파라핀 에베디드 대동맥 섹션의 항원 회수에 이어 파라핀 삽입 대동맥 절제물의 이러한 프로토콜은 고양이 혈전증에서 호중구 삼세포 트랩의 역할을 연구하는 유용한 도구가 될 수 있다. 고정 및 파라핀 임베디드 조직에서 면역 형광에 의한 호중구 삼세포 트랩의 검출은 HNE와 같은 기존의 조직학적 스텐트보다 우수하며, 안전한 DNA 및 세포 외 단백질의 동시 검출을 허용합니다. 이 프로토콜은 다른 유형의 혈전 및 기타 수의종에서 사용할 수 있습니다.
고양이 동맥 혈전 내에서 호중구 세포 외 트랩의 식별은 고양이의 혈전증에 역할을 할 수 있음을 시사한다. 여기에 제시된 프로토콜은 지침입니다. 우리는 연구원이 만족스러운 신호를 산출하기 위해 항원 검색 과정의 지속 시간과 조건을 조정하는 것을 강력히 권장합니다.
자동화된 시스템을 사용하여 유리 슬라이드의 섹션의 분리 및 재수화를 수행하려면 유리 슬라이드를 랙에 배치합니다. 3 분 동안 100 % 식염수에 완전히 잠급. 이 단계를 두 번 반복합니다.
단계 사이에 헹지 마십시오. 실온에서 에탄올 농도를 3분씩 3회 감소시키는 데 완전히 잠급한다. 2 분 동안 탈이온 된 물에 완전히 잠그고 한 번 더 반복하십시오.
TBST로 처리 한 후, 100섭씨까지 가열 된 탈이온 된 물로 저수지를 채웁니다. 증기선이 20분 동안 평형화되도록 합니다. 열판에서 트리스와 EDTA를 포함하는 시판가능한 항원 검색 용액을 pH 9.0 ~ 95 ~97도에서 가열합니다.
끓지 않도록 하십시오. 가열된 항원 검색 용액에서 슬라이드를 완전히 구부리고 증기선을 통해 외부 가열을 20 분 동안 계속합니다. 다음으로 TBST로 슬라이드를 3번 세척하여 5분간 세척합니다.
이제 섹션을 차단 버퍼 1에 배치합니다. 30~50rpm 사이의 부드러운 흔들림 아래 실온에서 2시간 동안 배양하세요. 세척없이 즉시 희석 된 토끼 폴리클론 항인간 시트룰러 히스톤 H3 항체100 마이크로 리터를 슬라이드에 직접 적용하십시오.
항체 혼합물의 균일한 분포를 허용하기 위해 각 섹션에 커버 슬립을 놓습니다. 부드러운 흔들림으로 섭씨 4도에서 12~16시간 동안 배양하세요. 그 후, 매번 TBST로 슬라이드를 세 번 씻습니다.
항체를 적용하려면 파이펫을 사용하고 알렉사 플루어(488)에 공주된 염소 항토끼 항체 100마이크로리터를 고르게 분배한다. 주석 호일로 슬라이드를 덮고 부드러운 흔들림 아래 실온에서 1 시간 동안 슬라이드를 배양하십시오. 원고에 따르면 TBST로 세척 한 후 완충2를 막는 섹션을 부드러운 흔들림 아래 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
빛으로부터 보호하십시오. TBST로 매번 5분간 세 번 씻으시면 됩니다. 완충제 3을 차단하는 섹션을 부드러운 흔들림 아래에서 2시간 동안 실온에서 했던 것처럼 차단합니다.
이전에 설명한 바와 같이 12~16시간 동안 4도에서 비오틴 래드 계포계종 토끼 항인간 호중구 엘라스타제 항체로 섹션을 배양한다. TBST로 세척한 후 알렉사 플루어 594 스트렙타비딘 컨쥬게이트와 함께 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 그 후, TBST로 5 분 동안 한 번 씻으시면 됩니다.
