NIH P01 HL112730 (걸 레, JVE), NIH R01 HL132075 (걸 레, JVE), 바브라 스 트라이 샌드 여자의 심장 센터 (걸 레, JVE), 도로시와 E. 필립 리옹 분자 심장 (걸 레)에서 자, 에리카 글 레이저 부여 여성의 심장 건강 (JVE)에 체코 과학 아카데미의의 자 제도적 지원 RVO: 68081715 (MS)

모든 동물 연구 기관 지침에 따라 수행 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 삼목 시 나이 의료 센터에 의해 승인 했다.
1. Langendorff 마우스 심장의 관류
<ol><li>
국 소 빈 혈과 reperfusion 마우스 마음의 Langendorff 관류
	<ol>
<li>관리 복 pentobarbital 나트륨 70 mg/kg 성인 마우스 (8 주 오래 된, 남성, C57BL6/j). 핀치를 발 끝에 철수의 부족에 의해 깊은 마 취를 확인 합니다.</li>
		<li>복 덤플링 500와 Anticoagulate U/kg.</li>
		<li>Sternal 절 개를 통해 가슴을 엽니다. 횡 경 막 열고 앞쪽 액 축에 늑 골 경계를 따라 잘라. 그런 다음 완전히 흉부 새 여 forelimb까지 앞쪽 액 축 잘라. 후, 마음을 시각화, 집게와 오름차순 대동맥을 클램프 하 고 마음을 빠르게 삭제할. 죽음은 exsanguination 때문 이다. 차가운 Krebs에서 마음을 배치 (NaCl 6.9 g/L, KCl 0.35 g/L, NaHCO3 2.1 g/L, KH2포4 0.16 g/L, MgSO4 0.141 g/L, 포도 당 2 g/L와 CaCl2 0.373 g/L).</li>
		<li>블런트 팁 바늘으로 대동맥을 cannulate 하 고 perfuse retrogradely 일정 한 압력 모드로 Krebs 솔루션으로 마음.</li>
		<li>안정화 기간 후 15 분, 30 분 뒤에 30 분 동안 reperfusion 글로벌 아니 흐름 허 혈을 심장 주제.</li>
		<li>초기 관류 15 분, 30 분 허 혈, 또는 30 분 reperfusion 마음을 수확. 심 방에서 트리밍합니다 그리고 스냅-동결 조직 액체 질소.</li>
		<li>사용까지-80 ° C에서 저장</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 조직 균질, 가용 화, 그리고 자당 밀도 그라데이션 침전
<ol><li>
그라데이션 준비
	<ol>
<li>100ml 자당, NaCl 2.5 M; 4 mL를 혼합의 2 솔루션 (15%, 50%)를 준비 0.8 mL MgCl2 1.25 M; 1 mL Tris HCl 1 M, pH 7.5; 15 g 또는 자당의 50 g (15%와 50%, 각각); 100 mL; 도달 초순 그리고 15% 솔루션을 자일 렌 cyanol (0.02 mg/mL)</li>
		<li>각 솔루션 (0.22 μ m 필터) 필터</li>
		<li>그라디언트 사용 될 것 이다 날 각 자당 솔루션의 40 mL를 준비 하 고 cycloheximide 100 µ g/mL의 최종 농도 달성 하기 위해 각 솔루션에 추가<ol>
<li>그라데이션 메이커를 사용 하 여 15%와 50% 자당 해결책 사이 혼합을 준비</li>
			<li>15% 자당 기온 변화도의 5 mL와 함께 왼쪽된 칸 채우기</li>
			<li>오른쪽 구획 50% 자당 그라데이션으로 채우기</li>
			<li>수도 꼭지를 열고 자력으로 두 개의 작은 구획을 저 어을 펌프에 전환</li>
			<li>튜브를 사용 하 여 혼합된 자당 솔루션 얇은 벽 울트라 원심 분리 관에 흐름을 허용 하도록 두 번째 탭에 연결. 마지막 볼륨 약 10 mL를 있을 것입니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>4 ° C에서 그래디언트를 유지 (필요한 경우, 하룻밤 하지만 되지 더 이상)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
심 혼 직물의 균질 화
	<ol>
<li>균질 (자당 그라데이션 분별에 대 한 수정)는 필터링 된 세포의 용 해 버퍼에서 polytron와 신선 또는 냉동 하트 100 m m KCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0.4% 포함 된 NP-40. Cycloheximide 100 µ g/mL polysome 구조, 0.1 U RNase 제와 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (1 태블릿 50 ml)을 유지 하기 위해 포함 됩니다.</li>
		<li>품 어는 lysate에 15 분을 얼음.</li>
