우리는 비그레이드 포장 기술로 개별 마우스 심장 세포를 격리하기 위한 간단한 랑엔도르프 프리 방법을 개발했습니다. 이 방법은 청소년에서 더 오래된 마우스로 심장 세포의 격리를 허용합니다. 랑엔도르프 기반역복은 다양한 실험 동물에서 심장 근구를 분리하는 금본위제로 여겨지고 있다.
그러나, LTA의 수분은 그들의 작은 크기 때문에 마우스에서 기술적으로 어렵습니다. 마우스 심장 수확의 경우, 안락사를 확인하고 복부를 면도 한 후 흉부 구멍을 빠르게 열어 심장을 노출시키고 심장의 약 크기로 절단 된 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 심장의 약 크기로 배핑을 빨아 넣습니다. 파이펫을 들어 올려 곡면가위를 삽입하고 가위를 사용하여 등쪽에서 심장을 소비하여 심토리를 손상시키지 않도록 주의하십시오.
즉시, 약 1 분 동안 얼음 차가운 CIB-EGTA를 포함하는 30 밀리리터 유리 비커에 심장을 배치합니다. 수축이 중단되면, 얼음 차가운 CIB-EGTA를 포함하는 35 밀리리터 배양 접시에 심장을 놓고 폐 및 기타 가시 조직을 제거하십시오. 대략 청소된 심장을 차가운 CIB-EGTA 정점 쪽으로 채워진 심장 스탠드에 놓고 스테레오스코픽 현미경 아래에 스탠드를 놓습니다.
대오르타 주변에서 지방과 결합 조직을 제거합니다. 절단 대동맥의 길이가 너무 길면, 앞쪽 표면이 앞으로 향할 수 있도록 관절 동맥 바로 아래에 대동맥을 손질하고 심장을 방향을 조정합니다. 핀셋을 사용하여 대동맥 끝을 들어 올리고 작은 혈관 클램프를 사용하여 아리아 근처의 대동맥을 고정시키면서 부드럽게 아리아를 밀어 냅니다.
그런 다음 전방측이 위를 향하게 하여 관류 판에 고정된 하트를 놓고 CIB-EGTA 몇 방울로 심장에 수분을 공급합니다. 영양 성 구류의 경우 유연한 확장 튜브에 연결된 예온 된 CIB-EGTA를 포함하는 20 밀리리터 주사기를 주입 펌프에 로드하고 분당 0.5 밀리리터의 유속도로 펌프를 시작합니다. 바늘과 펌프가 채워지면 주사제 바늘을 관혈판에 놓고 대각선 모양의 짧은 면을 앞에 놓고 바늘을 밀어 넣으면 심장의 정점을 만질 때까지 바늘을 밀어 놓습니다.
조심스럽게, 왼쪽 심실의 정점 근처에 바늘을 접시에서 비틀거나 분리하지 않고 심실 챔버에 삽입하여 바늘 삽입의 깊이를 추정하는 마크를 관찰한다. 바늘 삽입이 완료되면 혈액이 관상 동맥에서 흐르기 시작합니다. 테이프를 사용하여 주사 바늘을 플레이트에 고정하고 펌프 속도를 분당 1밀리리터로 늘립니다.
심장이 성공적으로 침투되면 모세관의 버퍼 의 흐름은 에피카르듐 바로 아래에 표시되어야합니다. CIB-EGTA 관류의 2~3밀리리터 후, 관류 완충을 효소 혼합물로 대체한다. 1~2밀리리터가 침투한 후 펌프 속도를 분당 1.5밀리리터로 늘립니다.
파이펫을 사용하여 필요에 따라 심장에서 흐르는 축적된 혈액 함유 난투를 제거하고 perfused 효소의 총 부피가 10 밀리리터에 도달하면 관류를 막습니다. 관류가 끝나면 주사기에서 60mm 배양 접시에 10 밀리리터의 효소 믹스를 히터 매트에 옮기고 20 밀리그램의 BSA를 접시에 넣습니다. 부드럽게 분말을 용해하고 주입 바늘을 제거하고 심장에서 클램프 접시를 소용돌이.
심실과 아리아를 심장에서 제거하고 조직을 BSA 보충 효소 믹스에 넣습니다. 심실 심낭을 분리하려면 두 쌍의 핀셋을 사용하여 에피카르티움을 잡고 심실을 작은 조각으로 부드럽게 당깁니다. 모든 심실 파편이 생성되면, 부드러운 파이펫팅으로 세포를 약 30회 분산시키고 100미크론 메쉬 셀 스트레이너를 통해 소화되지 않은 이물질을 15밀리리터 원심분리기 튜브로 필터링합니다.
원심 분리 후, 칼슘과 BSA로 보충된 미리 따뜻진 CIB에서 심근세포 펠릿을 다시 중단하고 섭씨 37도에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리하고 다운스트림 분석까지 37섭씨에서 유지보수를 위해 적절한 양의 세포 재서스펜션 용액으로 침전된 심근세포를 재중단한다. 심방 심근세포를 분리하려면 아드리아를 칼슘과 BSA로 보충한 예온 CIB 용기에 옮기고 아드리아를 조각으로 찢어 넣습니다.
10 마이크로리터로 설정된 20 마이크로리터 파이펫을 사용하여 파이펫팅하여 조직을 방해하고 원심분리에 의해 해리된 세포를 수집합니다. 그런 다음 적절한 양의 세포 회수 용액으로 심방 세포를 다시 중단합니다. 이 이미지에서는 새로 분리된 심실 심사이클을 관찰할 수 있습니다.
이 격리 절차는 격리의 대략 5 시간 안에 8에서 10 주 된 마우스에서 막대 모양의 정지 심실 심근 세포의 70 내지 80%의 수율을 초래합니다. 새로 고립 된 실행 가능한 세포의 비율은 2 세 이상의 마우스에서 낮습니다. 심실 및 심방 심근세포에 기록된 작용 전위는 랑엔도르프 기반 방법에 의해 얻어진 세포에서 측정된 것과 유사하다.
면역염색 분석은 심실 심낭의 육종 구조의 조직과 하위 배양 후 심근 세포로 심장 섬유아세포의 변형을 평가하는 데 사용될 수 있다. 서양 얼룩 분석은 처리 후에 심실및 심실에 관심 있는 단백질의 특정 발현을 결정하기 위하여 추천됩니다. 효소가 풍부하게 된 후, 아리아와 심실의 단백질은 단백질 추출을 위한 가벼운 힘으로 용해 완충에서 쉽게 균질화될 수 있습니다.
바늘 삽입의 방향과 깊이를 제어하는 것이 중요합니다. 바늘을 왼쪽 심실에 삽입할 때 심실 중격을 관통하거나 밸브를 관통하지 않도록 주의하십시오. 실험의 목적에 따라 난파의 조성을 변경할 수 있습니다.
예를 들어, EGTA 보충 세제는 심장의 세포없는 비계를 만들기 위해 사용될 수있다.
