Name: biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method
Uploaded: 2015-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
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저자는 NJC에 국립 연구 재단 (NRF -NRFF2011-01과 NRF2015NRF-POC0001-19), 국립 의료 연구위원회 (NMRC / CBRG / / 2012 0005), 그리고 난양 기술 대학에서 지원을 인정하고자하는

친수성 고체 지지체에 지원되는 지질 이중층 1. 형성 <ol><li> 10 ㎎ / ㎖의 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 지질 스톡 용액을 제조 (DOPC) 1 ㎎ / ㎖의 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- N - (리사 민 로다 민 B 각 지질 분말을 용해시켜 술 포닐) (RH-PE)는 (적절히 이소프로판올 용액의 분석 질량 균형)을 미리 칭량. </li><li> 희석하고, 최종 농도 원하는 지질 혼합물을 제조하기 위해 이소프로판올 스톡 용액을 혼합한다. 형광 현미경 및 FRAP 실험, 0.5 중량 % RH-PE는 지질 혼합물을 포함한다. </li><li> 이 채워질 때까지 미세 유체 채널로 이소프로판올 지질 혼합물을 주입한다. </li><li> 약 10 분 동안 유리 표면에 지질 혼합물을 배양한다. </li><li> 서서히 매우 낮은 유속으로 연동 펌프를 사용하여 물 또는 완충액과 지질 용액을 대체(10 ~ 50 μL / 분). 또한, 반복 피펫에 의한 지질 혼합물을 교체합니다. </li><li> 잔류 이소프로판올을 제거하기 위해 과량의 완충액으로 철저하게 채널을 헹군다. </li></ol> 콜레스테롤이 풍부한 지원 막 2. 형성 참고 : 고체 표면 (SiO2를하면) 소포 융합을 지원하지만 콜레스테롤이 풍부한 소포는 높은 강성 (30) 굽힘 때문에 막 조성 (고 콜레스테롤) 소포 융합을 억제한다. <ol><li> 제 이소프로판올 각 분말을 용해시켜 10 ㎎ / ㎖의 DOPC 지질, 10 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤, 1 ㎎ / ㎖ RH-PE를 함유하는 스톡 용액을 제조 하였다. </li><li> 반복 2.1 단계에서 제조 된 원액을 사용하여 1.2-1.6 단계를 반복합니다. </li></ol> 3. 막 유동성 분석 <ol><li> 10 분 동안 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) 용액 (1 %)의 유리 슬라이드를 담근다. </li><li> 탈 이온수로 철저하게 슬라이드를 세척하고 재치 린스시간 에탄올. </li><li> 불어 건조 질소의 부드러운 흐름을 사용하여 슬라이드를. </li><li> 산소 플라즈마 챔버에서 최대 무선 주파수 전력에서 30 초 동안 산소 플라즈마에 노출 슬라이드. </li><li> 밑 상업 미세 유체 챔버 (그림 1A)의 보호 필름 코팅 트위터를 사용하여 제거하고 챔버 (그림 1B)의 접착면에 유리 슬라이드를 연결합니다. </li><li> 챔버의 입구와 출구의 위치에 커넥터와 튜브를 조립하고 현미경 단계 (그림 1C)에 미세 유체 채널을 배치합니다. </li><li> 미세 유체 채널의 형광 표지 된 지원 지질 이중층 형성 [바람직한 지질 조성물을 사용하여 반복 스텝 (1) (예, 0.5 ㎎ / ㎖ DOPC) 0.5 중량 % RH-PE 유기 용매를 포함]. </li><li> 이미지를 캡처하기 위해 60X 기름 침지 목표 (NA 1.49)와 이중층 평면을 찾습니다. </li><li> 두 사전 표백제 이미지를 가지고, 다음 (30) 사진 - 표백1, 532 nm의, 100 mW의 레이저 빔으로 넓은 원형의 자리를 해요. 