여기에 설명된 프로토콜은 최대 10KB 길이의 단일 가닥 양성 RNA 바이러스 게놈의 무작위로 돌연변이화된 전체 길이 RNA 라이브러리를 생성하고 원하는 실험 조건에서 관심 표현형을 선택할 수 있습니다. 이 기술은 클로닝이 필요 없는 접근 방식을 사용하여 짧은 시간에 다양한 수준의 유전적 다양성을 가진 전장 바이러스 RNA 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 이 기술은 라이브러리 합성을 위해 저렴하고 널리 사용 가능한 시약을 사용합니다.
이 절차를 시연하는 것은 Shiv Nadar University의 생명 과학과 바이러스학 섹션 박사 과정 학생인 Shaheen Khan입니다. 시작하려면 텍스트 원고에 설명된 대로 pJFH1 템플릿이 없는 반응 성분과 함께 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 4세트의 실험을 위한 마스터 믹스를 준비하여 ep-PCR을 수행합니다. 마스터 믹스를 4개의 튜브로 분취합니다.
100 나노그램, 50 나노그램, 25 나노그램 및 10 나노그램의 템플릿을 개별 튜브에 추가하고 반응의 총 부피를 50 마이크로 리터로 조정합니다. 순환 조건을 적용하여 97개의 36 염기 쌍 조각을 증폭합니다. 5 마이크로 리터의 PCR 산물을로드하고 0.8 % TAE 기반 아가로스 겔 전기 영동을 실행하여 1 킬로베이스 DNA 사다리의 알려진 양과 비교하여 증폭 된 ep-PCR 산물을 추정합니다.
컬럼 정제 키트를 사용하여 제품을 정제합니다. 260나노미터에서 흡광도를 측정하여 정제된 생성물의 농도를 추정합니다. ep-PCR 산물을 진공 농축하여 마이크로리터당 100나노그램 이상의 산물 농도를 얻습니다.
in vitro RNA 합성 반응을 설정하고 배양을 위해 섭씨 37도에 둡니다. 그런 다음 컬럼 정제 키트를 사용하여 합성된 생성물을 정제합니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 약 1마이크로그램의 바이러스 RNA, 5마이크로몰 역전 프라이머 및 200단위의 역전사 효소를 추가하여 20마이크로리터 cDNA 합성 반응을 설정합니다.
cDNA를 사용하여 텍스트 원고에 설명된 대로 반응 혼합물을 준비하고 증폭 주기를 실행합니다. 0.8% TAE 기반 아가로스 겔에 제품을 실행하여 25개의 71-염기쌍의 제품 크기를 확인한 다음 앞서 설명한 대로 컬럼 정제 키트를 사용하여 제품을 정제합니다. 40마이크로리터의 멸균수에서 용출합니다.
3개의 프라임 A 돌출부를 추가하려면 0.5마이크로몰 DATP와 저충실도 Taq DNA 중합효소 1유닛을 추가하고 전체 PCR 산물을 섭씨 70도에서 30분 동안 1X PCR 완충액 및 1.5밀리몰 염화마그네슘과 함께 배양합니다. 그런 다음 컬럼 정제 키트를 사용하여 혼합물을 정제합니다. 결찰 반응을 설정하고 실온에서 3시간 동안 배양합니다.
그런 다음 100 마이크로 리터의 대장균 DH5-알파를 접합 된 DNA에 첨가하고 섭씨 42도에서 35 초 동안 세포에 열 충격을 가합니다. 세포 현탁액에 LB 배지 1m리터를 넣고 섭씨 37도에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 13, 800 RCF의 원심 분리기.
상층액을 버리고 200마이크로리터의 신선한 LB 배지에 재현탁시킵니다. 형질전환된 대장균 DH5-알파 세포 100마이크로리터를 밀리리터당 50마이크로그램의 암피실린을 함유한 LB 플레이트에 담고, 섭씨 37도에서 16시간 동안 배양합니다. 암피실린 밀리리터당 50마이크로그램을 함유한 5밀리리터의 LB 배지에 25-30개의 콜로니로 구성된 미니 프렙을 설치하고 섭씨 37도에서 밤새 성장시킵니다.
다음 날, 상용 키트로 플라스미드를 추출하고 모든 콜로니에 대해 200나노그램의 분리된 플라스미드, 2개의 EcoR1 단위 및 1X 제한 완충액을 사용하여 10마이크로리터 부피에서 제한 효소 분해를 수행합니다. 분해 혼합물을 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양한 후 0.8%TAE 기반 아가로스 겔에 제품을 로드하여 플라스미드 DNA 삽입을 확인합니다. 권장 primer를 사용하여 25개의 positive clone의 plasmid에 대한 Sanger sequencing을 수행합니다.
형질주입 하루 전에 세포를 분할하고 혈구분석기를 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다. 그런 다음 인간 간종 7.5 세포를 2 밀리리터의 완전한 DMEM에 35mm 접시에 파종하고 5 % 이산화탄소로 가습 된 인큐베이터에서 섭씨 37 도에서 16 시간 동안 세포를 배양합니다. 다음 날, 10 마이크로리터의 transfection 시약을 50 마이크로리터의 최소 필수 배지에 희석하여 전사체 지질 복합체를 준비하고, 50 마이크로리터의 최소 필수 배지에 5 마이크로그램의 바이러스 전사체를 별도로 희석합니다.
두 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 단일 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 혼합하고 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 세포 배양 후 배양 배지를 제거하고 예열된 1X PBS로 세포를 두 번 세척하고 최소 필수 배지 1.5mL를 추가합니다.
콤플렉스를 천천히 추가하고 균일한 분포를 위해 접시를 부드럽게 휘젓습니다. 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 10시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 배지를 제거하십시오.
