Name: nanosensors to detect protease activity in vivo for noninvasive diagnostics
Uploaded: 2018-07-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics at JoVE.com

이 작품은 NIH 감독의 새로운 혁신 상 수상 (제에 의해 투자 되었다 DP2HD091793)입니다. NSF 대학원 연구 장학 프로그램 (보조금 번호 Q.D.M.는 지원 DGE-1650044). B.A.H는 국립 연구소의 건강 GT BioMAT 훈련 그랜트 보너스 번호 5T32EB006343에서 조오지 아 기술 대통령의 친교에 의해 지원 됩니다. G.A.K.는 버로우즈 환영 기금에서 과학적인 인터페이스에서 경력 수상을 보유 하고있다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

연구원의 교육 기관에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 기관 승인 다음 동물 실험을 수행 하는 데 필요한입니다. 또한, 표준 동물 보호 시설 (예를 들어, 챔버, 무 균 동물 후드, anesthetization, isofluorane 챔버 및 윤리적인 끝점 euthanization에 대 한 공동2 챔버)는이 제대로 수행 하는 데 필요한 실험입니다. 특별 한 교육 및 이러한 시설 지원 하나의 기관에 생리 연구 실험실 (PRL) 하 여 제공할 수 있습니다. 모든 동물 일 조지아 공대에 IACUC에 의해 승인 되었다 (프로토콜: A14100).
1. 산화 철 나노 입자 (IONP) 합성
참고: 안전: 전체 산화 철 나노 입자 합성 개인 보호 장비를 사용 하 여 수행 해야 합니다 및 아래 화학 증기 두건.
<ol><li>15 mL 원뿔 튜브에 1 mL의 30%는 30 분 동안 얼음 양동이에 수산화 암모늄을 진정.</li>
	<li>250 mL 삼각 플라스 크 이온된 수로 세척 하 고 10 mL 두 배 증류수 (ddH2O) 추가. 볶음/열 접시에 얼음 목욕에서 플라스 크의 외부 잠수함 DdH2O는 플라스 크에 흐름 N2 가스에 플라스틱 피 펫을 사용 합니다. N2 deoxygenate 15 분간 거품이 있다.</li>
	<li>Dextran의 224 µmol (4.5 그램) 무게 (분자량 (MW) = 20 kDa) 50 mL 원뿔 튜브로. Dextran를 포함 하 여 혼합물의 최종 볼륨은 20 mL를 h 조2O를 추가 합니다. 소용돌이 dextran을 해산 하기 위해 적극적 으로입니다.</li>
	<li>Iron(III) 염화 물 hexahydrate의 290 µmol (78.5 그램) 무게를 다 십시오, dextran 솔루션 및 분해 하는 소용돌이를 추가 합니다.</li>
	<li>0.2 µ m 필터를 통해 결과 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	<li>Deoxygenated 물 9 mL에 1 mL 냉장 수산화 암모늄을 전송 합니다. 4 ° c.에 반환</li>
	<li>산소 무료 ddH2O의 1 mL에 용 해 그리고 0.2 µ m 필터를 통해 필터링, iron(II) 염화 물 tetrahydrate의 367 µmol (73.0 그램) 무게.</li>
	<li>250 mL 삼각 플라스 크에 dextran-iron(III) 솔루션을 전송 하 고 얼음에 15 분 동안 N2 와 deoxygenate. 1600 rpm 회전 막대 자석 저 어 혼합.</li>
	<li>균질 성 질소 분위기를 만들려면 고무 격 막으로 플라스 크 모자. 펑크는 18와 심장 플라스 크에 흐름 N2 바늘 게이지. 흐름 콘센트로 별도 18 게이지 바늘을 삽입 합니다.</li>
	<li>1 mL 주사기, 1600 rpm에서 자기 저 어 바 교 반 dextran-iron(III) 솔루션 iron(II) 솔루션의 467 µ L를 추가 합니다. Iron(III) iron(II)의이 비율 결과 균형된 반응 자 철 광, 또는 Fe3O4를 생산할 예정 이다.</li>
	<li>냉장 희석 수산화 암모늄 dropwise nucleation 과정21시작 하 철 (II)-철 (III)-dextran 솔루션에 추가 합니다. 있는지 확인 하십시오 각 방울 다른 놓기 전에 잘 섞는다. 수산화 암모늄의 1-2 mL의 추가 후 반응 완료.</li>
	<li>N2 의 흐름을 중지 하 고 제거 고무 격 막. 얼음 목욕을 제거 하 고 솔루션을 저 어 하면서 따뜻한 물 목욕을 바꿉니다. 솔루션의 온도가 75 ° C에 도달 하면 확인 하 고 75 분 동안 품 어.</li>
	<li>볶음/핫 플레이트에서 플라스 크를 제거 하 고 이중 거친 입자를 제거 하 0.2 µ m 다음 0.1 µ m 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	<li>버퍼는 ddH2O, 초과 dextran 매우 점성 해야 솔루션에서 제거 하려면 100 kDa 분자량 차단 (m.w.c.o.) 집중 장치를 사용 하 여 입자를 교환 합니다. 통해 흐름 여전히 어두운 이후에 2-3 회전, 필터 수 있습니다 깨진 있다 나타내는 경우 필터를 교체 합니다.<ol>