그 강도가 안정 될 때까지 photobleaching에 전에 레이저를 따뜻하게. photobleaching에 바로 후 표백 지점에서 형광 강도의 복구를 수행하기 위해 2 분 동안 1 초마다 일련의 이미지를 캡쳐. </li></ol> 4. 콜레스테롤 정량 분석 <ol><li> 산소 플라즈마 챔버에서 최대 무선 주파수 전력에서 30 초 동안 산소 플라즈마에 실리콘 이산화물 코팅 된 석영 결정 센서 칩을 노출. 챔버로부터 칩을 분리하고 즉시 측정 챔버에 칩을 마운트. </li><li> 실험 전에 먼저 적정 부착을 보장하기 위해 공중에 센서 칩의 주파수 및 분산을 획득. <ol><li> 상업 Q 감지 E1 또는 E4 QCM-D 악기를 들어, Q-소프트 소프트웨어 프로그램을 실행하고 &quot;취득&quot;버튼을 클릭 &quot;설정 측정&quot;을 선택합니다. </li><li> 표시되는 새 창에서, 3, 5, 7을 확인, 9, 11, 13 배음 다음 찾기 및 공명 스펙트럼을 확인하기 위해 실행을 클릭합니다. (24)에서 온도를 설정 기음. 하나 또는 그 이상의 공진 주파수가 예상 된 값과 일치하지 않는 경우, 칩 탑재를 확인하고 합의에 도달 할 때까지이 과정을 다시 수행한다. </li></ol></li><li> 연동 펌프를 시작하고, 100 μL / 분의 유속으로 상기 측정 챔버 내에 완충액 (10 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, pH를 7.5)를 흐른다. </li><li> 소프트웨어 프로그램에서 &quot;취득&quot;버튼을 클릭 공진 주파수와 에너지 소비 신호를 기록하기 위해 &quot;다시 측정&quot;을 선택합니다. 안정된 기준은 주파수와 소비 변화에 대해 얻을 때까지이 단계를 반복합니다. 참고, 시간의 함수로서 기록 될 수있는 추가 주파수 및 소산 교대있을 것이다 이하 단계는. </li><li> 10 분 동안 (지질 제외) 이소프로판올을 주입한다. </li><li> DOPC에서 지질 / 콜레스테롤 혼합물을 주입10 분간 이소프로판올에 0.5 ㎎ / ㎖의 총 지질 농도와 원하는 몰비. </li><li> 100 μL / 분의 유속으로 20 분 동안 버퍼를 주입. </li><li> 버퍼 (레이트 100 μL / 분으로 흐름) 주파수 신호가 안정된 값에 도달 할 때까지 준비 1mM의 메틸 - β - 시클로 덱스트린 (MβCD)의 용액을 주입한다. </li><li> MβCD 처리 공정에 의해 야기되는 상대적으로 양의 주파수 변화를 측정하고 [ΔM = 사우어 브레이 식을 이용하여 질량 값 Δf에 CHO 및 Δf에 DOPC 값을 변환하여 콜레스테롤 및 DOPC 지질의 질량을 계산 - (C / N) × ΔF, 여기서 C = 17.7 NG / cm 2, N : 상음]. </li><li> 고려 DOPC 지질 (786.1 g / mol) 및 콜레스테롤 (386.6 g / 몰)의 분자량을 가지고, SLB 콜레스테롤의 몰분율을 계산한다. </li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

