이 작품은 정신과의 맥스 플랑크 연구소와 유럽 연합의 마리 퀴리 초기 교육 네트워크 (니나 계약 238665)에 의해 재정 지원되었다.

1. 조기 삶의 역경에 의해 프로그래밍 모성 분리 (MS)를 초과-임신한 C57BL/6N 마우스 (출생 날에 출생 후의 일 0 (P0))에 의해 전달 새끼 일찍 생활 스트레스 (ELS)을 유도하기 위해 수행됩니다. <ol><li> 개별 새끼는 P1-10에서 3 시에 매일을 위해 (손난로 포함) 깨끗한 새장에 배치됩니다. </li><li> 제어 (비 ELS) 새끼가 전역 산모 둥지에 그대로 남아 있습니다. </li><li> 새끼들은이 표준 실험실 동물 주택 조건 하에서 섹스와 일치하는 그룹 (케이지 당 3-5 생쥐)에 보관되어있는 시간 후 (P21) 이유 때까지 어미와 함께 유지됩니다. </li></ol> 2. 뇌 세포의 분리 및 해부 <ol><li> . 마우스는 경추 탈구 참고하여 원하는 나이에 사망 :이 프로토콜은 스트레스 패러다임 관련이 있기 때문에 어떤 마취는 스트레스 호르몬의 정상적인 생리 조절을 방해하지 않도록, 경추 전위 이전에 부여되지 않습니다. 두개골이 열리고있다두뇌는 -80 ° C.에 저장되기 전에, ISO-pentane-드라이 아이스의 침수에 의해 조심스럽게 제거하고 즉시 스냅인 얼었어 </li><li> 두뇌 (10 μm의 두께) cryosectioned이므로 섹션은 Superfrost 유리 슬라이드에 장착된 및 -20 ° C.로 유지됩니다 PVN - - 주동이의 PVN, bregma의 수준에서 시작하는 부분을 수집하는 표준 마우스 stereotaxic 아틀라스에 대한 참조 (예 : Paxinos 6) 해부 정밀도를 확인하고 관심 영역의 포함 (paraventricular 핵의 뉴런에 예 수 있도록하는 데 사용됩니다 -0.75로 -0.85). </li><li> 섹션은 서로 다른 뇌 구조의 식별을 용이하게하기 위해 cresyl 보라색 물들일 수 있습니다. 관심 지역의 펀치 (0.8 mm)을 (예 : PVN) 로코병의 microdissection에 의해 얻을 수 있습니다. </li></ol> 3. 뇌 펀치에서 핵산 추출 동시에 작은 neuroanatomically 정의 두뇌 레지에서 DNA와 RNA를 추출하기위한 최적화된 프로토콜bisulfite와 유전자 표현 분석을위한 이온은 7 설명되어 있습니다. 참고 : RNA은 GTC - 버퍼에서 DNA보다 덜 안정적인 것을 생각하면, 우리는 RNA가 먼저 처리하는 것이 좋습니다. DNA의 정화에 사용 homogenate 그 시간 동안 실온 (RT)에 보관하실 수 있습니다. <ol><li> guanidinium thiocyanate (GTC) 버퍼 (4.5 M guanidinium thiocyanate, 2퍼센트 N-lauroylsarcosine, 50 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 8.25 MM 트리스-HCL pH는 7.5, 0.1 M 베타 - 메르 캅 토 에탄올, 0.2 % antifoam 400 μl에 피펫과 vortexer를 사용하여 펀치를 Homogenize ) RT에서, 피하 주사기 (29G) (그림 2)를 통해 여러 번 나온다. </li><li> 동등한 부분으로 lysate 분할, RNA와 DNA 모두 특별한 실험적인 필요에 따라 별도로 동시에 추출하거나 수 있습니다. </li><li> isoamyl (24:1) lysate하기 : RNA 정화 들어 NaOAc 중 10분의 1 볼륨, 1 볼륨 AquaPhenol (Appligene) (산도 4) 및 클로로포름 1 / 2 볼륨을 추가합니다. 노골적인 협상 각 단계 이후에 소용돌이와aequous 단계에 70 % EtOH의 동등한 볼륨을 추가합니다;. 