<li>에 스핀 필터와 exchange를 버퍼링 하 고, 4800 X g에서 4 ° C에서 15 분간 원심 하 고 흐름을 통해 삭제 한 IONP 솔루션에 새 버퍼를 추가할. 3-5 회 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분 광 광도 계/플레이트 리더를 사용 하 여 나노 입자의 농도 결정 합니다. 받아 400 nm 및 사용이이 파장에 IONP의 어 금 니 absorptivity에서 흡 광도 측정 (ε = 2.07 × 106 c m-1 M-1) IO 입자의 농도 결정 하.</li>
	<li>DdH2O (일반적으로 전체 볼륨은 3 mL) 10 mg/ml IONPs resuspend 그리고 화학 호환성에 대 한이 단계에 대 한 폴 리 프로필 렌 튜브를 사용할 수 있는지 확인. 1.6 볼륨 5 M NaOH의 추가 다음 epichlorohydrin의 0.65 볼륨을 추가 합니다. 엄격 하 게 crosslink dextran 12 시간 동안 실내 온도에 판 통에 혼합.</li>
	<li>18-게이지 바늘 20 mL 주사기를 사용 하 여 IONP 솔루션 50 kDa m.w.c.o. 투 석 막으로 전송. 4 L ddH2O로 투 석 막 놓고 H2O 몇 시간 (2-3 시간 마다)를 교체 합니다. 밤새 품 어.</li>
	<li>측정 농도 IONPs 5 mg/mL (1.15 단계 참조). 20% (v/v)에 도달 하는 IONPs의 표면 aminate 하 > 12 시간 동안 실내 온도에 흔들어 수산화 암모늄을 추가 합니다. 버퍼 교환 30 kDa m.w.c.o. 필터 (1.14 참조)를 사용 하 여.</li>
	<li>2.5-3.5 mL 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC, 젤 여과 열에 대 한 재료의 표 참조)에 의해 최종 정화 하기 전에 아래로 볼륨을 조정 합니다.</li>
	<li>동적 산란 (DL)을 사용 하 여 IONPs (예상된 범위 10-100 nm, 평균 크기 40-50 nm)의 유체역학 반지름을 결정. Aliquoting는 베트에 희석된 IONP 샘플 X 100의 1 mL에 의해 이렇게 기계에 놓고 제조업체의 소프트웨어를 사용 하 여 측정을 합니다. 참고: IONPs의 전체 인구는 DL 측정에 의해 10와 100 nm 사이 있을 것입니다 하지만 대부분의 인구는 평균 직경 40-50 nm에서 범위는 주위. 한 크기 범위를 제한 하 고 싶다면, 하나 더 다른 직경을 가진 분수를 분리 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 수 있습니다. 4 ° c.에 IONPs는 저장 한다</li>
</ol>2. 펩 티 드 디자인, IONP, 및 생체 외에서 유효성 검사를 활용
<ol><li>Fluorescein isothiocyanate (FITC) 같은 터미널 N 형광 기자와 C 터미널 시스테인 잔류물 thiol 중재 커플링 허용 대상 protease에 대 한 (예를 들어, 핵심 시설 또는 상업적으로) 펩 티 드 기질을 음성 합성. 참고: 경우 MMP9에 대 한이 연구, 사용 펩 티 드는 FITC-PLGVRGK-C, k고양이/Km ~ 105 M-1의-1x 2.0.</li>
	<li>약 0.5 밀리 그램 (1 mg/mL)에서 IONP 및 버퍼를 커플링으로 버퍼 교환 수 (50mm 나트륨 붕 산 염 1 m EDTA, pH = 8.5) 10 kDa m.w.c.o. 스핀 필터링 (단계 1.14 참조)를 사용 하 여.</li>
	<li>Dimethylformamide ~ 30 mg/mL의 농도 도달 (DMF)에서 Succinimidyl iodoacetate (SIA)를 녹이 고 500 SIA:IONP의 몰 비율에 IONP을 SIA를 추가할. 참고: SIA는 한 heterobifunctional 교차 하는 링커 펩 티 드 기질에 sulfhydryl 그룹에 IONPs에 아민의 커플링을 중재 하.</li>
	<li>어둠 속에서 실 온에서 1 ~ 2 시간 품 어. 만약 하룻밤을 떠나, 4 ° c.에 품 어</li>
	<li>Exchange unreacted SIA를 제거 하려면 버퍼를 커플링으로 10 kDa m.w.c.o. 회전 필터를 사용 하 여 버퍼 (단계 1.14 참조).</li>
	<li>1 mg/mL (0.5 mL 해결책)을 최종 제품 솔루션을가지고. 20 kDa thiol 종료 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 어 금 니 비율 20:1 (말뚝: IONP)의 90:1 (펩 티 드: IONP)의 어 금 니 비율에 대 한 관심의 펩 티 드 믹스. 이 펩 티 드 못 솔루션 IONP 믹스.</li>
	<li>최고 속도, 형광 분자의 photobleaching를 방지 하기 위해 호 일에 관을 덮고에 판 통에 실 온에서 하룻밤를 품 어.</li>
	<li>L-시스테인 500: 1 (C:IONP) 어떤 unreacted SIA 분자를 중화의 어 금 니 비율에 추가 합니다. 실 온에서 최고 속도로 통에 25 ° C에서 1 시간 동안 품 어.</li>
