현재 자모그래피 기술은 제한된 수의 프로테아제수를 감지합니다. 형광 펩티드 zymography는 형광 펩티드를 분해 가능한 기판으로 사용하여 더 넓은 범위의 프로테아제의 측정을 가능하게 합니다. 이 방법의 주요 장점은 모듈식 디자인입니다.
형광 펩티드의 서열은 어떤 프로테아제검출을 결정하고 형광 펩타이드는 다른 서열의 펩티드로 쉽게 교환될 수 있으며, 다른 프로테아제검출 능력을 가진다. 이 기술은 약물 전달 또는 조직 공학 응용 분야에 사용되는 것과 같은 엔지니어링 된 생체 재료에서 분해 가능한 크로스 링커로 펩티드의 사용을 알리는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술에 이 펩티드를 통합하면 생체 물질 분해를 담당하는 분비된 프로테아제 조직을 식별할 수 있습니다.
이 기술의 데모는 다른 zymography 기술에 비해 고유 한 다층 접근 방식을 시각화하는 데 중요합니다. 이 기술을 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생인 아메야 데슈무크(Ameya Deshmukh)가 될 것입니다. 먼저 텍스트 프로토콜 중 하나에 설명된 대로 10% 폴리아크릴아미드 해결 젤 솔루션을 준비합니다.
젤을 붓기 직전에 TEMED 및 APS를 추가합니다. 이어서, 1.5밀리미터 미니 젤 카세트를 해결하는 젤 용액으로 반쯤 채우고 비우게 한다. 폴리아크릴아미드 젤 의 상단에 이소프로파놀의 얇은 층을 추가하여 레벨 젤을 생성하고 거품을 방지합니다.
남은 폴리아크릴아미드 용액을 사용하여 중합 반응의 진행 상황을 추적한다. 튜브의 폴리아크릴아미드가 완전히 응고되면 반응이 완료됩니다. 첫 번째 해결 젤 층은 중합체이지만, 섭씨 20도에서 저장에서 아지도-PEG3-Maleimide 키트를 검색하고 구성 요소가 실온에 도달 할 수 있습니다.
그런 다음, 제조 업체 권장 볼륨DMSO의 제조 업체 권장 볼륨에 유리병 2의 구성 요소를 용해. 그리고 액체가 잘 혼합되어 있는지 확인하기 위해 30 초 동안 소용돌이. 유리병의 내용물들을 교반 바가 들어 있는 깨끗하고 건조한 100밀리터 라운드 하단 플라스크로 옮기습니다.
즉시 플라스크의 입에 주사기로 구멍을 뚫을 수있는 다이어프램고무 중격 스토퍼를 삽입합니다. 다음으로, 다이어프램에 두 개의 18 게이지 주사기 바늘을 삽입합니다. 주사기 바늘 중 하나를 불활성 가스 탱크에 연결하고 가스가 3 분 동안 둥근 바닥 플라스크를 채울 수 있도록합니다.
그런 다음 불활성 가스를 차단하고 바늘에서 분리하십시오. 주사기를 사용하여 유리병 2의 전체 내용을 플라스크에 주입하십시오. 바늘과 주사기를 모두 제거합니다.
부품을 실온에서 30분 동안 혼합할 수 있도록 하면서 저어줍니다. 이 후 고무 중격 스토퍼를 제거하고 깨끗한 5 밀리리터 원심 분리 튜브로 내용을 전송합니다. 일단 첫 번째 해결 젤 층이 중합화되면 이소프로판올 층을 부어.
젤 위에 이온화 된 물 1 밀리리터를 파이프한 다음 물을 부어 젤을 헹구습니다. 80°C에서 저장에서 티올 기능성 형광 펩티드를 검색합니다. 실온에서 해동하도록 허용하십시오.
표에 설명된 대로 Azido-PEG3-Maleimide 링커 분자 및 형광 펩티드를 포함하는 10%의 해결 젤 용액을 준비한다. 젤을 붓기 직전에 TMED와 APS를 추가합니다. 다음으로, 젤 카세트의 나머지 부분의 절반을 펩타이드 해결 젤 용액으로 채우는 다.
폴리아크릴아미드 젤 의 상단에 이소프로파놀의 얇은 층을 추가하여 레벨 젤을 생성하고 거품을 방지합니다. 남은 폴리아크릴아미드 용액을 사용하여 중합 반응의 진행 상황을 추적한다. 반응이 완료되면 이소프로판올 층을 부어 넣습니다.