10 분, 원심 분리기 (4시 10,000g시 20 분 ° C)에 얼음을 품어 </li><li> RNA의 스핀 열 (Macherey-Nagel의 예 Nucleospin RNA II)로 혼합을 전송하고 온 - 컬럼 DNase - 소화와 세탁 단계 (제조 업체의 프로토콜을 수행)를 수행, 25 μl H 2 O에 관련 elute RNA </li><li> DNA를 정제 위해 Qiagen DNeasy의 혈액 및 조직 키트의 최적화된 프로토콜이 사용됩니다. 버퍼 AL의 동등 권과 100 % EtOH, 스핀 열 원심 분리기에 대한 부하 (RT에서 10,000그램시 1 분)과 lysate와 흐름을 통해 폐기 평형. </li><li> 칼럼에 5 μl RNAse (1 밀리그램 / ML)를 포함하여 500 μl 버퍼 AW1을 넣고 RT에서 10 분 알을 품다. 스핀 (10,000g에서 1 분, RT)과 흐름을 통해 폐기. </li><li> 500 μl 버퍼 AW2와 열을 워시 흐름을 통해 그리고 스핀 - 건조 빈 열 (1만5천g시 1 분) 버리고. </li><li> 추가 prewarmed (70 ° C) 70시 버퍼 AE와 10 분 품어 열 ° C. (1 분 원심 분리하여 Elute, 10,000 G), 흐름을 통해 다시 적용하고 원심 분리 단계를 반복하십시오. </li></ol> DNA와 RNA의 농도를 결정하는 분광 광도계를 사용합니다. 전형 PVN 펀치 수율 ~ 600 NG의 DNA와 RNA ~ 400 NG. 정량 PCR (qPCR)에 의한 유전자 발현 분석을 위해서는 일반적으로 역 전사 반응에서 RNA의 ~ 100 NG를 사용합니다. 4. Bisulfite 전환 나트륨 Bisulfite는 uracils에 비 methylated cytosines로 변환하는 데 사용됩니다. 대조적으로, methylated cytosines가 변환으로부터 보호됩니다. 따라서 bisulfite PCR-amplicon의 마지막 순서에서 검색된 모든 cytosines는 methylated cytosines를 나타냅니다. Bisulfite 변환은 PCR 분석에 제한 요소가 될 수있는 실질적인 DNA의 저하를 일으 킵니다. , 사이 토신 변환을 극대화 DNA의 단편화를 줄이고 더 낮은 온도에서 단일 좌초된 DNA를 유지하는 최적의 반응 조건을 사용하여 달성될 수Qiagen의 EpiTect Bisulfite 키트. 우리 손에 ~ micropunches에서 정화의 DNA 200 NG는 bisulfite 반응에 대한 자료를 시작하는 충분한 양의를 제공합니다. 전환 반응의 효율성의 차이를 방지하기 위해 템플릿 DNA의 금액은 실험 기간 동안 처리된 모든 샘플 중에서 일정한 보관해야합니다. 또한, 시퀀스가​​ 아닌 변환 비 CpGs의 속도를 검사하여 변환 효율을 위해 시시콜콜 따지는해야 읽습니다. 이 비율은 98 %를 초과해야합니다. 낮은 값은 불완전하거나 비효율적인 bisulfite 변환을 나타내고 기본 시퀀스는 분석에서 제외해야합니다. 5. Bisulfite PCR <ol><li> 메틸 프라이머 익스프레스 소프트웨어 (; 디자인 bisulfite는 bisulfite 변환된 DNA (토론 참조)에만 해당하는 primers 시퀀스 <a href="https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121" target="_blank">https://products.appliedbiosystems.com/ab을</a>/ EN / 미국 / adirect / AB? cmd를 = catNavigate2 &amp; catID = 602,121)이 도움 및 파일럿 실험에서 최적의 어닐링 온도를 결정하는 데 도움이 될 것입니다. </li><li> 다음과 같이 PCR-마스터 - 믹스 (한 반응에 대한)를 준비 : 2.5 μl 10X PCR 버퍼 0.5 μl 10 밀리미터 dNTPs 앞으로 1 μl 10 μm의 프라이머 1 μl 10 μm의 역방향 프라이머 0.125 μl Qiagen Hotstart DNA 형성 촉매 플러스 H 2 O와 23 μl까지 기입 </li><li> 반응을 2 μl bisulfite-대우 DNA를 추가합니다. </li><li> 다음 조건을 사용하여 증폭 : 1 사이클 6 분 95 ° C 1 분 95 ° C의 45-50주기, 최적 소둔 온도에서 1 분, 1 분 72 ° C 한 사이클 5 분, 72 ° C </li></ol> amplicon의 크기를 확인하고 상업적으로 이용 가능한 PCR 청소 키트를 (사용하는 후속 내고 대한 남아 PCR 반응을 정화 아가로 오스 겔 전기 영동하여 PCR 제품 7 μl를 분석 예 Macherey - 나겔 Nucleospin)을 추출합니다. 추가 바람직하지 PCR 제품이 취득되는 경우, 겔 정화 권장합니다. 6. Bisulfite의 장면 단일 클론 결과에서 추론 고해상도의 DNA methylation 프로필은 DNA의 methylation의 작은 변화를 감지 및 치료 (환경 프로그램)에 반응 규제 영역을 식별할 수 있습니다. bisulfite의 시퀀싱 프로세스는 세 연속 작업 단계로 구성되어 있습니다. 첫째, 사전 bisulfite PCR로 얻은 PCR 제품은 벡터로 출혈도 잡았 및 박테리아로 변환됩니다. 둘째, 단일 클론으로부터 식민지 PCR은 삽입의 정확한 크기를 결정하기 위해 고용됩니다. 셋째, 긍정적인 이민 PCRs는 청소 및 대형 염료 시퀀싱 반응를 받게됩니다. 청소 단계에 따라 제품은 모세관 시퀀서에 electrophoresed됩니다. 6.1 결합 및 변환 주 : 우리는 정기적으로 pGEM-T 벡터 CL에게 사용oning 키트 (Promega). 우리의 경험에서 복제 효율성은 출혈도 잡았되는 삽입이 매우 다릅니다. 재조합 클론의 낮은 숫자가 반복적으로 얻을 수있다 경우에 다른 벡터는 테스트해야합니다. <ol><li> 결합 반응을 설정합니다 : 5 μl 2X 내고 버퍼 1 μl pGEM-T 벡터 한 T4-Ligase μl 3 μl 청소 업 PCR 제품 </li><li> 4에서 밤새도록 pipetting과 부화에 의해 반응을 섞어서 ° C. 참고 : 결합도 역시 RT에서 1 H에 대해 수행됩니다. 4에서 야간 결합을 통해, 재조합 클론의 수를 늘리려면 ° C에서 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 청소 에탄올 침전에 의한 결합 제품 : <ol class="lalpha"><li> 1 μl 글리코겐, 1 μl 3M NaAc 및 액체 질소 1 분 내고 반응 및 석출물 ~ 25 μl 100 % EtOH를 추가합니다. </li><li> 원심 분리기 (4시 30 분 대한 15,0000 g ℃)과 뜨는 버리고. </li><li> 300 μl로 씻으십시오70 % EtOH 및 원심 분리기 (4시 20 분 대한 1만5천그램 ° C는), RT (10 분)에 뜨는 건조 펠릿를 버리고. </li><li> 10 μl H 2 O에 관련 Resuspend 펠릿 </li></ol></li></ol> electrocompetent 박테리아 내고 제품 6.2 변환 <ol><li> 얼음 얼음과 electrocompetent DH5α 박테리아의 영유권에 나누어지는에 Precool electroporation의 cuvettes (1 밀리미터 폭). </li><li> 내고 제품을 청소 10 μl (위 참조) 45 μl DH5α 박테리아를 추가하고 cuvette에 전송할 수 있습니다. </li><li> 1.5 kV, 200 Ω, 15 μF에서 박테리아를 변형하고 직접 펄스 전송 후 prewarmed 개자식 매체의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 37 ° C,에서 1 H 위해 박테리아를 살려내는 IPTG / X-걸 코팅 / 암피실린 플레이트 LB에 현탁액을 100 μl 뿌리 더군요. </li><li> 37 하룻밤 접시 ° C를 품어 </li></ol> 6.3 식민지 PCR 참고 : 단일 클론에서 콜로니 PCR 그 삽입이되도록 실시됩니다예측의 크기. 