	<li>FPLC를 통해 정화 (1.1.19 참조). 분 광 광도 계를 사용 하 여 샘플 솔루션의 흡 광도 측정 하 고 다음에 따라 비율을 펩 티 드: IONP. 정화, 후 PBS에 4 ° C에서 1 mg/mL에서 제품을 저장 합니다.<ol>
<li>400에서 샘플 용액의 흡 광도 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 (샘플, 400) 및 인 488 fluorophore 사용에 대 한 최대 흡 광도 파장 nm FITC (샘플, 488)에 대 한. 재고 아민 IONP 솔루션 같은 두 파장에서의 흡 광도 측정 (400 nm, 488 nm)는 각각NP, 400와 NP, 488로표시 됩니다.</li>
		<li>방정식 1과 2는 정규화 된 계산에 A400 488 값을 사용 합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq1.jpg">공식 1 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq2.jpg">공식 2</li>
		<li>400 와488 샘플의 정규화 된 값을 나타냅니다. 펩 티 드: IONP 방정식 3의 비율을 계산 하기 위해이 값을 사용 합니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq3.jpg">식 3</li>
		<li>어디 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq4.jpg"> 와 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq5.jpg"> 는 IONP와, fluorophore의 어 금 니 absorptivities는 각각. 이 입자에 대 한 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq4.jpg"> x 106 M-1c m-1 와 FITC 2.06 = <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq5.jpg"> = 72000 M-1c m-1, 그래서의 값 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq6.jpg"> 28.75 이어야 한다. 전형적인 펩 티 드: IONP 비율 50: 1 20: 1의 범위에 있어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>생체 외에서 분열 분석 결과 수행 하 여 시험의 기능을 확인 합니다.<ol>
<li>PBS와 (1 %BSA), 펩 티 드의 200 nM 농도와 18 µ L 나노 솔루션. 관심의 효소의 2 µ L 믹스 (MMP9; 0.1-1 mg/mL).</li>
		<li>형광 측정 1 시간 동안 37 ° C에서 플레이트 리더에서 품 어 (적절 한 여기 및 방출 파장을 사용 하는 485 nm와 528 nm FITC에 대 한 각각) 분열을 모니터링 하는 데 1-2 분 마다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Nanosensors 및 소변 감지 암 관리
참고:에 대 한 자세한 내용은 예제 모델, 우리의 이전 보고서13참조.
<ol><li>96 잘 접시의 상단에 원통형 슬리브를 확보 하 여 소변 컬렉션에 대 한 대사 케이지를 만듭니다. 소변 수집 하는 동안 소매와 동물의 탈출을 방지 하기 위해 페 트리 접시 커버 커버 안에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>멸 균 식 염 수에 펩 티 드에 의해 3000 mg/kg (50 ~ µmol)의 농도에 nanosensors를 포함 하는 주입 솔루션 (200 µ L 최대 볼륨)를 준비 합니다.</li>
	<li>여성, 8 주 오래 된, 누드 마우스 ~ 100-300의 부담에이 종이 식 LS174T colorectal 종양을 베어링에 m m3, 약 발생 해야 하는 하루 10, 꼬리 정 맥 주입을 통해 nanosensor 솔루션 관리. 주입 직후 대사 케이지로 마우스를 배치 하 고 각 마우스에 대 한 주입의 시간 합니다.</li>
	<li>주사 후 60-90 분, 96 잘 접시에서 원통형 슬리브를 제거 합니다. 마우스를 억제 하 고 접시에 남아 있는 소변을 무효화 하는 쥐를 유도 하기 위해 방광에 약간의 압력을 적용. 모든 소변 (200-500 µ L)를 수집 합니다.</li>
	<li>Immunoprecipitation 소변에서 FITC를 정화 하 고 감도 증가 하 여 소변 샘플을 분석 합니다. 마그네틱 구슬 안티 FITC 항 체와 결합 하 여 사용 합니다.<ol>
<li>먼저, 3 회 코팅 버퍼와 자석 구슬의 25 mg을 세척 하 고 225 µ L를 최종 볼륨을가지고. 참고: 각 시간과 각 약 20 mL는 필요한 신선한 코팅 버퍼 (0.1 M 나트륨 붕 산 염, pH 9.5), 블로킹 버퍼 (PBS, BSA는 0.5%, 0.05% 트윈 20, pH 7.4), 그리고 세척 버퍼 (PBS, 0.1 %BSA, 0.05% 트윈 20, pH 7.4)을 만들기 위해 중요 하다.</li>
