이 프로토콜은 배아 치사 유전자 녹아웃의 종양 성장 역할을 연구하기 위한 대안적인 생체내 방법을 제공한다. 이 방법의 장점은 일반적으로 배아 치사성인 유전자 녹아웃이 생체 내에서 그들의 기능 상실 효과를 연구하기 위해 유전자 조작된 마우스 모델로부터 유래된 종양에서 수행될 수 있다는 것이다. 이 기술은 전통적인 유전자 녹아웃 마우스 모델로부터 달성할 수 없는 배아 필수 유전자의 생체내 역할을 연구할 필요가 있는 질환에 적용될 수 있다.
동물 모델을 생성하는 데는 적절한 재조합이 달성되도록 하기 위해 아데노바이러스 감염에 대한 최적의 MOI를 결정하기 위해 시간이 걸리고 경험적 테스트가 요구된다. 우선, 원하는 유전자형을 가진 마우스를 확인하십시오. 종양을 가진 마우스가 인간 종말점에 도달하면 마우스를 안락사시키고 멸균 메스 나이프를 사용하여 종양을 제거하십시오.
메스 나이프를 사용하여 빵 덩어리 스타일의 절단으로 종양을 세 개의 절편으로 해부하여 초기 통과 배양 생성 및 분석 분석을 위해 플래시 동결을 포매하는 포르말린 고정 파라핀을위한 조직 세그먼트를 생성합니다. 다섯 마이크로미터 두께의 포르말린 고정, 파라핀 포매된 조직 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색합니다. 병리학자가 종양을 확인하면 면역 조직 화학 염색을 수행하여 종양 진단을 확인하십시오.
갓 채취한 악성 말초 신경 외피 종양 조직을 얼음 위에 얼음처럼 차가운 멸균 PBS 10밀리리터에 넣은 다음, 이를 멸균 작업 영역으로 옮겨 조기 통과 배양을 확립한다. 종양 조직을 두 개 내지 4밀리미터 조각으로 분쇄하고, 10 밀리리터의 성장 배지를 함유하는 10 평방 센티미터 처리된 조직 배양 접시에 여덟 내지 10회 트리투레이트한다. 이들 조직을 10 나노몰 뉴레귤린-1 베타 및 2개의 마이크로몰 포스콜린으로 보충된 고 글루코스 DMEM-10 성장 배지에서 배양한다.
조기에 계대된 종양 세포를 1.5배의 밀도로 10 내지 10 평방 센티미터 당 여섯 번째 세포로 시드하고 DMEM-10 성장 배지를 함유하는 조직 배양 접시를 처리하였다. 12 내지 16시간 후, 부착성 배양물을 2 내지 4밀리리터의 DPBS로 세척하고, 세포를 무혈청 DMEM의 10 밀리리터에서 세포당 대략 400개의 플라크 형성 단위로 아데노바이러스로 감염시킨다. 감염 48시간 후, 약 50 내지 100% 양성 세포로 효율적으로 감염되었는지 확인하기 위해 형광 현미경으로 EGFP 신호에 대한 세포를 간략하게 확인한 다음, FACS가 EGFP 양성 감염된 세포를 분류한다.
FACS 분류 후, 세포를 조직 배양 배양기에서 적어도 24 내지 48시간 동안 회수하게 하고, 이어서 시험관내 세포 기반 분석 또는 생체내 이식을 위한 세포를 준비한다. 분류된 EGFP 양성 세포의 일부로부터 분리된 게놈 DNA를 사용하여 PCR을 수행하여 Erbb4 결실을 확인하였다. 이미지 기반 자동 세포계를 사용하여 96-웰 플레이트에 플레이팅된 분류된 종양 세포 상에서 다음 7일에 걸쳐 증식 검정을 수행한다.
후크와 프로피듐 요오드화 염료로 세포를 얼룩지게하고 자동화 된 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 계산하여 세포의 이미지를 캡처하십시오. 표준 산 구아니디늄 페놀 및 클로로포름 기반 방법을 사용하여 분류된 종양 세포로부터 총 RNA를 분리하십시오. 소프트웨어를 열어 기본 설정을 사용하여 프로그램별 단계에 따라 RNA 서열 정렬을 수행합니다.