		<li>불용 성 물질을 제거 하는 상쾌한 수집 4 ° C에서 15 분 18000 x g 에서 원심.</li>
		<li>단백질 결정, RNA 격리 및 RNA 무결성 분석 ( 그림 2참조)에 대 한 50 µ L를 보유 합니다.</li>
		<li>그래디언트 위에 상쾌한 (500-100 µ L) 레이어를 세포의 용 해 버퍼 튜브를 균형.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
침전 및 분수의 컬렉션
	<ol>
<li>37000 rpm 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 120 분 ultracentrifugation를 수행 합니다. 제조 업체에 따라이 최대 반경에서 228000 x g 에 해당합니다.</li>
		<li>254에서 흡 광도의 지속적인 감시와 함께 microcentrifuge 튜브에서 17 분수 (분수 약 600 µ L)으로 각 그라디언트를 수집 nm (OD254).</li>
		<li>다음과 같이 분수 수집기 프로그램:<ol>
<li>(그라데이션 하기 전에 튜브에 포함 된 액체에 해당) 하는 컬렉션의 첫 번째 3 분 삭제</li>
			<li>19 분 4, 17 분수에 1 mL/min의 속도로 분수를 수집 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>각 수집 되 자 마자 얼음에는 분수를 놓습니다. 그들은 즉시 처리 되지 않는 경우-80 ° C에서 샘플을 동결. 그라데이션의 전형적인 UV densitometric 추적 수집은 그림 1에 표시 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 절연 및 Polysome Nontranslating 분수에서 mRNAs의 분석
<ol><li>
MRNA의 추출
	<ol>
<li>만약 그들이 플래시-냉동 컬렉션 후 얼음에 분수를 녹여</li>
		<li>신선한 튜브 각 분수의 200 µ L 전송 참고:이 단계에서 두 개 이상의 연속 분수 수 수 풀링된 함께. 그것은 행해져야 한다 신중 하 게 polysome 및 비 polysome 분수 혼합 하지 않습니다 있도록 OD254 그래프를 분석 후.</li>
		<li>10 추가 luciferase 정규화 목적을 위해 각 샘플에 내부 제어로 RNA의 ng. 참고: Luciferase 뇌관 해야 사용 내부 통제로 결과 정상화.</li>
		<li>각 튜브를 RNA 추출 시 약 (페 놀 및 guanidine isothiocyanate monophasic 솔루션; 참조 테이블의 재료)의 700 µ L를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 RT (실내 온도)에서 5 분 동안 튜브를 품 어.</li>
		<li>실시간에 2-3 분 15 미 품에 대 한 140 µ L 클로 프롬 및 소용돌이 추가</li>
		<li>4 ° c.에 12000 x g 에서 15 분에 대 한 샘플을 원심</li>
		<li>신중 하 게 새로운 튜브 위 수성 단계 전송.</li>
		<li>분수의 RNA 콘텐츠 높은 이므로, 각 튜브를 캐리어로 glycogen의 10 µ g을 추가 합니다.</li>
		<li>각 튜브를 350 µ L 소 프로 파 놀을 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 수익률을 높이기 위해 1 시간-20 ° C에서 품 어.</li>
		<li>4 ° c.에 12000 x g 에서 15 분 동안 원심 분리기</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 추가 700 µ L 에탄올 75 %RNA 펠 릿을 세척 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에 7500 x g 에 5 분 동안 원심 분리기</li>
		<li>에탄올을 제거 하 고 펠 릿 어 10-15 분 동안 건조 하자. 참고:-RNA 펠 릿 건조 물에 그것의 완전 한 가용 화가 되지 것입니다.</li>
		<li>RNase 무료 초순 H2o.의 50 μ에 RNA 펠 릿 resuspend</li>
		<li>55 ° c.에서 10 분에 대 한 샘플을 품 어</li>
		<li>각 샘플의 2 μ를 사용 하 여 추출 된 RNA의 양과 품질을 측정 하 여-80 ° c.에 나머지를 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>
반전 녹음 방송 및 정량
	<ol>
