행, 매트릭스 저하, 운전 표시 되었습니다. 또한, 우리 문학17에서 MMP9에 대 한 적합 한 펩 티 드 기질 (PLGVRGK) 확인. 조기 암 발견 및 저가 포인트의 케어 진단13,,1418,19,20,21이 플랫폼을 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57937/57937fig1.jpg"> 그림 1: Nanosensor 활동 비보의 도식. Nanosensors는 본문을 통해 순환 하 고 질병의 사이트 지역화. 다음, 질병 관련 된 프로 테아 제 펩 티 드 기질 IONPs를 제시한 다니엘. 쪼개진된 파편의 크기 신장 클리어런스, 그들이 소변에서 지역화 하는 원인에 대 한 수 있습니다. 동물 소변 후 그들의 기자 분자에 의해이 펩 티 드 파편을 분석할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57937/57937fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">0.2 &#181;m syringe filters</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">4652</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">18G needle</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">89134-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">15 mL conicals</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">89039-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">250 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">89000-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Stir bar</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">58949-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Hot Plate/Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">97042-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">97064-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Albumin from Bovine Serum (BSA)</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:233px;">A13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Iron (II) chloride tetrahydrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">44939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Epichlorohydrin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">45340-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">DMF</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">D4551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Ammonium Hydroxide</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">320145-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sodium Hydroxide pellets</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">221465-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sodium Borate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">168149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Tris base</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Dextran</td>
			<td style="width:171px;">Pharmacosmos</td>
			<td>5510 0020 9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Amicon 15 mL 10k filters, 24 pk</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:233px;">UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Amicon 15 mL 30k filters, 24 pk</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:233px;">UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Amicon 15 mL 100k filters, 24 pk</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:233px;">UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Zetasizer Nano ZS</td>
			<td style="width:171px;">Malvern Panalytical</td>
			<td style="width:233px;">NanoZS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette</td>
			<td style="width:171px;">LifeTech</td>
			<td style="width:233px;">66130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Dynabeads MyOne Tosylactivated</td>
			<td style="width:171px;">LifeTech</td>
			<td style="width:233px;">65501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">SIA</td>
			<td style="width:171px;">Life Tech</td>
			<td style="width:233px;">22349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">PEG 20k</td>
			<td style="width:171px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:233px;">MPEG-SH-20K-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fluorescein Antibody [2A3]</td>
			<td style="width:171px;">GeneTex</td>
			<td style="width:233px;">GTX10257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Hiload 16/600 superdex 200</td>
			<td style="width:171px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:233px;">45-002-490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Plate Reader</td>
			<td style="width:171px;">Fisher</td>
			<td style="width:233px;">BTCYT5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BD Insulin Syringes</td>
			<td style="width:171px;">Fisher</td>
			<td style="width:233px;">NC0872854</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanosensors to detect protease activity in vivo for noninvasive diagnostics

프로 테아 제는 다기능 효소 펩 티 드 결합의 가수분해에서 전문 및 항상성 등 allostasis 광범위 한 생물 학적 과정을 제어. 또한, dysregulated 프로 테아 제 활동 pathogenesis 드라이브 이며 암;과 같은 질병의 기능 바이오 마커 따라서, 효소 활동에서 vivo에서 감지 하는 능력은 생물 의학 진단에 대 한 임상 관련 정보를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표 조사 효소 활동에서 vivo에서 소변에서 정량 신호를 생산 하 여 nanosensors를 만드는 것입니다. 이러한 효소 nanosensors의 두 가지 구성 요소 구성: 나노 및 기판. 대상 질병 사이트에 순환 반감기 및 기판 납품 증가를 나노 기능. 기판은 짧은 펩 티 드 순서 (6-8 AA), 대상 효소 또는 프로 테아의 그룹에 구체적으로 설계 된입니다. 기판은 나노 입자의 표면에 활용 하 고 탐지를 위한 형광 표식 같은 기자에 의해 종료 됩니다. Dysregulated 프로 테아 제 펩 티 드 기질 다니엘로 기자 프로 테아 제 활동의 한 biomarker로 정량화에 대 한 소변으로 필터링 됩니다. 여기는 매트릭스 metalloproteinase 9 (MMP9), 종양 진행 및 전이, 대 장 암 마우스 모델에서의 검출에 대 한 관련 된에 대 한 nanosensor의 건설에 설명 합니다.