제조업체의 지시에 따라 1분 동안 1분 동안 100마이크로리터의 오토플루오레스향 담금질 용액 혼합물을 섹션에 직접 적용합니다. TBST로 슬라이드를 매번 10분 동안 6회 즉시 세척합니다. 각 슬라이드를 300 나노몰러 DAPI의 100마이크로리터로 5분간 덮습니다.
그런 다음 TBST로 매번 3분간 5회 세척합니다. 단면을 둘러싼 유리 슬라이드에 직접 페이드 장착 매체한방울을 발라주세요. 거품을 만들지 않고 커버 슬립을 섹션에 부드럽게 놓습니다.
샘플이 섭씨 4도에서 어둠 속에서 하룻밤 동안 치료하도록 허용하십시오. 혈전을 찾으려면 대동맥, 대동맥 분비화 및 각 태아 동맥의 길이를 따라 10배 의 목표를 가진 위상 대비 현미경 검사를 사용하여 소생하여 스캔합니다. 먼저 357 및 44 나노미터에서 여기를 가진 DAPI 채널을 사용하여 세포없는 DNA에 대한 섹션을 검사합니다.
텍사스 적색 및 녹색 형광 단백질 채널에서 세포외 호중구 엘라스테아제및 시트룰러 히스톤 H3를 각각 식별합니다. 픽셀 강도의 포화를 방지하기 위해 이미지 수집 기간 동안 각 채널의 일관된 노출 시간과 이득을 유지합니다. 호중구 세포 외 트랩은 호중구 엘라스테아제, 시트룰러 히스톤 H3 및 세포 없는 DNA의 기반 공동 국소화를 확인합니다.
헤마톡시린과 에오신 얼룩, 그리고 브라이트필드 현미경검사를 사용하여 고양이 동맥 혈전은 적혈구, 백혈구, 피브린 및 혈소판으로 구성됩니다. NET는 근처의 적혈구와 백혈구를 둘러싼 다양한 길이의 깊은 보라색 스레드의 네트워크로 나타났습니다. 이 프로토콜을 사용하여 면역 형광 현미경 검사법은 세포없는 DNA, 세포 외 세포 세포 석회 분해 히스톤 H3 및 호중구 엘라스타아제로 구성된 NET의 큰 골재를 밝혀냈습니다.
면역 현미경 검사법의 위상 대조하에서, 혈전은 혈관 공간 내의 잘 경계구조로 특징지어졌다. 그러나, 혈전은 어떤 대조군 샘플에서도 검출되지 않았다. 이 그림은 488 나노미터 파장에서 이미지될 때 적혈구와 같은 응고 원소의 심오한 자동 형광을 보여줍니다.
면역 라벨링 후 간단한 자동 불발 담금질은 적혈구가 풍부한 지역에서도 단백질 공동 국소화 및 NET 검출의 감도를 크게 증가시켰습니다. 고정 의 지속 기간은 특정 항원의 면역 반응성. 24시간 이상 탈수와 파라핀 포함을 하지 않는 것이 좋습니다.
또는 메탄올이 없는 파라포름알데히드는 포름알데히드산화로부터 포름산과 케톤에 의해 유물을 제한하는 데 사용될 수 있다. 동일한 종에서 유래된 1차 항체를 사용할 때 간섭을 방지하기 위해, 우리는 이차 항체에 남아있는 결합 부위를 포화시키는 추가 차단 단계를 포함했다. 조사원은 등류형 항체로 구성된 부정적인 통제, 1 차적인 항체 및 면역 라벨링 단계 및 혈전증없이 고양이의 생물학적 통제를 배제해야 합니다.
혈전염의 조직 한계의 자동 불발성은 호중구 세포 외 트랩의 현미경 식별을 망치 수 있습니다. 조사자는 극한형형광을 사용하여 형광을 최소화할 수 있다. 이 기술은 그밖 수의학 종에 있는 호중구 세포 외 덫의 연구를 위한 귀중한 공구일 수 있습니다.
이것은 혈전증의 병리생리학의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다.
