생체 내에서 펩티드 송신기 수준의 시간 분해 측정을 위한 방법이 개발된 것은 이번이 처음이다. 우리는 거의 실시간 분석을 통해 단일 피사체와 개별 위치에서 펩티드 송신기 수준을 측정 할 수 있습니다. 먼저, 25센티미터 길이의 퍼플루오로알콕시 코팅된 백금 와이어를 절단한다.
그런 다음, 메스를 사용하여, 한쪽 끝에서 대략 다섯 밀리미터의 퍼플루오로알콕시 코팅을 벗겨내고, 백금 와이어로 절단되지 않도록 주의한다. 이제 백금 와이어의 벗겨진 끝을 금도금된 한 밀리미터 수 커넥터 핀에 삽입합니다. 그런 다음 바늘 노즈 플라이어를 사용하여 백금 와이어의 벗겨진 끝 주위에 커넥터 핀 이빨을 압착하고 백금 와이어를 금도금 커넥터 핀에 납땜합니다.
다음으로, pH 6과 함께 10-밀리몰 PBS의 50 밀리리터에 도파민 염산염 50 밀리그램을 첨가하고 교반하여 혼합함으로써 도파민 용액을 제조하였다. 도파민을 완전히 용해시킨 후, 백금 선의 끝을 갓 만든 도파민이 보충된 PBS를 함유하는 용기에 넣는다. 염화은 디스크 전극을 헤드 스테이지의 접지 채널에 연결합니다.
이어서, 염화은 디스크를 도파민이 보충된 PBS 및 백금 와이어를 함유하는 용기에 넣는다. 더 진행하기 전에 와이어 션트를 헤드 스테이지의 참조 채널에 연결하십시오. 대화식 데이터 수집 소프트웨어를 열고 시작 전위를 영하 0.6V, 끝 전위를 0.65V, 스캔 속도를 초당 0.04V, 증착 지속 시간을 420초로 설정하여 톱니 전착 명령 전위 프로토콜을 설정합니다.
폴리도파민 증착을 완료한 후, 염화은 분쇄 펠릿 및 백금 와이어의 팁을 용기로부터 제거하였다. 와이어 팁을 pH 7.4의 PBS를 함유하는 마이크로튜브에 넣고 2 내지 5분 동안 와이어 팁이 마이크로튜브의 측면 또는 바닥에 닿지 않도록 한다. 이어서, 관심있는 항체를 적절한 크기의 용기에서 1:20 비율로 pH 7.4의 PBS와 결합시켜 항체 용액을 제조하였다.
다음으로, 백금 전극의 폴리도파민 증착 팁을 실온에서 두 시간 동안 항체 용액에 담그고, 백금 와이어 팁이 용액에 현탁되고 마이크로튜브의 내부 표면에 놓이지 않도록 한다. 용량성 면역 프로브의 기능적 팁을 유동 챔버 내로 놓고, 어떤 식으로든 전극의 팁을 방해하지 않도록 주의하며, 그렇게 하면 프로브의 감각 팁이 손상될 수 있으므로 주의해야 합니다. 첫 번째 실험 테스트 전에 TBS 표준 실행을 수행하여 용량성 면역 프로브 프로브를 컨디셔닝하고 전압 프로토콜의 경우 포지티브 스텝 전위를 110밀리볼트로, 네거티브 스텝 전위를 마이너스 5밀리볼트로, 스텝 지속 시간 20밀리초로, 획득 지속 시간을 600초로 설정합니다.
다음으로, 수퍼푸세이트의 조성을 유지하기 위해 동일한 TBS를 사용하여 관심있는 펩티드 용액을 생성한다. TBS와 펩티드가 보충된 TBS 간에 수퍼푸세이트를 전환할 수 있는 매니폴드 시스템을 설정합니다. TBS 표준 파라미터를 사용하고 수집 기간을 360초로 설정하여 펩티드 감지 데이터 수집 프로토콜을 설정하십시오.
폴리도파민 침착 전에, 백금 와이어 전극의 노출된 팁을 22-게이지 피하 주사 바늘을 통해 실을 꿰고, 바늘의 끝 너머로 약 2밀리미터를 남긴다. 포셉을 사용하고 백금 와이어 전극의 끝을 부드럽게 구부려 피하 주사 바늘의 끝에서 매달려있는 미늘을 만듭니다. 철조망 팁으로부터 바늘을 부드럽게 인출하고, 바늘이 유체에 접촉하지 않고 용기 내에 배치하기에 충분한 와이어를 남겨두고 이전에 입증된 바와 같이 도파민 침착을 진행한다.
이제 막대가 있는 프로브 팁을 PBS로 헹구고 항체 용액에 넣습니다. 이어서, 기능화된 팁을 PBS로부터 부드럽게 제거한다. 피하 주사 바늘을 막대가 있는 정전 용량 성 면역 프로브로 이동시키고 금 커넥터 핀을 헤드 스테이지에 꽂기 전에 관심 영역에 부드럽게 이식합니다.
일단 이식되면 피하 주사 바늘을 꺼내 전극을 제자리에 두십시오. 명령 전위의 포지티브 단계는 프로브 전압을 클램핑하는 데 필요한 주입 전류를 측정하고 정전 용량 전류의 측정을 허용합니다. 음성 명령 전위 단계는 정전기적 반발을 통해 항체로부터 결합된 펩티드를 클리어한다.
스텝 함수 명령 파형은 펩티드의 시간-분해된 반복적 검출 및 정량화를 묘사하였다. 하단 트레이스는 TBS에서 프로브의 과융합 하에서의 명령 전위 및 결과 전류를 나타냅니다. 평형화된 용량성 면역프로브는 여섯 분에 걸쳐 더 작은 초기 붕괴 및 안정한 기준선을 나타냈다.
유동 챔버 내로의 뉴로펩티드 Y의 흐름은 기준선 상에서 용량성 전류를 증가시켰다. 뉴로펩티드 Y 항체로 측정된 용량성 면역프로브 전류-기능화된 프로브는 낮은 피코몰 뉴로펩티드 Y에 민감한 농도 의존적 신호를 나타냈으며, 교정을 위해, 모든 시험된 농도에 대해 표준 곡선을 측정하였다. 양측 성상 신경절의 자극은 음성 대조군 용량성 전류와 공동-플롯팅되었을 때 상승된 신경펩티드 Y를 나타냈다.
성상 자극 하에서 측정된 노르에피네프린 방출은 뉴로펩티드 Y와의 동기식 방출을 나타냈으며, 유발된 교감신경 반응과 일치하였다. 이러한 기술의 개발은 심장 활동의 주요 조절제의 수술 내 판독을 제공 할 수 있으며, 따라서 잠재적 인 신속한 치료 또는 중재 적 지침을 제공 할 수 있습니다. 여기에 제시된 기술은 심혈관 배치에 특이적이지만, 기술 자체는 소변, 골격근, 신장, 지방 조직 등과 같은 다른 생리적 설정에 적합합니다.