대부분의 인구는 IONPs의 평균 직경 40-50 nm에서 범위는 주위에 이다. Pegylation, 후이 크기 범위는 약 6 시간13 생체 내에서 의 순환 반감기 ( 그림 2a참조). 특정 크기 범위에 대 한 선택 하 고 싶다면 하나 하나 다른 직경을 가진 IONP 분수 분리 하 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 수 있습니다. 가장 하 여 나노 입자 dextran의 외부...

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Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

프로 테아 제는 기본적인 생물학 과정 및 암과 같은 복잡 한 질병의 dysregulated 프로 테아 제 활동 드라이브 진행에 관련 된 단단히 규제 효소. 이 방법의이 목표 호스트 소변에서 감지 하 고 질병을 차별 분열 신호를 생산 하 여 효소 활동에서 vivo에서 측정 하는 nanosensors를 만드는 것입니다.

Nanosensors 프로 테아 제 활동에 감지 비보에 비 침 투 적인 진단에 대 한

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

nanosensors-to-detect-protease-activity-vivo-for-noninvasive

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

16.1K 조회수.  Georgia Tech College of Engineering and Emory School of Medicine. 프로 테아 제는 기본적인 생물학 과정 및 암과 같은 복잡 한 질병의 dysregulated 프로 테아 제 활동 드라이브 진행에 관련 된 단단히 규제 효소. 이 방법의이 목표 호스트 소변에서 감지 하 고 질병을 차별 분열 신호를 생산 하 여 효소 활동에서 vivo에서 측정 하는 nanosensors를 만드는 것입니다.

비디오: Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

연구

생체공학

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein activity and have diverse roles in many biological processes. For example, SUMO covalently modifies a large number or proteins with important roles in many cellular processes, including cell-cycle regulation, cell survival and death, DNA damage response, and stress response 1-5. SENP, as SUMO-specific protease, functions as an endopeptidase in the maturation of SUMO precursors or as an isopeptidase to remove SUMO from its target proteins and refresh the SUMOylation cycle 1,3,6,7.
The catalytic efficiency or specificity of an enzyme is best characterized by the ratio of the kinetic constants, kcat/KM. In several studies, the kinetic parameters of SUMO-SENP pairs have been determined by various methods, including polyacrylamide gel-based western-blot, radioactive-labeled substrate, fluorescent compound or protein labeled substrate 8-13. However, the polyacrylamide-gel-based techniques, which used the "native" proteins but are laborious and technically demanding, that do not readily lend themselves to detailed quantitative analysis. The obtained kcat/KM from studies using tetrapeptides or proteins with an ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) or AMC (7-amino-4-methylcoumarin) fluorophore were either up to two orders of magnitude lower than the natural substrates or cannot clearly differentiate the iso- and endopeptidase activities of SENPs.
Recently, FRET-based protease assays were used to study the deubiquitinating enzymes (DUBs) or SENPs with the FRET pair of cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP) 9,10,14,15. The ratio of acceptor emission to donor emission was used as the quantitative parameter for FRET signal monitor for protease activity determination. However, this method ignored signal cross-contaminations at the acceptor and donor emission wavelengths by acceptor and donor self-fluorescence and thus was not accurate.
We developed a novel highly sensitive and quantitative FRET-based protease assay for determining the kinetic parameters of pre-SUMO1 maturation by SENP1. An engineered FRET pair CyPet and YPet with significantly improved FRET efficiency and fluorescence quantum yield, were used to generate the CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substrate 16. We differentiated and quantified absolute fluorescence signals contributed by the donor and acceptor and FRET at the acceptor and emission wavelengths, respectively. The value of kcat/KM was obtained as (3.2 &plusmn; 0.55) x107 M-1s-1 of SENP1 toward pre-SUMO1, which is in agreement with general enzymatic kinetic parameters. Therefore, this methodology is valid and can be used as a general approach to characterize other proteases as well.