1밀리리터의 사전 예열된 1X PBS로 형질주입된 세포를 두 번 세척하고 2밀리리터의 완전한 DMEM을 추가합니다. 바이러스 RNA 분리 키트를 사용하여 140마이크로리터의 배양 상층액에서 바이러스 RNA를 분리합니다. 상용 qRT-PCR 키트를 사용하여 10마이크로리터 qRT-PCR 반응을 설정합니다.
HCV RNA 정량을 위해 정방향 및 역방향 프라이머와 프로브를 사용합니다. 반응 주기를 섭씨 48도에서 20분, 섭씨 95도에서 10분, 섭씨 95도에서 15초, 섭씨 60도에서 1분 주기로 설정합니다. 반응을 실행하고 음성 컨트롤을 설정합니다.
이와 동시에 바이러스 RNA를 정량화하기 위해 10배 연속적으로 희석된 알려진 HCV 전사체 복제 수를 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 세 번 수행하십시오. 인간 간종 7.5 세포를 96웰 플레이트에 도금하고 바이러스를 추가하기 약 16시간 전에 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
생물 안전 등급 II 캐비닛에서 바이러스를 10배 연속 희석합니다. 웰당 100마이크로리터의 희석된 바이러스를 추가하여 세포를 감염시키고 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 배양합니다. 3일 후 감염된 세포를 0.1밀리리터의 PBS로 세 번 세척하고 영하 20도에서 20분 동안 0.1밀리리터의 얼음처럼 차가운 메탄올로 세포를 고정하고 투과시킵니다.
1X PBS로 우물을 세 번 세척한 다음 PBST로 1X를 세척합니다. PBST를 제거한 후 PBST에 0.2%탈지유가 함유된 1%BSA 0.1mL로 실온에서 30분 동안 세포를 차단합니다. 차단 용액을 제거하고 1X PBS에서 준비한 0.1 밀리리터의 3 % 과산화수소로 세포를 5 분 동안 처리합니다.
다시 말하지만, 1X PBS로 셀을 두 번 세척하고 PBST로 1X를 세척합니다. 웰당 50마이크로리터의 항-NS5A 9E10 단클론 항체를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 1X PBS로 세 번, PBST로 한 번 우물을 씻습니다.
웰당 50마이크로리터의 HRP 접합 염소 항마우스 2차 IgG를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양한 다음 0.1밀리리터의 1X PBS로 웰을 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 30 마이크로 리터의 DAB를 넣고 실온에서 10 분 동안 부드럽게 흔들어 접시를 배양합니다. DAB 용액을 제거하고 1X PBS로 웰을 두 번, 증류수로 한 번 세척합니다.
0.03% 아지드화나트륨을 함유한 PBS 100마이크로리터를 추가합니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 도립 광 현미경으로 각 웰을 검사합니다. 양의 우물 수를 셉니다.
Reed and Muench 계산기를 사용하여 우물의 50%를 감염시키는 종말점 희석을 추정합니다. NS5A 억제제인 피브렌타스비르를 100% DMSO에 1밀리몰 농도로 용해시키고 완전 DMEM에서 10나노몰 농도로 더 희석합니다. 그런 다음 ML50 바이러스 용량으로 70% 합류에서 순진한 Huh-7.5 세포를 감염시켜 12시간 동안 세포의 50%를 감염시킨 다음 감염된 세포를 감염 후 24시간 동안 6웰 플레이트로 옮깁니다.
세포를 분할한 후 16시간 후에 감염된 세포에 EC50 PIB 1개를 추가합니다. 모든 세포가 6개의 연속 통과 동안 분할된 후 3개의 약물 없는 통과 주기가 뒤따를 때마다 이 작업을 수행하고 초점 형성 분석을 사용하여 바이러스 확산을 모니터링합니다. 각 통로에서 바이러스 상청액을 채취하고 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.
18일째에 상층액에서 바이러스 RNA를 추출하고 합성된 cDNA를 추출합니다. 5마이크로리터의 희석된 cDNA를 사용하여 NS5A 유전자를 증폭합니다. 그런 다음 NS5A 염기서열분석 프라이머를 사용하여 6-8개의 양성 박테리아 플라스미드에서 NS5A 약물 내성 돌연변이를 측정합니다.
전체 게놈 돌연변이 라이브러리는 클론 pJFH1을 사용하여 100에서 10 나노그램으로 감소하는 양을 사용하여 합성되었습니다. ep-PCR 산물의 평균 수율은 마이크로리터당 3.8 내지 12.5 나노그램 범위였다. 돌연변이 라이브러리에서 돌연변이의 비율은 ep-PCR 반응에서 pJFH1의 투입이 감소함에 따라 증가했습니다.
템플렛의 50 nanograms를 사용하여 종합된 ML50에는 템플렛의 25 nanograms를 사용하여 종합된 ML25가 9개의 대용골을 품는 그러나, 베껴진 10, 000의 기본적인 쌍 당 4개의 대용경우가 있었다. 서열분석된 뉴클레오티드의 수 내에서 어떠한 치환도 클로날 pJFH1에서 발견되지 않았다. ML50 바이러스 변이는 클론 JFH1 바이러스에 비해 피브렌타스비르에 덜 민감했습니다.
8개의 NS5A 클론 중 4개는 D7V+F28C의 조합을 가지고 있는 반면, V8A+F28C 및 F36L은 각각 하나의 클론에서 발생했다. 이 돌연변이는 NS5A의 N 말단 부위에 있었는데, 이 부위는 임상적으로 관련된 NS5A 내성 돌연변이를 품고 있는 것으로 알려져 있습니다. ep-PCR의 각 성분의 최종 농도, 특히 템플릿 양이 중요합니다.
KB Extender가 없으면 ep-PCR 산물의 수율이 크게 감소합니다.