		<li>안티-FITC (5 mg/mL)의 200 µ L과 황산 암모늄 (3 M)의 200 µ L를 추가 합니다. 회전자에 37 C에서 16-24 시간 동안 품 어.</li>
		<li>자석 분리기에 솔루션을 추가, 제거는 상쾌한, 625 대체 <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq7.jpg"> </img>Λ, 버퍼 및 37 C에서 밤새 품 어. 다음 워시 버퍼와 3 번 세척 하 고 1.25 mL 워시 버퍼에 저장.</li>
		<li>마그네틱 구슬 (20 mg/mL)의 5 µ L와 소변의 2 µ L를 품 어와 총 볼륨 PBS 가진 50 µ L가지고 (0.01% 트윈 20). 60 분 동안 품 어.</li>
		<li>50 µ L PBS로 두번 세척 (0.01% 트윈 20) 각 세척 후 자기 비즈를 수집 하는 자석 분리기를 사용 하 여.</li>
		<li>5% 빙 초 산의 32.5 µ L로 두 번 elute. 35 µ L 2 M 트라이앵글 ~ 7의 최종 pH를 달성 하기 위해 함께 풀링된 차입 (70 µ L)를 중화.</li>
		<li>플레이트 리더에서 읽기 ( 재료의 표참조) 소변 형광 계량에 적합 한 여기 및 방출 파장에. 무료 fluorophore의 알려진된 농도의 사다리에 대 한 형광 기자의 농도 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+spatiotemporally-responsive+nanosensors+of+in+vivo+protease+activity.">Photoactivated spatiotemporally-responsive nanosensors of in vivo protease activity.</a> ACS Nano. 9 (12), 11708-11717 (2015).</li><li>Palmacci, S., Josephson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+polysaccharide+covered+superparamagnetic+oxide+colloids.">Synthesis of polysaccharide covered superparamagnetic oxide colloids.</a> US patent. , (1991).</li><li>Choi, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+clearance+of+nanoparticles.">Renal clearance of nanoparticles.</a> Nature Biotechnology. 25 (10), 1165-1170 (2007).</li><li>Harris, T. J., von Maltzahn, G., Derfus, A. M., Ruoslahti, E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+actuation+of+nanoparticle+self-assembly.">Proteolytic actuation of nanoparticle self-assembly.</a> Angewandte Chemie (International edition in English). 45 (19), 3161-3165 (2006).</li><li>Kwon, E. J., Dudani, J. S., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+tumour-penetrating+nanosensors+of+protease+activity.">Ultrasensitive tumour-penetrating nanosensors of protease activity.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).</li><li>Villanueva, J., Nazarian, A., Lawlor, K., Tempst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Peptidase+activities+in+complex+proteomes+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Monitoring Peptidase activities in complex proteomes by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1167-1183 (2009).</li><li>Villanueva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+exoprotease+activities+confer+tumor-specific+serum+peptidome+patterns.">Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome patterns.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (1), 271-284 (2006).</li></ol>