<li>반전 녹음 방송 cDNA 합성의 4 μ를 사용 하 여 20 μ 반응 ( 재료의 표참조)을 키트. 샘플의 수에 따라 supermix을 준비 합니다. 각 관에 필요한 볼륨을 전송 하 고 각 관에 입력 RNA의 5 μ를 추가 합니다. 이 볼륨은 Taq 중 합 효소 근무 조건 범위에 대 한 관련성이 수정 될 수 있습니다.</li>
		<li>제조업체에서 권장 하는 다음 프로그램으로 열 cycler에 튜브를 품 어: 25 ° C에서 5 분, 20 분 반전 녹음 방송에서 46 ° C, 20 분 동안 95 ° c.에 1 분 동안 역전사 비활성화</li>
		<li>정량 Pcr 뇌관의 각 쌍에 대 한 최적화 된 프로그램으로 실행 합니다. 참고: 분수에 특정 mRNAs의 존재를 감지, (격리 된 RNA)의 각 부분에서 동일 볼륨 반전 녹음 방송에 대 한 사용할 수 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
결과의 분석
	<ol>
<li>관심 있는 유전자와는 luciferase Ct 값을 사용 하 여 델타 Ct 값 계산</li>
		<li>다른 분수 (표 1)에 걸쳐 있는 mRNA의 분포를 시각화 하는 모든 분수에 포함 된 총 mRNA 값의 백분율로 각 분수 델타 Ct 값을 표현</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 절연 및 Polysome 분수와 Nontranslating 분수에서 miRNAs의 분석
<ol><li>
MRNA와 미르 추출 참고:이 프로토콜 몇 가지 변화 제조업체의 지침을 따릅니다.<ol>
<li>글 리 코겐 및 스파이크 컨트롤 해 동. 얼음에 계속.</li>
		<li>풀링된 샘플의 200 µ L를 미르 추출 시 약의 700 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>Glycogen의 µ 1 µ g/L을 추가 하 고는 피 펫을 사용 하 여 균질. 실 온에서 5 분 동안 그것을 품 어.</li>
		<li>1.6 제어 스파이크에서 108 x의 3.5 µ L을 추가 하 고 그것을 혼합.</li>
		<li>클로 프롬 및 소용돌이의 200 µ L 추가 적어도 15 초 동안 그것.</li>
		<li>실내 온도에 3 분 동안 품 어.</li>
		<li>4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g 에서 원심 분리기</li>
		<li>피 펫을 사용 하 여, 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 전송. 중간 및 아래 단계를 삭제 합니다.</li>
		<li>100% 에탄올 1.5 x 볼륨은 상쾌한을 추가 섞는다.</li>
		<li>미르 추출 열에이 혼합물의 700 µ L를 전송 및 15에 대 한 최고 속도로 원심 RT와 흐름; 통해 삭제 s 나머지 모든 예제와 함께이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>열에 버퍼 1의 700 µ L을 추가 하 고 15 최고 속도로 원심 RT; s 흐름을 통해 삭제 합니다.</li>
		<li>열에 버퍼 2의 500 µ L을 추가 하 고 15 최고 속도로 원심 RT; s 흐름을 통해 삭제 합니다.</li>
		<li>열에 80% 에탄올 500 µ L을 추가 하 고 RT;에서 2 분에 대 한 최고 속도로 원심 흐름을 통해 삭제 합니다.</li>
		<li>세척제 새로운 2 mL 튜브, 뚜껑을 열고 5 분 최고 속도로 실시간에 원심을 열을 전송 흐름을 통해 삭제 합니다.</li>
		<li>열 및 원심 분리기 전체에 얼음에는 eluate 실시간 유지에 1 분 동안 속도 또는 미래의 분석-80 ° C에서 저장 RNAse 무료 물 16 µ L를 추가 합니다. 참고: 각 샘플의 두 microliters OD 분석에 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
반전 녹음 방송
	<ol>
<li>얼음에 준비 합니다. 각 20 µ L RT-PCR 반응에 대 한 추가 미르 RT 버퍼의 4 µ L, 핵 산의 2 µ L, 총 RNA 2 µ L의 효소, RNAse 무료 물; 3 µ L의 9 µ L 그것을 혼합 하 고 짧게 스핀 다운.</li>
		<li>다음과 같이 열 Cycler 설정. 60 분;에 대 한 37 ° C 95 ° C 5 분; 4 ° C를 개최.</li>
		<li>열 cycler에서 튜브를 제거 하 고 물 RNAse 무료 200 µ L를 추가 합니다. -20 ° C에서 저장 또는 실시간 PCR로 진행.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
실시간 PCR 참고:이 프로토콜은 96 잘 접시 형식을 따릅니다. 얼음에 반응 혼합을 준비 합니다.<ol>