이 작업에서, 용제 - 교환 프로토콜은 고체 지지체에 배양 알코올 (이소프로판올, 에탄올 또는 n- 프로판올)에있는 지질로 표시 한 후 알코올 시리즈를 구동하기 위해 수성 완충액으로 점차 대체 위상 천이 결국 라멜라 상 지질 이중층 (24)의 제조. 이 방법은 소포 융합 방법에 난치성 인 금,은 등의 표면에 담지 된 지질 이중층의 제조를 가능하게하는 것이 도시되어있다. 최적의 지질 농도 범위 (0,1 - 0,5 ㎎ / ㎖)는 지금까지 시험 표준 실험에서 완전한 포맷 이중층 형성을 위해 결정되었다. 이중층의 0.1 ㎎ / ㎖, 이산 미세한 패치 아래 지질 농도로 형성했다. 한편, 0.1 ㎎ / ㎖ 이상의 농도에서 및보다 낮은 0.5 ㎎ / ㎖, 완전하고 균일 이중층이 형성된다. 이 범위보다 지질 농도, 유체 이중층 여전히 검증기로 형성 하였다FRAP 분석하여 에드 그러나, 형광 현미경은 이중층 위에 추가적인 지질 구조의 존재를 드러낸다. QCM-D 분석에 의해 결정되는 바와 같이 현저하게, 이러한 추가 지질 구조체의 형태는 배양 단계 동안 사용 된 알코올에 의존. 에탄올의 경우, 상대적으로 높은 F Δ와 Δ D 변화는 흡착 층 소포 얻어 QCM-D 서명을 닮은. 이소프로판올 또는 n- 프로판올 대신 사용한 경우 Δ D가 상당히 높았다, Δ의 F는, 이중층 (-30 Hz에서 -40 사이의 최종 Δ F)에 대한 기대 값보다 약간 높았다. 이러한 QCM-D 응답은 (어떤 경우에는 형광 현미경으로 보이는)을 막 표면으로부터 외측으로 돌출되어 연장 된 지질 구조체 (예를 들어, 웜 형상 미셀)을 위해 예상된다. 용매의 환율은 ESPEC, 중요 할 수있는 또 다른 중요한 변수이다낮은 지질 농도 (예, 0.1 ㎎ / ㎖)을 사용하는 경우 ially. 낮은 지질 농도의 빠른 용매 교환은 불완전 이중층의 형성으로 이어질 수 있습니다. 본 논문에서는 QCM-D 측정치 (Q 감지 E4 측정 챔버), 약 100 μL / 분의 유동 속도를 위해 사용되는 표준 측정 챔버 내에, 높은 재현성 완전한 이중층 형성에 적합 하였다. 다른 형상 및 부피 유동 세포, 최적의 유량은 변할 수 있고, 본 명세서에서 제안 된 실험적 단계에 기초하여 결정되어야한다. 소포 융합 난치성이다 표면에 담지 된 지질 이중층을 형성 할뿐만 아니라, SALB시켜 복합 조성물 지원 막의 제조의 문을 열고, 파열 수 지질 소포에 대한 필요성을 회피하는 데 사용될 수있다. 예시 조성물로서, 콜레스테롤의 높은 비율과 지질의 혼합물을 조사 하였다. 콜레스테롤 mamm의 중요한 구성 요소알랸 세포막, 및 분획 (적혈구, 예), 막 지질 조성의 45 ~ 50 몰 %에 접근 할 수있다. 따라서, 인간 세포막을 나타내는 지질 이중층 심지어 간단한 모델은 콜레스테롤을 포함한다. 소포 융합은 10-15 %의 콜레스테롤을 함유하는 유체의 지질 이중층을 제조하는데 사용될 수 있지만 36 (QCM-D의 측정에 의해 정량으로, 57 몰 % 이하), SALB 방법은 콜레스테롤이 높은 분획을 함유하는 유체의 지질 이중층의 형성을 가능하게한다. 콜레스테롤의 수준이 더 (63 몰 % 이하) 승온 그러나, 스트라이프 형상 영역 (37)을 관찰 하였다. 공존 도메인은 공기 - 물 계면에서 콜레스테롤 / 인지질 단층의 상태도에서 β 영역에서 관찰되는 연상 액체였다. 전체적으로 SALB 방법은 내가 특히, 지원되는 지질 이중층을 형성하는 간단하고 효율적인 방식으로 도시되어있다종래 소포 융합 방법의 범위를 벗어나는 경우, N. 지금까지 QCM-D 기술과 형광 현미경 주로 SALB 법에 의해 형성된지지 지질 이중층을 특성화하기 위해 사용되었다. 기대, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) (38), 원자력 현미경 (AFM) (39, 40)를 포함하여 표면 성 분석 측정 기법의 넓은 범위가, 적외선 분광기 (41)를 푸리에 변환, X 선 (42) 및 중성자 반사율 43 수 상기 특성화 및 단순 및 복합 이중층 구성 SALB 방법에 의해 제조 연구하는 데 사용할. 이 새로운 기능은 간단하고 강력한 실험 프로토콜을 이용하여 인공 세포막을 탐색 할 수 있습니다 과학자의 더 많은 수의 문을 엽니 다.

