유망한 유전자 치료 접근법의 효율성과 안전성을 평가하기 위해 생체 내 모델에서 검증된 전임상에서 유전자 변형 세포의 포괄적인 테스트가 중요합니다. 관련 세포 표면 마커의 보존 시약의 교차 반응성, 그리고 임상 매개 변수를 밀접하게 모방하는 비 인간 영장류 모델을 따라 환자에게 투여 된 동일한 지원 치료를 적용하는 능력. 나와 함께 절차를 시연하는 것은 아나이 페레즈, 박사 한스 - 피터 키엠의 실험실에서 연구 기술자가 될 것입니다.
건강한 비인간 영장류 기증자로부터 분리된 골수의 10-12 밀리리터 알리쿼트를 50 밀리리터 원추형 튜브에 첨가하여 시작합니다. 용혈 완충액으로 튜브의 부피를 최대 50 밀리리터까지 가져와 실온에서 최대 7 분 동안 세포를 배양하십시오. 세포 파편을 원심분리하여 제거하고, 상류체의 마지막 2~5밀리리터를 제외한 모든 것을 흡인시합니다.
튜브를 가볍게 하여 잔류 체상체 부피의 펠릿을 다시 중단하고, 골수 현탁액을 70 마이크로미터 모공 세포 여과기를 사용하여 새로운 50 밀리리터 튜브로 이송하여 혈전을 제거합니다. 신선한 용혈 버퍼를 추가하여 최대 50 밀리리터의 부피를 가져오고 원심 분리로 수집하기 전에 실온에서 5 분 동안 세포를 배양합니다. 모든 슈퍼나티를 흡인시키고 최대 버퍼의 10 밀리리터에서 셀을 재일시 중단합니다.
또 다른 70 마이크로 미터 공공 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터링하기 전에, 신선한 버퍼의 40 밀리리터로 튜브를 헹구고, 셀 서스펜션으로 세척을 풀. 표준 자기 보조 세포 선별 프로토콜에 따라 CD34 양수 세포를 농축한 후, 비드 분리 된 세포를 최대 50 밀리리터의 신선한 최대 버퍼로 세척하고 HSPC 배지에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 그런 다음 세포의 10~20밀리리터를 환기 조직 배양된 T75 플라스크로 플레이트하여 섭씨 37도및 이산화탄소 인큐베이터5%에서 야간 배양을 치료하였다.
골수의 세포 샘플의 사전 및 후 농축 순도를 평가하기 위해 모든 이벤트가 흩어져 있는 CD34 양성, 조혈 줄기 세포, 다능성 안에리스로 골로이드 전구체 및 림프골성 선조선자를 보여주는 적절한 플롯 및 인구 계층 구조로 유동 세포 측정 프로토콜을 생성합니다. 다음으로, 스테인드, 사전 농축, 백혈구 샘플을 실행하여 전방 및 측면 산란 파라미터의 전압을 조정하고, 모든 형광 채널다음에 는 단일 스테인드 보정 비즈를 사용하여 인접한 채널 간의 보상을 조정한다. 그런 다음 CD34 농축 효율을 문서화하기 위해 조정 및 보상 프로토콜로 나머지 얼룩이 없는 얼룩진 모든 샘플을 모두 실행합니다.
모든 보상이 설정된 경우 CD34 서브세트의 정렬 정제를 위한 셀 선별기를 콜로니 형성 세포 소약으로 구성하고, 스테인드 CD34 농축 시료 튜브를 사이토미터에 적재한다. 그런 다음 2000에서 3000 개의 이벤트를 기록하고 신호 강도및 대상 인구에 맞게 정렬 게이트를 미세 조정합니다. 설정이 완료되면 분란, CD34 양성, 조혈 줄기 세포, 다중 효능 안성 안에리스로 골로이드 전구 및 림프골골선질 3.6 밀리리터를 포함하는 분리된 튜브로 800~1200개의 세포를 분류하는 세포를 초당 500~1000세포로 조정하는 세포를 획득한다.
종류의 끝에 수집 튜브, 3 멸균 3.5 센티미터에 세포 현탁액의 1 밀리리터를 추가, 비 조직 배양 처리 페트리 접시 는 37 섭씨에서 자신의 10-14 일 인큐베이션에 대한 세포 인구 당 개별 15 센티미터 페트리 접시 내에서 설정. 다음 날 아침 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 각 플라스크 바닥에서 멸균 HBSS로 부착 된 세포를 부드럽게 헹구고 원심 분리에 의해 수확 된 세포를 수집합니다. 밀리리터 농도당 6세포에 1 x 10에서 트랜스듀션 배지에서 세포를 재연한다.