<li>PCR 반응 혼합을 준비 하 고는 프로토콜에 의해 허용 하는 범위에 따라 (위의 miRNAs) 로부터 cDNA를 추가. 여러 반응 일괄 처리에서 준비 될 수 있습니다.</li>
		<li>각 잘에서 PCR 믹스 + cDNA의 25 µ L의 합계를 추가 합니다.</li>
		<li>광 판 인감을 사용 하 여 접시를 봉인.</li>
		<li>실 온에서 1000 x g 에서 1 분 동안 접시 원심</li>
		<li>프로그램 실시간 cycler 다음과 같습니다. 15 분 동안 95 ° C에서 초기 활성화 단계 3 단계 자전거: 15 94 ° C에서 변성 s; 30 55 ° C에 어 닐 링 s; 30 70 ° C에서 확장 s (형광 데이터 수집을 수행); 추가 40 주기; 녹는-cycler 기본에 따라 곡선입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
비교 분석
	<ol>
<li>정규화의 예 ( 표 2참조):<ol>
<li>SCM의 최소 값을 찾을.</li>
			<li>모든 SCM 값이이 최소한을 정상화.</li>
			<li>(나) 관심과 참조 유전자 (REF)의 miRNAs의 Ct 값에서이 값을 뺍니다.</li>
			<li>2-ΔCt 수식을 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Proteomic 분석
<ol><li>
Polysome 분수에서 단백질의 추출
	<ol>
<li>수집 된 자당 분수를 결합 하 여 3 개의 마지막 조각으로. 무거운 (4, 5, 6 및 7 자당의 높은 농도 함께 풀링된 분수에 고효율 polysomes; 그라데이션 튜브의 아래쪽), 분수 표시 빛 (낮은 효율 polysomes 풀링된 분수 8, 9, 10, 11;의 중간에 그라데이션 튜브) 번역 비 (자당의 풀링된 분수 12, 13, 14 및 15 낮은 농도로, 그라데이션 튜브의 상단). 풀링된 분수에 단백질 분석을 수행 합니다.</li>
		<li>100% 재고 trichloroacetic 산 (TCA)를 준비 하 고 어둠 속에서 4 ° C에서 그것을 저장. 100%의 60 µ L 샘플의 0.5 mL 혼합 TCA와 어둠 속에서 하룻밤-20 ° C에서 품 어. 참고: 1.5 mL 낮은 단백질 보존 튜브 ( 재료의 표참조)를 사용 합니다.</li>
		<li>밤새 부 화 후 얼음에 15000 x g30 분 삭제 상쾌한 4 ° C에서 원심 분리기 샘플을 녹여. 참고: 샘플에서 총 단백질의 100 µ g 튜브 하단에 보이는 단백질 펠 릿을 제공합니다.</li>
		<li>사전-20 ° C 냉장고에 아세톤을 진정. 단백질 펠 릿 및 15000 x g15 분 삭제 상쾌한 4 ° C에서 원심 분리기에 찬 아세톤의 0.5 mL를 추가 합니다. 이 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
		<li>공기 건조는 펠 릿. 50 mM Tris HCl 버퍼 (pH 8)의 360 µ L에 펠 릿을 resuspend. 참고: 필요한 경우 사용 하 여 펄스 sonicator resuspend 펠 릿을.</li>
		<li>0.1 m M dithiothreitol의 40 µ L을 추가 (최종 농도 10 m m)와 0.15 M iodoacetamide의 45 분 추가 50 µ L에 대 한 셰이 커에 55 ° C에서 품 어 (최종 농도 17 m m)와 어둠 속에서 30 분 통에 실 온에서 품 어.</li>
		<li>트립 신 솔루션 준비: trypsin의 20 µ g 50 m m 염화 중 탄산염의 100 µ L에서 resuspend. 1:50 (w/w) trypsin 솔루션의 해당 볼륨 샘플을 추가 트립 신: 단백질 비율을 pH 8을 확인 하 고 37 ° C에서 셰이 커에 하룻밤 사이 품 어. 참고: 추가 1 M 염화 중 탄산염 pH 8 하 려 합니다.</li>
		<li>트립 신 소화 후 멋진 벤치 원심 분리기에서 짧게 원심 분리기 샘플 추가 10% 개미 산 트립 신 활동을 끄다 샘플 담 진행을 pH 2-3에. 참고: 샘플 담 대 한 µ 차입 플레이트를 사용 합니다.</li>
		<li>상태는 매 우물에 세 번 뒤 컨디셔닝 0.1% 개미 산의 200 µ L에 의해 세 번 진공을 사용 하 여 메탄올의 200 µ L 96 잘 접시의. 샘플을 로드 하 고 세 번 0.1% 개미 산의 200 µ L를 사용 하 여 샘플 세척을 수행 합니다. 낮은 단백질 보존 0.5 mL 튜브에 두 번 50 %acetonitrile/0.1% 포 름 산의 100 µ L로 샘플을 elute. 참고: 샘플 Elute 천천히 처음에 인력을 사용 하 여 다음 낮은 진공.</li>