블루 / 화이트 심사, 내고, oligomeric 프라이머 쌍을 법인 또는 잘린 PCR 제품 중 바람직하지 않은 재조합 이벤트에서 지연 색상 개발은 달리 결함이 시퀀싱 결과가 발생할 수 있습니다. 우리는 정기적으로 복제된 삽입을 증폭하기 위해 T7 및 SP6 primers를 사용, 약 150 BP의 추가 벡터 시퀀스에서이 접근법 결과입니다. T7의 프라이머는 이후 단계에서 시퀀싱 반응에 사용됩니다. <ol><li> 96 - 웰 플레이트에서 식민지 PCR 반응을 설정합니다. 한 반응을 사용할 경우 : 3 μl 2.5 밀리미터 MgCl 2 2.5 μl DNA 형성 촉매 10X 버퍼 1.5 μl 10 밀리미터 dNTP 2 μl 2.5 MM T7의 프라이머 2 μl 2.5 MM SP6 프라이머 1 μl Fermentas DNA 형성 촉매의 중합 효소 H 2 O 25 μl까지 기입 </li><li> / 잘 마스터 믹스로 각 잘 96 - 웰 플레이트의 25 μl를 분배. </li><li> PCR 반응에 피펫 팁 및 물놀이가있는 접시에서 긍정 (흰색) 클론을 선택하십시오. </li><li> fol를 사용하여 증폭lowing 조건 : 95 1주기를 4 분 ° C 94 10 사이클의 30 ° C, 56 30의 72에 ° C ~ 30 ° C의 94 30 사이클의 30 ° C, 48 30의 72에 ° C ~ 30 ° C의 72 1 사이클 5 분 ° C </li><li> 아가로 오스 겔에 식민지 PCR의 5 μl를로드하고 바로 삽입 크기를 포함하는 반응을 결정합니다. </li><li> 원하는 amplicons를 포함하는 콜로니 PCRs는 상용 키트 (Machery Nagel Nucleofast)을 사용하여 청소합니다. </li></ol> 6.4 빅 - 다이 터미네이터 반응과 시퀀싱 <ol><li> 빅 - 염료 반응을 마스터 믹스를 준비합니다. 한 반응을 사용할 경우 : 1 μl H 2 O 0.5 μl 빅 염색 시약 1.5 μl 장면 버퍼 </li><li> 각 잘 청소 식민지 PCR 제품의 2 μl를 추가하고 다음 매개 변수가있는 thermocycler 대한 반응을 실행하려면 μl / 잘 96 - 웰 플레이트의 각도에 3 분배 : 96 10의 35주기 ° C, 5의 50 60 ° C와 4 분 ° C </li><li> 빅 염색 반응은 상용 키트 (Millipore 몽타쥬 96 청소 키트를 배열)을 사용하여 청소 및 모세관 시퀀서 (예 : ABI 3100 DNA)에 처리됩니다. </li><li> 시퀀스는 Biq 분석기 (사용 분석하고 <a href="http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/" target="_blank">http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/</a> ) 또는 온라인 도구 BISMA ( <a href="http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/" target="_blank">http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/를</a> ) 조사의 DNA 영역 (그림 4)의 methylation 패턴을 도출합니다. </li></ol> 7. 