박사 Kwong 공동 설립자 이며 Glympse 바이오, 제품 개발은 컨설턴트가이 문서에서 설명 하는 연구와 관련 된 역할을 한다. 이 연구는 그의 개인 재정 상태에 영향을 수 있습니다. 이 계약 조건 검토 되었고 조지아 공대의 상충 정책에 따라 승인

이 방법은 나노 코어를 활용 하는 프로 테아 제 기판으로 구성 된 활동 기반 nanosensors의 개발을 설명 합니다. 쪼개진된 펩 티 드 제품은 5 nm23 및 비 침 투 적인 신호를 생성 하는 소변으로 필터의 신장 크기 여과 한계 보다 작은 때문에 분해 분열의 이벤트 "pharmacokinetic 스위치", 불리는. 따라서, 그것은 유체역학 반경 5 보다 큰 나노 입자 또는 운반대를 사용 하는 것이 중요, 아무것?...

프로 테아 제 펩 티 드 결합의 가수분해를 전문화 하 고 항상성, 질병1, allostasis, 등 많은 생물 학적 과정을 중요 한 통제가 다기능 효소는. 프로 테아 제 활동의 변경된 상태 질병, 암 및 심장 혈관 질병, 프로 테아 제 임상 생체2,3으로 개발을 위한 매력적인 후보자를 만드는 등의 다양 한 상관 되었다. 또한, 프로 테아 제 활동은 별개에 기능적으로 연결 된 pathogeneses, 환자 결과 및4질병 예 후. 넓게, 바이오 센서 개발 되었습니다 다양 한 생물 학적 현상을 감지 하 고 질병, 암, 신경 질환, 전자 등 처리5,6,,78 , 9. 좀 더 구체적으로, 기판 기반 효소 센서 프로 테아 제 활동을 감지 하 여 진단 이미징10 fluorogenic 프로브 포함 개발 되었고 isotopically 펩 티 드 기질에 시험관 에 대 한 표시 질량 분석11탐지입니다. 또한, 활동 기반 프로브 개발 되었습니다, 바인딩하거나 대상 프로 테아 제12수정 기판 같은 영역을 포함 하는. 이 방법으로 활성 사이트 수정 하며 분석 조직, vivo에서 응용 프로그램을 제한의 수확 때 대상 효소 저해 irreversibly는. 그러나, 효소 활동의 규칙은 내 생 억제제의 존재와 같은 다른 생물 학적 활동의 문맥에 크게 의존 하기 때문에 효소 활동을 vivo에서, 감각을 중요 하다.
이 작품의 목표는 소변에서 측정 신호를 생산 하 여 효소 활동에서 vivo에서 검색 활동 기반 nanosensors의 공식 설명. 이 플랫폼 기능 biomarker로 dysregulated 프로 테아 제 활동을 사용 하 여 암과 같은 복잡 한 질병을 판별 하는 비 침범 성 진단으로 사용 됩니다. 산화 철 나노 입자 (IONP) 효소 기질에 활용 된 nanosensor 플랫폼에 의하여 이루어져 있다. 이러한 기판 프로 테아 제 쪼개 기판 때 출시 되는 형광 기자에 의해 종료 됩니다. 이러한 IONPs vivo에서순환, 질병 사이트, 지역화 및 기판 활성 질병 관련 된 프로 테아 제에 노출. 분열, 후 형광 기자 출시 되 고, 그들의 작은 크기로 인해 필터링 됩니다 소변에는 IONP에 uncleaved 기판 시체에 남아 있는 동안. 따라서, 효소 활동에서 vivo에서 증가 소변 (그림 1)에서 리포터의 높은 농도 발생 합니다. 우리의 플랫폼 소변 검사 이기 때문에, 아무 이미징 플랫폼 필수 이며 진단 신호는 소변에서 풍성 하 게.
이 플랫폼은 다양 한 질병 암, 섬유 증, 혈전 증13,14등을 감지 하 설계 될 수 있다. 여기 우리가 설명 하는 매트릭스 metallopeptidase 9 (MMP9)에서 고도 검색 하기 위해 nanosensors의 디자인 활동으로 대 장 암의 바이오 마커. 대 장 암은 약된 136,800 새로운 사례와 2014 혼자1550,300 죽음, 미국에서 암 사망의 두 번째 주요 원인이. 대 장 종양 세포 생성 MMP9 전이16뿐만 아니라 악성 진행, 매트릭스 저하, 운전 표시 되었습니다. 또한, 우리 문학17에서 MMP9에 대 한 적합 한 펩 티 드 기질 (PLGVRGK) 확인. 조기 암 발견 및 저가 포인트의 케어 진단13,,1418,19,20,21이 플랫폼을 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57937/57937fig1.jpg"> 그림 1: Nanosensor 활동 비보의 도식. Nanosensors는 본문을 통해 순환 하 고 질병의 사이트 지역화. 다음, 질병 관련 된 프로 테아 제 펩 티 드 기질 IONPs를 제시한 다니엘. 쪼개진된 파편의 크기 신장 클리어런스, 그들이 소변에서 지역화 하는 원인에 대 한 수 있습니다. 동물 소변 후 그들의 기자 분자에 의해이 펩 티 드 파편을 분석할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57937/57937fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m syringe filters</td><td>VWR</td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>18G needle</td><td>VWR</td><td>89134-024</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conicals</td><td>VWR</td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyer flask</td><td>VWR</td><td>89000-362</td><td></td></tr><tr><td>Stir bar</td><td>VWR</td><td>58949-006</td><td></td></tr><tr><td>Hot Plate/Magnetic Stirrer</td><td>VWR</td><td>97042-634</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>VWR</td><td>97064-482</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from Bovine Serum (BSA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A13100</td><td></td></tr><tr><td>Iron (III) chloride hexahydrate</td><td>Sigma</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Iron (II) chloride tetrahydrate</td><td>Sigma</td><td>44939</td><td></td></tr><tr><td>Epichlorohydrin</td><td>Sigma</td><td>45340-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Hydroxide</td><td>Sigma</td><td>320145-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide pellets</td><td>Sigma</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Borate</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>168149-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>PBS tablets</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0020 9006</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 15 mL 10k filters, 24 pk</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 15 mL 30k filters, 24 pk</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 15 mL 100k filters, 24 pk</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoZS</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette</td><td>LifeTech</td><td>66130</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Tosylactivated</td><td>LifeTech</td><td>65501</td><td></td></tr><tr><td>SIA</td><td>Life Tech</td><td>22349</td><td></td></tr><tr><td>PEG 20k</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-20K-1g</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Antibody [2A3]</td><td>GeneTex</td><td>GTX10257</td><td></td></tr><tr><td>Hiload 16/600 superdex 200</td><td>GE Healthcare</td><td>45-002-490</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader</td><td>Fisher</td><td>BTCYT5M</td><td></td></tr><tr><td>BD Insulin Syringes</td><td>Fisher</td><td>NC0872854</td><td></td></tr></tbody></table>