		<li>집중 장치를 사용 하 여 건조를 샘플 eluate 증발 하 고 하거나 직접 수행 질량 분석 분석 또는 저장소 사용까지-80 ° C에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
질량 분석 분석
	<ol>
<li>50-100 µ L에서 각 펠 릿 (tryptic 펩 티 드로 구성 된)를 다시 구성 하 고 1 µ L을 질량 분석기에 주입. 참고: 최대 강도 LC/MS/MS 신호를 재구성 및 사출 볼륨을 최적화 합니다. 우리의 경우, 최대 신호 (총 이온 전류; TIC)에 스캔의 2E9에 1E8의 범위에서 했다.</li>
		<li>트랩 열 C18 (300 µ m 아이디 x 5 m m, 5 µ m, 100Å) 다음 펩타이드 분리 C18 열 (250 m m, 2 µ m, 100Å x 75 µ m 아이디)를 사용 하 여 흐름 속도 설정은 300 nL/분 세트 나노 소스 모 세관 온도에서 275 ° C와 2 스프레이 전압 kV.</li>
		<li>5-35% B 90 분, 7 분 및 25 분 (a: 0.1% 포 름 산/물과 이기에 b: 0.1% 포 름 산) 5 %B 평형에 대 한 95 %B 3 분 35-95 %B 선형 그라데이션이 적용 됩니다. CID 모드를 사용 하 여 각 MS1 스캔에서 15 높은 강도 이온에 대 한 MS2 스펙트럼을 취득. 3 질량 분석 복제를 사용 하 여 분석 하는 각 샘플에 대 한. 참고: 최적화 하 고 실험 조건 및 특정 질량 분석 악기에 샘플에 대 한 적합 한 매개 변수를 사용 하 여. 조건/매개 변수 섹션 5.2에서에서 언급입니다. 사용 하 고 우리의 실험실에 최적화 되었다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
단백질 식별/정량
	<ol>
<li>질량 분석 분석 후 원시 스펙트럼 파일 MSConvert 소프트웨어 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html)를 사용 하 여 호환 mzXML 파일으로 변환.</li>
		<li>SEQUEST 검색 엔진 검색 기준으로 예를 들어, UniProtKB/스위스-보호 마우스 데이터베이스 (가장 최신 정식 검토);로 변환 된 파일을 제출 트립 신을 사용 하 여 세미 효소 다이제스트 (KR 후 /-); 최대 2 놓친 분열; 선구자 질량 범위: 400 4500 amu; 정적 수정: carbamidomethyl (C) 57.021465 amu; 펩 티 드 대량 허용 오차: 50 ppm; 조각 대량 유형: monoisotopic. 참고: 다른 단백질 데이터베이스 검색 엔진 및 데이터 파이프라인 사용할 수 있습니다. 예: 쥐, 마우스 및 인간의 데이터베이스 보다 덜 완전 한 인에 대 한 데이터베이스를 사용 하 여 마우스 (또는 인간)에 대 한 검색을 할 수 있습니다 프로테옴 범위 증가 데이터베이스. 이 경우에, 단백질 이름 중복 제거 해야 합니다.</li>
		<li>포스트 검색 분석을 수행 합니다. 데이터를 보기 위한 필터를 설정 합니다. 예를 들어 95% 또는 99%, 즉, 통계 분석 의미 95% 또는 99% 확률의 샘플에 존재 하는 단백질만이 표시 됩니다 확률을 최소 단백질 (단백질 임계값)를 설정 합니다. 펩 티 드 임계값 (예: 95%)에 대 한 필터 설정 즉, 스펙트럼은 펩 티 드를 식별 하는 여부 결정에 사용 될 최소 확률. 펩 티 드 단백질 존재 인지를 결정 하는 최소 수 선택 (2 펩 티 드 단백질 식별을 위한 최소 권장).</li>
		<li>품질/수량에 대 한 확인 된 단백질을 평가 합니다. Proteotypic 펩 티 드 정량화에 사용 되는 확인 하십시오. Isoform 식별 확인 그것 특정 isoform에 고유한 아미노산 시퀀스의 구성 tryptic 펩 티 드의 관찰에 기초 합니다. 어떤 "비슷한" 또는 가상 단백질 있는지 비교 받아야 한다 관찰 알려진된 단백질에 해당 하는 펩 티 드.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).</li>
<li>Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+quantitative+mass+spectrometry+and+electron+microscopy+analysis+of+ribosomal+30s+subunit+assembly+in+e.+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome-profiling+in+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46, e3(2018).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