대표 결과 Avp 표현과 methylation 상태에서 ELS의 영향에 대한 통찰력을 얻으려면 C57BL/6N 마우스는 위에서 설명한 작업 흐름에 따라 처리되었다. 간단히, C57BL/6N 마우스의 그룹들이었다제어 그룹이 그대로 남아있는 동안 ELS에 ubjected. 단일 펀치에서 PVN과 supraoptic 핵 (아들은) 천공되었으며 DNA와 RNA를 동시에 격리되었다. RNA는 역방향 베꼈는데되었고 Avp의 성적 수준은 qPCR 분석 및 Hprt 및 Gapdh의 가사 유전자의 표현에 대한 표준에 의해 측정되었다. DNA는 Avp 향상제 (그림 4A)과 PCR 제품에 특정 primers로 증폭, bisulfite 처리했습니다 복제 및 순서가되었다. 각 마우스 / PCR에서 최소한 20 재조합 클론은 PCR amplicon (그림 4B)에 포함된 CpGs위한 methylation 주파수를 결정하기 위해 분석되었다. 컨트롤과 비교했을 때, ELS는 epigenetic 일찍 생활 경험을 통해 이러한 규제 지역의 마킹 제안 Avp 향상제의 CpG10, CpG12, CpG13 및 Cpg14 (P &lt;0.05, N = 6-8 동물)에 상당한 hypomethylation을 유도. 의 PVN, methylation과는 달리Avp 향상제는 epigenetic 마킹 (그림 4c)의 아들이 보여주는 조직 특이성에 영향을받지 ELS했습니다. CpG10 및 Avp 유전자 발현 제어 동물에서 DNA의 methylation 상태 분석 (N = 6) AVP의 유전자 발현 (그림 4D)의 미세 조정에 DNA methylation의 역할을 가리키는 부정적인 상관 관계를 입증. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig1.jpg" /> 그림 1. Micropunches는 제어 및 조기 생활 스트레스 생쥐의 두뇌를 해부에서 얻은됩니다. bisulfite 치료 유전자가 증폭되고 정화 제품은 화이트 / 블루 선택에 의한 재조합 클론의 적합한 벡터 있도록 신분으로 복제하는 동안 DNA와 RNA 분리에 따라 유전자 발현이 qRT-PCR에 의해 결정됩니다. 올바른 삽입 크기에 의해 확인됩니다이전 모세관 시퀀서에 큰 염색 반응 및 가공을 수행에 식민지 PCR. Methylation 패턴 적절한 소프트웨어 도구에 의해 시각입니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig2.jpg" /> 그림 2. DNA / RNA 추출에서 bisulfite의 시퀀싱에 대한 타임 라인. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig3.jpg" /> 그림 3. DNA와 RNA의 동시 추출을위한 워크플로우. paraventricularis hypothalamic 핵, 뇌 영역을 표현하는 작은 Avp 유전자의 펀치는 주사기 (29G)를 통해 전달하여, 400 μl GTA 버퍼에 배치 중단될 때까지 vortexed하고 더 균질하고 있습니다. homogenate 그 다음 RNA와 DNA의 정화를 위해 나뉩니다. 분할 1:1 있거나 따라 다른 비율의 수특히 실험에 대한 질문. Homogenates은 몇 시간 이내에 처리하여야한다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig4.jpg" /> 그림 4 6. 주 된 제어 및 ELS 동물의 Avp의 현장에서 CPG methylation. () Avp과 옥시토신의 유전자 중심의 꼬리 투 - 꼬리 계획 및 intergenic 지역 (IGR)으로 구분합니다. Exons는 개방 (번호가) 상자가 표시됩니다. CPG 잔류물의 분포가 표시되고 크기와 CpG14에 CPG 10을 포함하는 각각의 PCR의 amplicon의 위치는 굵은 선으로 표시됩니다. (B) 제어 및 ELS 동물의 PVN의 Avp 향상제의 Methylation (n은 = 6-8). 제어 및 ELS 동물의 아들 (N = 8-10)의 Avp 향상제의 (C) Methylation. (D) Avp 유전자 발현은 서로 관련되었다CpG10에서 methylation과 (N = 6). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> .