젤 위에 이온화 된 물 1 밀리리터를 파이프한 다음 물을 부어 젤을 헹구습니다. 즉시 젤을 사용하지 않을 경우 섭씨 4도에서 1x PBS10밀리리터로 채워진 플라스틱 상자에 담그고 보관하십시오. 알루미늄 호일로 상자를 감싸서 광표백을 방지합니다.
먼저 텍스트 프로토콜 중 하나에 설명된 대로 5%의 스태킹 젤 솔루션을 준비합니다. 젤을 붓기 직전에 TMED와 APS를 추가합니다. 스태킹 젤 용액으로 젤 카세트의 나머지 빈 부분을 채웁니다.
1.5 밀리미터 젤 빗을 스태킹 젤 레이어에 빠르게 삽입하여 우물 아래에 거품이 갇혀 있지 않도록 합니다. 남은 폴리아크릴아미드 용액을 사용하여 중합 반응의 진행 상황을 추적한다. 반응이 완료되면 젤 카세트 뒷면에서 빗과 테이프를 부드럽게 제거합니다.
먼저, 기존의 zymography 샘플 버퍼에서 샘플을 용해하십시오. 젤 장치에 400 밀리리터 OS 1X 트리스 글리센 SDS 실행 버퍼를 추가합니다. 우물당 최대 35마이크로리터의 시료를 적재합니다.
1시간 반 동안 섭씨 4도에서 120볼트로 샘플을 실행하거나 분자량 기준이 펩티드 해결 젤 층 내에 있는 것으로 나타났습니다. 이 후, 플라스틱 카세트에서 젤을 제거합니다. 부드러운 동요 하에서 실온에서 재침 버퍼에 젤을 세 번 씻으라.
각 세척으로 10 분 동안 지속됩니다. 젤을 개발 버퍼 솔루션으로 15분 간 전송합니다. 그런 다음 솔루션을 신선한 개발 버퍼로 교체하고 24 시간 동안 부드러운 동요에서 섭씨 37도에서 배양하십시오.
그 후 적절한 여기저기 및 방출 필터가 있는 형광 젤 스캐너 이미저를 사용하여 젤을 이미지화합니다. 형광 프로테아제 분해 펩티드에 대한 이 연구에서는 폴리아크릴아미드 젤에 통합된다. QGIW는 세포 콜라발생을 검출하도록 설계된 콜라겐 1유래 서열이며, LACW는 MMP-14 및 MMP-11의 검출에 최적화된 서열이다.
형광 화상 진찰은 LACW 펩티드 젤 내의 수많은 밴드를 드러내지만 QGIW 젤에서 단 하나의 밴드만 볼 수 있습니다. 젤라틴 zymography에 비해, LACW 젤은 더 많은 프로테오리틱 밴드를 검출할 수 있으며, 이는 펩타이드 zymography가 네이티브 기판을 사용하는 전통적인 방법보다 생물학적 샘플 내에 존재하는 프로테아제의 넓은 범위를 검출하는 능력을 보여줍니다. 펩타이드 자모그래피 세포는 GM6001, 광범위한 스펙트럼 MMP 억제제 또는 일반 카테프신 억제제인 E64를 포함하는 개발 버퍼에서 배양된다.
GM6001을 함유한 LACW 펩티드 젤의 치료는 밴드의 강도를 감소시다. E64로 치료하는 동안 눈에 띄는 효과가 없습니다. GM6001을 가진 QGIQ 펩티드 젤의 처리는 이전에 본 밴드의 완전한 절제결과.
E64는 효과가 없습니다. 젤라틴 zymography는 현재 금 본위제와 펩타이드 자모그래피의 감도를 비교하기 위해 정제된 활성 MMP-9를 사용하여 수행됩니다. LACW 젤은 MMP-9의 가장 작은 농도를 검출할 수 있다.
프로테아제는 재성격과 활성화되기 위해 특정 조건이 필요합니다. 버퍼 솔루션을 신중하게 준비하여 컴포지션과 PH가 올바른지 확인합니다. 이 방법은 기존 기술로 보완되어 ID를 확인하고 측정된 프로테아제의 추가 분석을 수행할 수 있습니다.
여기에는 서부 블로팅, 실시간 PCR 및 질량 분석법이 포함됩니다. 폴리 아크릴아미드를 취급할 때는 주의하십시오. 비중합용액은 강력한 신경독소로 간주되며 취급 시 적절한 개인 보호 장비는 항상 착용해야 합니다.