고체지지 지질 이중층 1 (SLB)은 이러한 이중층 두께, 이차원 확산 지질 및 막 - 관련 생체 분자를 호스팅 할 수있는 능력으로 생체막의 기본 특성을 보존 다목적 플랫폼이다. 자연적인 세포막의 복잡성이 간단한 플랫폼 (3), 바이러스 및 바이러스 유사 입자는 4,5- 결합을 결합 등 뗏목 형성 2 단백질로서 세포막 관련 프로세스의 시험 관내 연구를위한 효율적인 플랫폼으로서 기능하는 것으로 나타났다 및 셀 (6) 신호. 고체 지지체에 근접하여 형성된, SLB 플랫폼은 전반사 현미경 (TIRF), 수정 진동자 마이크로 밸런스 방산 (QCM-D), 및 임피던스 분광법으로 표면 성 측정 기술의 범위와 호환된다. 몇몇 방법은 기포를 포함 SLB 수의 다른 유형을 생성하기 위해 개발되어왔다서브 마이크론 크기의 지질 명소에 대한 붕괴 7 딥 - 펜 나노 리소그래피 (8), 스핀 코팅 이중층 스택과 랭 뮤어 - 블로 젯 (LB) (10) 및 풀 스패닝, 하나의 지질 이중층 코팅 소포 융합 (VF) 11 9. VF 방법은 연속 지질 이중층을 형성하도록 고체 지지체 이후 자발 파열과 융합 소형 단일 층 소포 흡착 이루어져있다. 그러나, 생리 학적 조건 하에서 자발적 소포 파괴는 주로 이산화 규소, 유리, 운모 등의 실리콘계 재료로 한정된다. 또한, 소포 파열은 콜레스테롤 또는 음으로 하전 된 지질의 높은 분획을 함유하는 것과 같은 복잡한 지질 조성물의 소포에 대해 자발적으로 발생하지 않는다. 시스템에 따라, 소포 파열은 또한 온도 12 용액의 pH를 13, 14 및 염분, 삼투압 충격 (15)와 같은 실험 조건을 조정하여 유도 될 수있다 </s압력 (16), 또는 칼슘과 같은 가의 이온 첨가 닫&gt; 또는 (17). 대안 적으로, 막 - 활성 AH 펩티드의 범위에 소포 파열 이중층 형성 선도 흡착 소체 층을 불안정하게하기 위해 도입 될 수있다 18-22면. 또한, 성공적인 이중층 형성 시간과 특정 막 조성물을 달성하기 어려울 수있다 소형 단일 층 소포 잘 조절 집단의 제조를 필요로한다. 따라서, 최적의 경우에 높은 효율에도 불구하고 (예를 들면, 소체 (23)의 동결 - 해동 광범위한 전처리 후), 소포 융합의 일반적인 애플리케이션은 적절한 기판과 막 조성물의 범위에 의해서만 한정된다. 용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법 24-28 지질 소포를 필요로하지 않는 다른 제조 기술이다. 이 방법은 증착 O에 기초SLB 형성을 유발하기 위해 수성 완충액이 용매의 점진적인 교환 하였다 수혼 화성 유기 용매의 존재하에 고형 표면 상 F 지질 분자. 용매 교환 단계, 지질, 유기 용매의 삼원 혼합물, 및 물 중에 벌크 용액 라멜라 상 구조 형성 및 고체 기판에 SLB 리드 물 분율 증가와 직렬 위상 천이를 겪는다. 중요한 것은,이 자기 ​​조립 행은 일반적으로 흡착 SLB 소체의 변환을위한 제한 단계이다 소포 파열에 대한 요구를 무시. 프로토콜은 이산화 규소, 산화 알루미늄, 크롬, 인듐 주석 산화물, 및 금을 포함하여 다양한 표면에 적용될 수있다. 본 논문에서는 첨부 영상에서 SALB 및 소포 융합 방법에 의해 지질 침착의 비교를 제시한다. 특히, 실험적인 매개 변수의 영향을 포함한 지질 농도, 유량 및 SALB 방법에 의해 형성된 이중층의 품질에 수혼 화성 유기 용매의 선택은, 논의된다. 제작 SLB 수의 분석 특성화 (FRAP) 기법 photobleaching에 후 QCM-D, 형광 현미경, 형광 회복에 의해 수행된다. QCM-D 모니터링 켈러와 Kasemo (29)에 의해 수행 된 선구적인 작업부터, 광범위하게 정량적으로 이중층 형성을 조사하기 위해 사용 된, 표면에 민감한 질량 측정 기술이다. 형광 현미경은 막 균일 성 검사뿐만 아니라 멤브레인 도메인의 시각화를 허용한다. FRAP 기술은 유체 막의 필수 속성 인 SLB, 지질 분자의 측방 이동을 결정하는 표준 도구이다. 본 연구의 첫 번째 부분은 실리콘 이산화물과 금에 이중층을 형성하도록 시도인가 SALB의 QCM-D 분석과 소포 융합 방법을 포함한다. 두 번째 부분에서는,준비 및 SALB 법 콜레스테롤 농도 범위를 함유하는지지 막의 특성이 입증되고, 결과는 소포 융합 방법에 의해 수득 된 것과 비교한다.