nanosensors to detect protease activity in vivo for noninvasive diagnostics

프로 테아 제는 다기능 효소 펩 티 드 결합의 가수분해에서 전문 및 항상성 등 allostasis 광범위 한 생물 학적 과정을 제어. 또한, dysregulated 프로 테아 제 활동 pathogenesis 드라이브 이며 암;과 같은 질병의 기능 바이오 마커 따라서, 효소 활동에서 vivo에서 감지 하는 능력은 생물 의학 진단에 대 한 임상 관련 정보를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표 조사 효소 활동에서 vivo에서 소변에서 정량 신호를 생산 하 여 nanosensors를 만드는 것입니다. 이러한 효소 nanosensors의 두 가지 구성 요소 구성: 나노 및 기판. 대상 질병 사이트에 순환 반감기 및 기판 납품 증가를 나노 기능. 기판은 짧은 펩 티 드 순서 (6-8 AA), 대상 효소 또는 프로 테아의 그룹에 구체적으로 설계 된입니다. 기판은 나노 입자의 표면에 활용 하 고 탐지를 위한 형광 표식 같은 기자에 의해 종료 됩니다. Dysregulated 프로 테아 제 펩 티 드 기질 다니엘로 기자 프로 테아 제 활동의 한 biomarker로 정량화에 대 한 소변으로 필터링 됩니다. 여기는 매트릭스 metalloproteinase 9 (MMP9), 종양 진행 및 전이, 대 장 암 마우스 모델에서의 검출에 대 한 관련 된에 대 한 nanosensor의 건설에 설명 합니다.