Polysome 프로필 분석 특정 mRNA 또는 전체 transcriptome6,7의 변환 상태를 분석 하 여 단백질 번역의 연구에 대 한 수 있습니다. 그것은 또한 큰 도움이 현지 번역 synaptosomes8같은 공부 될 필요가 있을 때입니다. 전통적으로,이 방법은 모노-및 polyribosomes 및 자당 그라디언트는 수와 결합 게놈 또는 의도 된 결과6,<sup clas...

마음은 (I) 허 혈과 reperfusion 동적 방식에서 (R)의 부상에 응답합니다. 그러나, 응답 하는 동안 단백질 합성의 급성 변화에 약간의 통찰력이 있다. 이 해결 하기 위해 우리가 했다 polysome1 단백질 풍부 리보솜 및 polysomes, cytosol에서 변환 규제 요인의 재분배를 반영 하는 변화를 식별 하기 위해 프로 파일링의 기초가 튼튼한 방법의 장점 및 새로 합성된 단백질 (NSPs)에 증가. 나의 설정에서 / R, 새로운 mRNAs2;의 전사와 일치 하지 않는 시간에 발생 하는 새로운 단백질 합성의 증가 또한, mRNA 식 수준 및 단백질 풍부 사이 부조화 보고3되었습니다. 이러한 이유로, 우리는 동적 프로테옴에서 변경 내용을 분석 하는 단백질 번역에 의해 반영 하기로 결정 했다. 이렇게 하려면, 우리는 polysome 분수에서 mRNA를 계량 하 고 polysome 분수의 단백질 구성을 분석. 마지막으로, microRNAs (미르) 번역에 대 한 mRNAs의 조절 및 단백질 번역4,5의 효율을 방해할 수 있습니다, 때문에 우리 검사 polysome 분수에 미르의 배포에 초점을 맞추고는 내가 응답 / R.
우리는 지속적인 관류, 그리고 국 소 빈 혈 reperfusion의 30 분 뒤의 30 분 30 분 글로벌 아니 흐름 허 혈 후의 기저 상태에서 수확 조직과 격리 마우스 Langendorff 관류 모델을 사용 하기로 결정 했습니다. 우리 심장 조직의 solubilized 그리고 자당 기온 변화도 통해 polysomes를 분리 proteomic 분석 및 선택적 검출 mRNAs와 PCR 및 microarray, miRNAs의 각각 다음. 방법의이 조합은 mRNA, 미르, NSPs의 동시 검출 뿐만 아니라 nontranslating 분수 사이 규제 단백질, 미르, 그리고 mRNA의 재배포 가능 동적 프로테옴을 이해 하는 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 낮은 효율 polysomes, 그리고 높은 효율 polysomes ( 그림 1참조). 이 프로세스의 동적 규칙에 eIF2α 또는 mTOR 등 규제 요인의 인 산화의 더 분석 하 여 연장 됩니다. 이러한 개별 단계 이제 자세히 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>Vortech Phamaceuticals</td><td>9373</td><td>for euthansia</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent</td><td>103424</td><td>used in langendorff preparation</td></tr><tr><td>forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91110-10</td><td>used to hang the heart</td></tr><tr><td>Langendorff system</td><td>Radnoti + home made</td><td>n/a</td><td>A &#039;four heart&#039; system consisting of custom blown glass, tubing and water baths</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>Krebs buffer and Sucrose gradient</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Krebs buffer and Lysis buffer</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;42&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P-5504</td><td>Krebs buffer</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M7774-500G</td><td>Krebs buffer</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>Krebs buffer</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>Krebs buffer</td></tr><tr><td>Sucrose powder</td><td>Sigma</td><td>S0389-1KG</td><td>Sucrose gradient</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>208337</td><td>Sucrose gradient and Lysis buffer</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>Sucrose gradient and Lysis buffer</td></tr><tr><td>Xylene Cyanole</td><td>Sigma</td><td>X-4126</td><td>Sucrose gradient</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-aldrich</td><td>239763</td><td>Sucrose gradient and Lysis buffer</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>C00019</td><td>RNAse inhibitor for Lysis buffer</td></tr><tr><td>Igepal CA-360 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>Lysis buffer</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>LE-80K</td><td>Ultracentrifugation of the gradients</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman</td><td>SW41</td><td>Ultracentrifugation of the gradients</td></tr><tr><td>Biologic LP (pump)</td><td>Biorad</td><td>731-8300</td><td>Fractionation of the gradients</td></tr><tr><td>BioFrac</td><td>Biorad</td><td>741-0002</td><td>Fractionation of the gradients</td></tr><tr><td>Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube</td><td>Sigma</td><td>Z666513-100EA</td><td>Gradient fraction and RNA extraction</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life technologies</td><td>AM9738</td><td>RNA extraction</td></tr><tr><td>Luciferase Control RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td>RNA extraction</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-4</td><td>RNA extraction</td></tr><tr><td>Glycogen, RNA grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>RNA extraction</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>RNA extraction</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>E7023-1L</td><td>RNA extraction</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>BioRad</td><td>170-8891</td><td>Reverse transcription</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>175-5122</td><td>Quantative PCR</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Kit for total RNA isolation</td></tr><tr><td>miScript II RT Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Kit for miRNA reverse transcription</td></tr><tr><td>miScript Sybr Green PCR Kit (200)</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g</td></tr><tr><td>My Cycler Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>For reverse transcription</td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>For real-time PCR analysis</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td>For quality control of RNA isolation</td></tr><tr><td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9641</td><td>For real-time PCR analysis</td></tr><tr><td>Microseal &#039;B&#039; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>For real-time PCR plate sealing</td></tr><tr><td>Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>UX-24505-02</td><td>For pipetting</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic Pipets, P20</td><td>Gilson</td><td>F123600G</td><td>For pipetting</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic Pipets, P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td>For pipetting</td></tr><tr><td>Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 &amp;micro;L</td><td>Gilson</td><td>17011782</td><td>For pipetting</td></tr><tr><td>Glycogen, RNA grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>Improves total RNA isolation efficiency</td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>RNA isolation and storage; reagent mix</td></tr><tr><td>Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically</td><td>Denville</td><td>C18098-4 (1000910)</td><td>Reverse transcription reaction</td></tr><tr><td>Sharp 10 Precision barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1096-FR</td><td>For pipetting</td></tr><tr><td>Sharp 20 Precision barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td>For pipetting</td></tr><tr><td>Sharp 200 Precision barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1122</td><td>For pipetting</td></tr><tr><td>Tips LTS 1 mL Filter</td><td>Rainin</td><td>RT-L1000F</td><td>For pipetting</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay (200)</td><td>Qiagen</td><td>(it changes according to the miRNA)</td><td>For real-time PCR analysis</td></tr><tr><td>Gradient Master ver 5.3 Model 108</td><td>BioComp Instruments</td><td></td><td>For preparation of sucrose gradients</td></tr><tr><td>trichloroacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>acetone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Amresco</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>iodoacetamide</td><td>Gbiosciences</td><td>RC-150</td><td></td></tr><tr><td>sequencing grade modified trypsine, porcine</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>ammonium bicarbonate</td><td>BDH</td><td>BDH9206</td><td></td></tr><tr><td>formic acid, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117</td><td></td></tr><tr><td>methanol, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind tubes 0.5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431064</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>HLB &amp;micro;Elution plate 30 &amp;micro;m</td><td>Oasis</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant SPD2010</td><td></td></tr><tr><td>sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Oasis180</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>LC trap column PepMap 100 C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td></td></tr><tr><td>LC separation column PepMap RSLC C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>164536</td><td></td></tr><tr><td>mass spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer</td><td></td></tr><tr><td>MSConvert software</td><td>ProteoWizard Toolkit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorcerer-SEQUEST software</td><td>Sage-N Research, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dynamic proteomic and mirna analysis of polysomes from isolated mouse heart after langendorff perfusion