분석 방법, RNA 탐색을 선택한 다음 마우스 참조 게놈을 선택합니다. 시퀀싱 코어에서 제공하는 경우 BED 파일을 업로드합니다. FASTQ 시퀀싱 파일을 업로드하고 파일에 고유한 복제 이름을 할당합니다.
그룹은 FASTQ 파일을 복제하고 파일을 복제 세트로 지정합니다. 강력한 통계적 파워로 차등 유전자 발현 신호를 식별하기 위한 통계 및 정규화 분석을 위해, 분석 소프트웨어를 열고 GFP FASTQ 파일을 제어 데이터 세트로 선택하십시오. 그런 다음 통계 및 정규화 방법으로 DESeq2를 선택하고 어셈블리 및 분석을 시작합니다.
오픈 액세스 기능적 농축 분석 도구에 통합된 유전자 온톨로지 데이터 세트를 사용하여 통계적으로 유의한 확인된 Erbb4 매개된 DEG에 대한 기능적 농축 분석을 수행하여 Erbb4 유전자 손실의 생물학적 및 경로 유의성을 결정한다. 종양 세포를 마취된 마우스의 좌골 신경에 주입하여 감염 후 세포에서 생체내 동종이식편 성장 잠재력을 평가한다. 종양이 필요한 크기에 도달하면, 이전에 입증된 바와 같이 안락사된 마우스로부터 종양을 두세 개의 절편으로 해부한다.
하룻밤 사이에 하나의 조직 절편을 4% 파라포름알데히드에 고정시킨 다음, 고정된 부분을 파라핀에 내장시킨다. FFPE 조직에서 다섯 마이크로 미터 두께의 절편을 만든 후 슬라이드에 섹션을 장착하고 이전에 입증 된 바와 같이 H & E 및 면역 염색을 사용하여 이식 된 조직에서 종양 세포의 존재를 확인하십시오. 두 실험 조건 간의 생체내 Erbb4 발현 차이를 확인하기 위해, 포르말린 고정, 파라핀 포매된 조직을 Erbb4 특이적 항체로 염색한다.
악성 말초 신경 외피 종양 조직 세포의 형질도입을 아데노바이러스로 분석하였다. EGFP 발현 세포를 형광현미경을 이용하여 검출하고, 총 세포 수는 위상차 현미경을 이용하여 측정하였다. 형질감염 효율에 따라 Cre 매개 유전자 절제 후, PCR 유전자형은 대조군 형질도입에 비해 완전한 유전자 녹아웃 및 유도 및 유도되지 않은 세포의 이종 집단을 나타내었다.
악성 말초 신경 시스 종양 조직의 동위원소 동종이식편에서 발견된 특징적인 조직병리학은 원래의 유전자 조작된 동물 모델로부터 유래된 종양과 비교하여 세포 형태학의 차이를 입증하였다. Erbb4 절제는 아데노5-CMV-Cre-ablated 세포 조절 아데노5-CMV-GFP-형질도입된 세포에서 세포 밀도 및 세포 증식을 감소시켰다. 아데노5-CMV-Cre 또는 EGFP 바이러스로 형질도입된 종양 세포에서 Erbb4의 발현은, 대조군 아데노5-CMV-EGFP 처리된 동종이식편 종양에 비해 아데노5-CMV-Cre 형질도입된 동종이식편에서 감소하였다.
혈관 밀도는 CD31에 대한 면역반응성 검출을 통해 평가되었고, 대표적인 결과는 대조군 아데노5-CMV-EGFP 형질도입된 세포에 비해 아데노5-CMV-Cre 형질도입된 세포의 동종이식편에서 현저하게 감소된 혈관 밀도를 나타냈다. 유전자 절제 후, 세포는 증식, 이동, 3D 성장 또는 미세 환경 변경뿐만 아니라 생체 내 동위원소 주사와 같은 많은 다른 유형의 세포 기반 분석에 사용될 수 있습니다.