대부분의 인구는 IONPs의 평균 직경 40-50 nm에서 범위는 주위에 이다. Pegylation, 후이 크기 범위는 약 6 시간13 생체 내에서 의 순환 반감기 ( 그림 2a참조). 특정 크기 범위에 대 한 선택 하 고 싶다면 하나 하나 다른 직경을 가진 IONP 분수 분리 하 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 수 있습니다. 가장 하 여 나노 입자 dextran의 외부...

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Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

프로 테아 제는 기본적인 생물학 과정 및 암과 같은 복잡 한 질병의 dysregulated 프로 테아 제 활동 드라이브 진행에 관련 된 단단히 규제 효소. 이 방법의이 목표 호스트 소변에서 감지 하 고 질병을 차별 분열 신호를 생산 하 여 효소 활동에서 vivo에서 측정 하는 nanosensors를 만드는 것입니다.

Nanosensors 프로 테아 제 활동에 감지 비보에 비 침 투 적인 진단에 대 한

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

16.2K 조회수.  Georgia Tech College of Engineering and Emory School of Medicine. 프로 테아 제는 기본적인 생물학 과정 및 암과 같은 복잡 한 질병의 dysregulated 프로 테아 제 활동 드라이브 진행에 관련 된 단단히 규제 효소. 이 방법의이 목표 호스트 소변에서 감지 하 고 질병을 차별 분열 신호를 생산 하 여 효소 활동에서 vivo에서 측정 하는 nanosensors를 만드는 것입니다.

비디오: Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using electrophoresis through a resolving gel embedded with a degradable substrate. This method differs from traditional gel zymography in that a quenched fluorogenic peptide is covalently incorporated into the resolving gel instead of full length proteins, such as gelatin or casein. Use of the fluorogenic peptides enables direct detection of proteolytic activity without additional staining steps. Enzymes within the biological samples cleave the quenched fluorogenic peptide, resulting in an increase in fluorescence. The fluorescent signal in the gels is then imaged with a standard fluorescent gel scanner and quantified using densitometry. The use of peptides as the degradable substrate greatly expands the possible proteases detectable with zymographic techniques.

Here, we present a detailed protocol for a modified zymographic technique in which fluorescent peptides are used as the degradable substrate in place of native proteins. Electrophoresis of biological samples in fluorescent peptide zymograms enables detection of a wider range of proteases than previous zymographic techniques.

형광 성 펩 티 드 Zymography에 의해 프로 테아 제 활동의 탐지

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

연구

암 연구학

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

생화학

Engineering Intracellular Protein Sensors in Mammalian Cells

Proteins can function as biomarkers of pathological conditions, such as neurodegenerative diseases, infections or metabolic syndromes. Engineering cells to sense and respond to these biomarkers may help the understanding of molecular mechanisms underlying pathologies, as well as to develop new cell-based therapies. While several systems that detect extracellular proteins have been developed, a modular framework that can be easily re-engineered to sense different intracellular proteins was missing.
Here, we describe a protocol to implement a modular genetic platform that senses intracellular proteins and activates a specific cellular response. The device operates on intracellular antibodies or small peptides to sense with high specificity the protein of interest, triggering the transcriptional activation of output genes, through a TEV protease (TEVp)-based actuation module. TEVp is a viral protease that selectively cleaves short cognate peptides and is widely used in biotechnology and synthetic biology for its high orthogonality to the cleavage site. Specifically, we engineered devices that recognize and respond to protein-biomarkers of viral infections and genetic diseases, including mutated huntingtin, NS3 serine-protease, Tat and Nef proteins to detect Huntington&#8217;s disease, hepatitis C virus (HCV) and human immunodeficiency virus (HIV) infections, respectively. Importantly, the system can be hand tailored for the desired input-output functional outcome, such as fluorescent readouts for biosensors, stimulation of antigen presentation for immune response, or initiation of apoptosis to eliminate unhealthy cells.

Here, we present a protocol for engineering genetically-encoded intracellular protein sensor-actuator(s). The device specifically detects target proteins through intracellular antibodies (intrabodies) and responds by switching on gene transcriptional output. A general framework is built to rapidly replace intrabodies, enabling rapid detection of any desired protein, without altering the general architecture.

Proteins can function as biomarkers of pathological conditions, such as neurodegenerative diseases, infections or metabolic syndromes. Engineering cells ...