<table><tbody><tr><td>QCM-D silicon dioxide-coated substrates</td><td>QSense AB,&amp;nbsp; Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QCM-D gold-coated substrates</td><td>QSense AB,&amp;nbsp; Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Sense E4 module</td><td>QSense AB,&amp;nbsp; Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaner, PDC-32G</td><td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td><td>PDC-001 (115V)&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoethanolamine-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810150P</td><td></td></tr><tr><td>cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>673773</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>n-propanol</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>279544</td><td></td></tr><tr><td>Sticky-Slide I 0.1 Luer</td><td>IBIDI</td><td>81128</td><td></td></tr><tr><td>Male elbow 1/8&amp;rdquo;</td><td>Cole-Parmer</td><td>30505-70</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing 1.6&amp;#160;mm ID</td><td>IBIDI</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>71725</td><td></td></tr></tbody></table>

biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method

세포막을 모방하기 위해,지지 지질 이중층 (SLB)는 고체 기판에 biofunctionality 생체 적합성을 부여하면서 막 - 관련 프로세스의 체외 조사 가능 매력적인 플랫폼이다. 인지질 소포체의 자발적 흡착 및 파열 SLB 수를 형성하는 가장 일반적으로 사용되는 방법이다. 그러나, 생리 학적 조건 하에서, 소포 융합 (VF)는 지질 조성물 및 고체 지지체의 서브 세트로 제한된다. 여기서는 소체를 필요로하지 않는다 SLB 수를 형성하기 위해서 용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 형성 방법이라고 한 단계 반응 절차를 설명한다. SALB 방법은 SLB 형성을 유발하기 위해 수혼 화성 유기 용매 (예 : 이소프로판올) 및 수성 완충 용액으로 교환 후속 용매의 존재하에 고형 표면에 지질 분자의 침착을 포함한다. 연속 용매 교환 단계의 적용을 가능하게모니터링 이중층 형성 및 표면 성 바이오 센서의 넓은 범위를 사용하여 후속의 변경에 적합한 관류 구성 방법. SALB 방법은 소포 융합되는 난치성 포함한 친수성 ​​고체 표면의 광범위한 SLB 수를 제조 할 수있다. 또한, 소포 융합 방법을 사용하여 제조 할 수없는 지질 조성물로 이루어지는 SLB 수의 제조를 가능하게한다. 여기서, 우리는 두 가지 예시 친수성 ​​표면, 이산화 규소 및 골드 SALB 종래 소포 융합 방법으로 얻어진 결과를 비교. SALB 방법을 통해 제조 된 고품질의 이중층의 제조를위한 실험 조건을 최적화하기 위해, 성막 공정에서의 유기 용제의 종류, 용매 교환의 속도 및 지질 농도를 포함하는 다양한 파라미터의 효과가 해결 정보와 함께 논의 . 콜레스테롤이 높은 분획을 함유하는지지 막의 형성도이다 귀신막 구성의 광범위한 SALB 기술의 기술 능력을 강조 SALB 방법으로 보이는 것.

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Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

우리는 지질 소포를 사용하지 않고 고체 기판 상에지지 지질 이중층을 형성하는 실험 프로토콜을 제시한다. 우리는 다양한 생물학적 응용을위한 콜레스테롤이 풍부한 도메인과 지질 이산화 규소 및 골드 이중층뿐만 아니라지지 막을 형성하는 하나의 단계 방법을 보여준다.

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

14.8K 조회수.  Nanyang Technological University.  우리는 지질 소포를 사용하지 않고 고체 기판 상에지지 지질 이중층을 형성하는 실험 프로토콜을 제시한다. 우리는 다양한 생물학적 응용을위한 콜레스테롤이 풍부한 도메인과 지질 이산화 규소 및 골드 이중층뿐만 아니라지지 막을 형성하는 하나의 단계 방법을 보여준다. 