단백질 번역에 동적 변화에 연구 전문된 방법 필요합니다. 여기 우리는 국 소 빈 혈과 reperfusion polysome 프로 파일링과 함께 끼얹는다 절연된 마우스 마음을 사용 하 여 응답에서 새로 합성 된 단백질에 변화를 검사 합니다. 단백질 번역의 동적 변화를 더 이해 하기 우리 mRNAs cytosolic 리보솜 (polyribosomes 또는 polysomes)와 함께 로드 된 또한 미토 콘 드리 아 polysomes 복구 하 고 비교에서 mRNA와 단백질 분포 특징에 높은-효율성 분수 (수많은 리보솜 mRNA에 부착), 낮은-효율성 (적은 리보솜 부착) 또한 미토 콘 드리 아 polysomes, 그리고 번역 비 분수를 포함 하는. miRNAs는 번역 되 고, 번역의 효율성을 줄일 mRNAs와 연결할 수도, 우리는 분수에 걸쳐 miRNAs의 분포를 조사. MRNAs, miRNAs, 및 단백질의 분포는 글로벌 아니 흐름 허 혈과 reperfusion의 30 분 후 30 분 후에 기저 끼얹는다 조건 하에서 시험 되었다. 여기에 우리가이 분석을 수행 하는 데 사용 하는 방법을 제시-특히,이 자당 기온 변화도에서 단백질 추출의 최적화에 대 한 접근은 하지 설명 하기 전에-몇 가지 대표적인 결과 제공.