유전학

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

핵산 프로브를 이용한 뉴클레아제 활성의 운동 스크리닝

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

단백 분해 효소의 활동을 확인하는 프로 테아제 형광 검출 키트의 사용

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

생물학

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

바이오 상호 작용을 검출 하는 β-lactamase 기반 Conductimetric 바이오 센서 분석 결과의 사용

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

생체공학

Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical challenge. Among the ~600 proteases encoded by the human genome, neutrophil serine proteases (NSPs) are thoroughly investigated for their involvement in the onset and progression of inflammatory conditions including respiratory diseases. Uniquely, secreted NSPs not only diffuse within extracellular fluids but also localize to plasma membranes. During neutrophil extracellular trap (NETs) formation, NSPs become an integral part of the secreted chromatin. Such complex behavior renders the understanding of NSPs pathophysiology a challenging task. Here, detailed protocols are shown to visualize, quantify and discriminate free and membrane-bound neutrophil elastase (NE) and cathepsin G (CG) activities in sputum samples. NE and CG are NSPs whose activities have pleiotropic roles in the pathogenesis of cystic fibrosis (CF) and chronic obstructive pulmonary disease (COPD): they promote tissue remodeling, regulate downstream immune responses and correlate with lung disease severity. The protocols show how to separate fluid and cellular fraction, as well as the isolation of neutrophils from human sputum for enzymatic activity quantification via small-molecule F&#246;rster resonance energy transfer-based (FRET) reporters. To gather specific insights into the relative role of NE and CG activities, a FRET readout can be measured by different technologies: i) in vitro plate reader measurements allow for high-throughput and bulk detection of protease activity; ii) confocal microscopy spatiotemporally resolves membrane-bound activity at the cell surface; iii) small-molecule FRET flow cytometry enables for the rapid evaluation of anti-inflammatory treatments via single-cell protease activity quantification and phenotyping. The implementation of such methods opens the doors to explore NSPs pathobiology and their potential as biomarkers of disease severity for CF and COPD. Given their standardization potential, their robust readout and simplicity of transfer, the described techniques are immediately shareable for implementation across research and diagnostic laboratories.

The protocols herein described provide a guide to visualize and quantify the activity of neutrophil proteases in human sputum. The applications of such analysis span from the evaluation of anti-inflammatory treatments, to biomarker validation, drug screening and large cohort clinical studies.

인간 가래 샘플에서 호중구 엘라스테아제 및 카테프신 G 활동 모니터링

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical ...

면역학 및 감염병학

암 진단을 위한 CRISPR-Cas 합성 소변 바이오마커 검사

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for traditional biofluid measurements. Synthetic biomarkers generally make use of reporters that provide readable signals in the biofluid to reflect the biochemical alterations in the local disease microenvironment during disease incidence and progression. The pharmacokinetic concentration of the reporters and biochemical amplification of the disease signal are paramount to achieving high sensitivity and specificity in a diagnostic test. Here, a cancer diagnostic platform is built using one format of synthetic biomarkers: activity-based nanosensors carrying chemically stabilized DNA reporters that can be liberated by aberrant proteolytic signatures in the tumor microenvironment. Synthetic DNA as a disease reporter affords multiplexing capability through its use as a barcode, allowing for the readout of multiple proteolytic signatures at once. DNA reporters released into the urine are detected using CRISPR nucleases via hybridization with CRISPR RNAs, which in turn produce a fluorescent or colorimetric signal upon enzyme activation. In this protocol, DNA-barcoded, activity-based nanosensors are constructed and their application is exemplified in a preclinical mouse model of metastatic colorectal cancer. This system is highly modifiable according to disease biology and generates multiple disease signals simultaneously, affording a comprehensive understanding of the disease characteristics through a minimally invasive process requiring only nanosensor administration, urine collection, and a paper test which enables point-of-care diagnostics.

저자 스포트라이트: Engineering Molecular Tools for Disease Detection and Imaging(질병 검출 및 이미징을 위한 분자 도구 엔지니어링)

This protocol describes a CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test that enables point-of-care cancer diagnostics through the ex vivo analysis of tumor-associated protease activities.

Nanosensors 프로 테아 제 활동에 감지 비보에 비 침 투 적인 진단에 대 한

요약

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형광 성 펩 티 드 Zymography에 의해 프로 테아 제 활동의 탐지

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

Engineering Intracellular Protein Sensors in Mammalian Cells

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휴대용 진단을 위한 CRISPR-Cas 매개 다중분석물 합성 소변 바이오마커 검사

휴대용 진단을 위한 CRISPR-Cas 매개 다중분석물 합성 소변 바이오마커 검사

휴대용 진단을 위한 CRISPR-Cas 매개 다중분석물 합성 소변 바이오마커 검사