이 프로토콜은 핵산 프로브에 전문화되지 않은 연구자에게도 구현하기 쉬운 방법론으로 질병의 바이오 마커로서 핵 활성을 선별하기위한 강력한 대안을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 프로브-뉴클레아제 동적 상호 작용을 활용하여 알려진 핵및 알려지지 않은 핵활동을 모두 식별할 수 있는 핵산 프로브를 선택하는 능력입니다. 이 방법론의 다른 장점은 유연성, 높은 재현성 및 사용 용이성입니다.
이 시위는 석사 과정 학생인 카디야와 우리 실험실의 포스트독인 바리스가 진행합니다. 올리고뉴클레오티드 라이브러리를 설계할 때, 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티아민 또는 우라실의 조합을 포함하는 적어도 하나의 DNA와 하나의 RNA 무작위 서열을 포함한다. 올리고뉴클레오티드 프로브를 준비하려면, 리오필화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 스핀다운하고 뉴클레아제 분해를 방지하기 위해 마이크로리터 농도당 500 피코몰라에서 트리스-EDTA 버퍼에서 각 프로브를 희석시한다.
고체 배지의 세균 배양을 위해 극저온 저장에서 단 하나의 다공성 유리 구드를 탈제된 양혈으로 보충된 TSA가 함유된 하나의 배양 접시에 직접 굴려 개별 세균성 식민지를 줄입니다. 그런 다음 접시를 섭씨 37도에서 24시간 동안 놓습니다. 액체 배지의 세균 배양을 위해, 분당 200 회전에서 24 시간 동안 37섭씨37도에서 배양하기 위해 단단한 중간 배양에서 50 밀리리터로 단일 식민지를 전송합니다.
다음 날, 신선한 TSB에서 1 ~500 비율로 문화를 희석하고 흔들리는 인큐베이터에서 섭씨 37도및 분당 200 회전에서 24 시간 동안 박테리아를 배양합니다. 뉴클레아제 활성 분석기를 설정하려면 먼저 형광계를 섭씨 37도로 미리 데우고 살모넬라 또는 E.Coli 액체 배지 배양에서 멸균 TSB 또는 슈퍼나탄트 96 마이크로리터를 프로브 당 1.5 밀리리터 프리 미세센티오프 튜브에 조심스럽게 추가합니다. 각 튜브에 4개의 마이크로리터의 프로브 작동 솔루션을 추가하고 파이펫을 사용하여 균일한 솔루션이 달성될 때까지 각 튜브 내용을 철저히 혼합하여 거품을 방지합니다.
다음으로, 각 용액의 95 마이크로리터를 검은 바닥의 개별 우물 벽에 가깝게 조심스럽게 적재하고, 처리되지 않은 96웰 플레이트는 거품을 피하기 위해 주의를 기울입니다. 모든 솔루션이 추가되면 플레이트를 덮고 뚜껑을 시각적으로 검사하여 측정 아티팩트를 도입할 수 있는 펜 표시 또는 먼지를 검사합니다. 핵활성 측정을 위한 소프트웨어를 설정하려면 적합한 획득 소프트웨어 프로그램을 엽니다.
작업 관리자 창에서 지금 읽기를 선택하고 새 를 선택하여 운동 측정 프로토콜을 만듭니다. 온도 설정을 클릭하여 섭씨 37도를 선택하고 확인을 클릭하여 설정을 확인하고 저장합니다. 운동 시작을 클릭합니다. 팝업 창에서 런타임 입력 상자에서 2시간, 간격 입력 상자에서 2분을 선택한 후 확인을 클릭하여 설정을 확인하고 저장합니다.
읽기를 클릭합니다. 팝업 창에서 형광 강도를 감지 방법으로 선택, 끝점 역학읽기 유형및 광학 유형으로 필터. 그런 다음 확인을 클릭합니다. 팝업 창에서 필터 집합에서 녹색을 선택하고 확인을 클릭합니다. 프로시저 창에서 뚜껑 사용(사용)을 선택하고 유효성 검사를 클릭합니다.
생성된 프로토콜이 유효한지 확인하는 팝업 창이 나타납니다. 프로토콜 메뉴에서 프로시저를 선택합니다. 프로시저 창에서 측정할 우물을 정의하고 파일 이름 입력 상자에 실험 이름을 입력합니다.
그런 다음 플레이트를 플레이트 판독기로 로드하여 플레이트가 올바른 방향에 있는지 주의를 기울이고 새 읽기 버튼을 클릭하여 인수를 시작합니다. 데이터 분석을 위해 적절한 분석 소프트웨어에서 데이터를 열고 플레이트 한 창에서 측정된 우물 중 하나를 선택합니다. 웰 선택(Wells)을 클릭하고 확인을 클릭하기 전에 웰 선택 대화 창에 측정된 모든 우물을 포함합니다. 그런 다음 플레이트 한 창에서 데이터를 선택하여 표고된 결과를 시각화하고 QuickExport를 클릭하여 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
스프레드시트에서 데이터 열을 각 샘플 및 프로브에 적합한 것으로 표시하고 상대형 형광 단위와 데이터가 운동 그래프를 생성하는 시간을 플롯합니다. 이 대표적인 실험에서, 첫 번째 검진 후, 살모넬라 배양 슈퍼나티츠는 DNA 프로브를 통해 RNA 프로브에 대한 명확한 선호도를 보고했다. 살모넬라 뉴클레아제에 의한 바람직한 핵산 유형으로서 RNA의 식별에 기초하여, 새로운 RNA 전용 라이브러리는 2차 스크리닝에서 사용될 수 있도록 설계된다.
대조적으로, 배양 배지 제어에서 E.Coli는 RNA 프로브를 저하시키는 매우 제한된 능력을 입증했습니다. RNA 프로브의 특이성을 높이기 위한 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 이용한 두 번째 스크리닝 후, RNA pyrimidine 2'O-메틸 및 RNA 퓨린 2'O-메틸은 RNA pyrimidine 2'fluoor 및 RNA 플루어와 비교하여 가장 성과가 좋은 운동 적 행동을 나타내는 화학적 변형을 기반으로 식별될 수 있다. 이러한 결과는 살모넬라가 이 박테리아를 특별히 인식할 수 있는 프로브를 선택하는 데 사용될 수 있는 차분기질 화학 선호도를 가진 중요한 RNAe 활동을 가지고 있음을 시사한다.
이 절차는 새로운 임상 진단 공구의 발달을 허용하는 암 또는 세균성 감염과 같은 질병 조건과 관련되었던 핵활성을 확인할 수 있는 프로브의 선택을 가능하게 합니다.