mRNA 분석 mRNA 결과 각 분수 (그림 3A); 특정 mRNA의 배포로 표현 될 수 있습니다. 정량화, polyribosomal 번역 분수를 결합 하 고 nontranslating 분수 번역 mRNA 풍부의 비율을 제시 번역 비 분수 (그림 3B), 비교. 추가 정보는 별도로에서 낮은 효율 polysome 분수 (그리고 nontranslating 분수에서 별도) 고효율 polysome 분수를 검사 하 여 얻었?...

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Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

여기 선물이 polysome 끼얹는다 절연된 마우스 마음에 프로 파일링을 수행 하는 프로토콜. 우리 심장 관류, 프로 파일링, polysome polysome 분수 mRNAs, miRNAs, 및 polysome 프로테옴의 분석에 대 한 방법을 설명 합니다.

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.6K 조회수.  Cedars-Sinai Medical Center. 여기 선물이 polysome 끼얹는다 절연된 마우스 마음에 프로 파일링을 수행 하는 프로토콜. 우리 심장 관류, 프로 파일링, polysome polysome 분수 mRNAs, miRNAs, 및 polysome 프로테옴의 분석에 대 한 방법을 설명 합니다.

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Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of cardiovascular disease. Although molecular biology is necessary in identifying key changes in the signaling pathway, it is not a surrogate for functional significance. While physiology can provide answers to the question of function, combining physiology with biochemical assessment of metabolites in the intact, beating heart allows for a complete picture of cardiac function and energetics. For years, our laboratory has utilized isolated heart perfusions combined with nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to accomplish this task. Left ventricular function is assessed by Langendorff-mode isolated heart perfusions while cardiac energetics is measured by performing 31P magnetic resonance spectroscopy of the perfused hearts. With these techniques, indices of cardiac function in combination with levels of phosphocreatine and ATP can be measured simultaneously in beating hearts. Furthermore, these parameters can be monitored while physiologic or pathologic stressors are instituted. For example, ischemia/reperfusion or high workload challenge protocols can be adopted. The use of aortic banding or other models of cardiac pathology are apt as well. Regardless of the variants within the protocol, the functional and energetic significance of molecular modifications of transgenic mouse models can be adequately described, leading to new insights into the associated enzymatic and metabolic pathways. Therefore, 31P NMR spectroscopy in the isolated perfused heart is a valuable research technique in animal models of cardiovascular disease.

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Langendorff-mode isolated heart perfusion, in conjunction with 31P NMR spectroscopy, combines the fields of biochemistry and physiology into one experiment. The protocol allows for the dynamic measurement of high energy phosphate content and turnover in the heart while concurrently monitoring physiologic function. When performed correctly, this is a valuable technique in the assessment of cardiac energetics.

를 사용하여 절연 마우스 마음에 심장 기능 및 에너 지학 평가 31 P NMR 분광학

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

연구

의학

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

유전학

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

질병의 염색질 Proteomes의 정량 분석

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

생물학

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

마우스 심근의 분리 및 생리 학적 분석

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

다각형 프로파일링을 사용하여 개발 마우스 뇌의 번역 분석

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

신경과학

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

개발 배아 마우스 심장 밸브 지역에서 단백질 분리

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more than half of the total cardiac cell population, and they contribute to adaptive compensations upon myocardial injury, including inflammatory responses, tissue repair, and scar formation. To study the post-MI cardiac microenvironment, single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) is widely used to identify different cardiac cell types and intercellular communications. Among the procedures of scRNA-seq sample preparation, preparing the cell suspension is one of the most critical steps, because the cell viability can affect the quality of the scRNA-seq results. Therefore, we designed an experimental protocol for preparing a non-cardiomyocyte cell suspension from post-MI mouse hearts with an extra focus on improving the cell viability by choosing mild digestive enzymes, controlling the digestion time, and applying fluorescence-activated cell sorting (FACS). Finally, we isolated CD45+ cells from the non-cardiomyocyte cell suspension obtained through this protocol, and then we performed scRNA-seq.

Here, we describe a protocol to isolate a sufficient amount of single non-cardiomyocytes with high viability from a post-myocardial infarction (MI) mouse heart. This can be used for subsequent single-cell sequencing, flow cytometry analysis, and primary cell culture.

심근경색 후 성인 마우스 심장에서 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 비심근세포 세포 현탁액의 제조

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.