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Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

스퀴지 기반의 조립 방법과 생체막 마이크로 어레이의 형성

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

연구

생체공학

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

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A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

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생화학

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

폴리 디메틸 실록산 박막을 사용하여 자동화 지질 이중층 제막

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions under various membrane lipid compositions. Among them, the droplet interface bilayer has gained popularity; however, the large membrane size hinders the recording of low electrical background noise. We have established a contact bubble bilayer (CBB) method that combines the benefits of planar lipid bilayer and patch-clamp methods, such as the ability to vary the lipid composition and to manipulate the bilayer mechanics, respectively. Using the setup for conventional patch-clamp experiments, CBB-based experiments can be readily performed. In brief, an electrolyte solution in a glass pipette is blown into an organic solvent phase (hexadecane), and the pipette pressure is maintained to obtain a stable bubble size. The bubble is spontaneously lined with a lipid monolayer (pure lipids or mixed lipids), which is provided from liposomes in the bubbles. Next, the two monolayer-lined bubbles (~50 &#181;m in diameter) at the tip of the glass pipettes are docked for bilayer formation. Introduction of channel-reconstituted liposomes into the bubble leads to the incorporation of channels in the bilayer, allowing for single-channel current recording with a signal-to-noise ratio comparable to that of patch-clamp recordings. CBBs with an asymmetric lipid composition are readily formed. The CBB is renewed repeatedly by blowing out the previous bubbles and forming new ones. Various chemical and physical perturbations (e.g., membrane perfusion and bilayer tension) can be imposed on the CBBs. Herein, we present the basic procedure for CBB formation.

Here, we present a protocol for the formation of lipid bilayers using a contact bubble bilayer method. A water bubble is blown into an organic solvent, whereby a monolayer is formed at the water-oil interface. Two pipettes are manipulated to dock the bubbles to form a bilayer.

패치-Clampers에 대 한 연락처 거품 Bilayers 지질 Bilayer 실험

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...