Quantitative FRET F&#246;rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

A novel method involving quantitative analysis of FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer) signals is described for studying enzyme kinetics. KM and kcat were obtained for the hydrolysis of the catalytic domain of SENP1 (SUMO/Sentrin specific protease 1) to pre-SUMO1 (Small Ubiquitin-like MOdifier). The general principles of this quantitative-FRET-based protease kinetic study can be applied to other proteases.

정량은 SENP1 단백 분해 효소 반응 속도론 결정에 대해 (포스터 공명 에너지 전송) 분석 안달

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

전체 피부 결함 모델은 생체의 혈관 신생을 평가하기<em&gt; 생체</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient's cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

질병 진단을위한 휴대용 이미징 및 분석과 결합 자기 부상

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.

Calorespirometry:에 대 한 강력 하 고, 비 침 투 적인 접근 세포 에너지 대사를 조사

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

엄밀한 포함의 고정 및 스테인드, 전체, 마이크로 단층에 의해 섹션-무료 3D 조직학에 대 한 밀리미터 단위 표본

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes have the potential to serve as biomarkers for disease diagnosis and to monitor disease progression and treatment response. However, most exosome analysis procedures require exosome isolation and purification steps, which are usually time-consuming and labor-intensive, and thus of limited utility in clinical settings. This report describes a rapid procedure to analyze specific biomarkers on the outer membrane of exosomes without requiring separate isolation and purification steps. In this method, exosomes are captured on the surface of a slide by exosome-specific antibodies and then hybridized with nanoparticle-conjugated antibody probes specific to a disease. After hybridization, the abundance of the target exosome population is determined by analyzing low-magnification dark-field microscope (LMDFM) images of the bound nanoparticles. This approach can be easily adopted for research and clinical use to analyze membrane-associated exosome biomarkers linked to disease.

Clinical translation of exosome-derived biomarkers for diseased and malignant cells is hindered by the lack of rapid and accurate quantification methods. This report describes the use of low-magnification dark-field microscope images to quantify specific exosome subtypes in small volume serum or plasma samples.

종양 유래 엑 소 솜을 정량화 하는 나노 플라즈마-강화 된 산란 및 저 배율 현미경 이미징 사용

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes ...

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models is crucial both to better understand the pathological mechanisms of these diseases and identify new therapeutic targets and strategies. To be pertinent, an in vitro model must reproduce the pathological features of a human disease. However, in the context of neurodegenerative disease, a relevant in vitro model should provide neural cell replacement as a valuable therapeutic opportunity. 
Such a model would not only allow screening of therapeutic molecules but also can be used to optimize neural protocol differentiation [for example, in the context of transplantation in Parkinson's disease (PD)]. This study describes two in vitro protocols of 1) human glioblastoma development within a human neural organoids (NO) and 2) neuron dopaminergic (DA) differentiation generating a three-dimensional (3D) organoid. For this purpose, a well-standardized protocol was established that allows the production of size-calibrated neurospheres derived from human embryonic stem cell (hESC) differentiation. The first model can be used to reveal molecular and cellular events occurring during in glioblastoma development within the neural organoid, while the DA organoid not only represents a suitable source of DA neurons for cell therapy in Parkinson's disease but also can be used for drug testing.

This study introduces and describes protocols to derive two specific human neural organoids&#160;as a relevant and accurate model for studying 1) human glioblastoma development within human neural organoids exclusively in humans and 2) neuron dopaminergic differentiation generating a three-dimensional organoid.

뇌암과 신경 퇴행성 질환을 연구하기위한 인간의 신경 오르가노이드

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...