그리고 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 배양을 위해 12웰 플레이트를 코팅한 재조합 섬유네틴 단편의 한 웰에 모의 제어를 위한 세포의 1밀리리터를 첨가한다. 그런 다음 남은 세포의 10 밀리리터 알리쿼트를 재조합 섬유네틴 단편 코팅 T75 플라스크에 넣고 캡이 배출된 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 잠복식 동안 바이러스가 조건부 된 중간 표본을 조절하고 글리리터 당 전염되는 세포의 티터 및 감염 단위의 수에 기초하여 첨가될 바이러스의 양을 계산한다.
인큐베이터에서 플라스크를 꺼내 각 플라스크에 적절한 양의 바이러스 조절 배지를 추가하여 세포를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%로 되돌려 보세요. 다음날 아침 플라스크에서 개별 50 밀리리터 원추형 튜브로 세포를 전달합니다. 세척당 최대 50밀리리터의 HBSS로 셀을 세척하고 잔류 바이러스를 제거하기 위해 최대 3배까지 이 단계를 반복합니다.
프로스타글란딘 E2로 보충된 HSPC 미디어에서 2시간 동안 세포를 배양한다. 그런 다음 세포를 세척하고 튜브 당 2 %의 자가 혈청으로 보충 된 HBSS의 10 밀리리터에서 세포를 다시 일시 중단합니다. 그런 다음 16.5 게이지 바늘을 장착 한 20 밀리리터 주사기를 사용하여 셀 서스펜션을 흡인시합니다. 신선한 HBSS플러스 2%의 자동 혈청으로 튜브 내부를 세척하고 주사기에 흡인합니다.
주사기를 바늘 캡으로 조심스럽게 캡을 넣은 후 세포 용액을 얼음위에 올려놓고 자가 호스트로 주입될 때까지 조심스럽게 캡을 씌울 수 있습니다. 변환된 세포의 유전자 변형 효율을 결정하기 위해, 플레이트 1 x 10 에서 6번째 예약된 모의 또는 변형된 세포당 HSPC 배지의 밀리리터당 비조직 배양 처리 플레이트에. 둘째 날, 5일, 12일 후에 세포를 수확하고 계산합니다.
2일과 5일에는 신선한 HSPC 배지에서 세포의 33%를 밀리리터 농도당 1 x 10에서 6번째로 재플레이트합니다. 2일, 5일 및 12일에는 정량적 실시간 PCR을 위한 DNA 추출 완충제에서 세포의 33%를 동결하고, 표준 프로토콜에 따라 세포의 최종 33%를 유동 세포측정에 의해 분석하여 조혈자 자손의 피형 조성물을 평가한다. 유동 세포측정에 의한 트랜스진 발현을 정량화하려면, 3개의 추가 측면 산란 대 추가한다.
트랜스진 플롯;및 조혈 줄기 세포에 대한 첫 번째 플롯, 다능성 안-에리스로 골수성 전조자에 대한 두 번째 플롯, 림프골골성 전구의 세 번째 플롯, 모두 대 트랜스진. 그런 다음 2000에서 3000 개의 이벤트를 기록하고 신호 강도및 대상 인구에 맞게 정렬 게이트를 미세 조정합니다.
이 프로토콜을 사용하여 농축되는 비인간 영장류 CD34 양성 HSPC의 수는 전형적으로 입력 총 백혈구 수에 비례한다. 이전 연구 결과는 총 CD34 양성 HSPC 생성물이 실제장기 및 접목 조혈 줄기 세포를 포함하는 것을 입증했기 때문에, 이러한 유동 세포측정 기반 및 식민지 형성 세포 기술은 헌신적인 선조로부터 장기간 조혈 줄기 세포를 위해 농축된 하위 세트를 안정적으로 식별하고 분화하는 데 사용될 수 있다. CD34 양성 인간 줄기 세포 농축 세포는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 효율적으로 유전자 변형될 수 있다.
벡터의 비통합 된 사본을 운반하는 세포는 12 일 액체 배양 분석 기간 동안 희석되는 반면, 게놈내의 안정적으로 통합 된 벡터는 모든 자손에게 전달됩니다. 콜로니 형성 세포 에서 벡터의 발현에 의해 확인된 바와 같이. 이 전임상 방법은 유전자 치료를 위한 고품질 통제된 비인간 영장류 조혈 줄기 및 선조 세포에서 유전자 변형을 격리하는 데 사용될 수 있다.
이 방법은 다른 종, 조혈 줄기 및 전구 세포, 유전자 치료 도구 및 질병에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 철저하게 심사 된 프로토콜은 수많은 인간 질병에 대한 효과적인 치료법을 모델링하는 것에 대한 큰 약속을 보여줍니다. 비인간 영장류 조직과 협력하려면 개인 보호 장비를 포함한 향상된 보안 조치가 필요합니다.