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Epigenetic 프로그래밍은 점점 더 중요한 메커니즘 밑에있는 건강과 질병으로 인식된다. 여기 micropunches과 bisulfite의 시퀀싱을 통해 DNA의 methylation 프로파일을 얻을 수있는 후속 단계에서 DNA와 RNA의 동시 분리를위한 세련된 방법을 제시. 최적화된 작업 흐름은 환경 자극에 대한 응답으로 뇌의 epigenetic 프로그래밍의 편리한 분석을하실 수 있습니다. 또한, 이러한 방식은 모두가 같은 샘플에서 분석할 때 DNA의 methylation와 유전자 발현 사이의 기능적 관계의 조사를 용이하게합니다. 마지막으로, 실험에 필요한 동물의 숫자가 크게 줄어들 수 있습니다. 제시 워크플로우를 수행하는 동안 특정주의 사항과 지침을 따라야한다. methylation과 표현 패턴 세포와 조직을 특정 방식으로 다를 수 있기 때문에 특별한 복잡 성과 두뇌의 이질을 고려하고 그것은 최고입니다중요성이 그 micropunching는 표준화된 방식으로 수행됩니다. 지점에서 사례로서 Avp의 epigenetic 프로그래밍이 paravaventriuclar에서 감지되고 있지만 supraoptic 핵에 (그림 4B-D), 두 Avp은 시상 하부 4 영역을 표현. 이러한 측면에서, 동일한 조직 펀치의 DNA와 RNA의 여부는 RNA의 특정 조직이 특정 마커 유전자의 표현이 올바른 영역 천공 것을 증명하는 경우에 사용할 수있는 등 유리한 것입니다. micropunching는 세포 이질을 줄일 수 있지만, 그것은이 접근법은 단일 셀 유형이나 집단의 고립으로 이어질하지 않는 기억되어야한다. 추가 정화 단계는이 주제를 해결하기 위해 고려해야 할 수도 있습니다. 내용은 PCR 증폭 다음 bisulfite 처리를위한 최적 프라이머 설계를 시퀀싱 bisulfite은 필수적입니다. 길이 400 BP를 초과하는 PCR 제품은 B에 의해 DNA의 저하로 인해 문제가 될 수 있습니다isulfite 치료. 또한 단지 몇 그대로 템플릿 증폭 과정에 기여하는 경우 중첩된 PCR은 편향된 결과를 줄 수 있다고 언급한다. 수정된 amplicon에 대한 구체적인 프라이머 쌍 설계되어야, 그들의 시퀀스는 methylation-바이어스 증폭을 방지하기 위하여 CPG dinucleotides 없어야합니다. 또한, primers는 수정되지 않은 또는 불완전하게 변환된 DNA의 증폭을 막기 위해 비 CPG cytosines를 포함해야합니다. 일부 템플릿의 증폭은 핫 시작 PCR을 실시하는 혜택을 누릴 수 있습니다. 귀중한 실험 표본의 변질을 방지하기 위해 같은 있도록 어떠한 경우에도, 프라이머 쌍 적합성은 파일럿 실험에서 확인해야합니다. 그것이 안정적으로 정확하게 allele 특정 방식으로 8 단일 CPG 잔류물의 methylation를 감지할 수로 Bisulfite의 시퀀싱는 사이트 관련 methylation 분석을위한 표준 방법을 나타냅니다. PCR 제품의 직접 시퀀싱은 혼합 methylation O 통보를하지 않습니다FA CPG 잔여물 걱정이 사이트에서 methylation의 부량을 예방할 수 electropherogram에서 C / T 더블 피크로 나타납니다. 이러한 이유로 중간 복제 단계가 실시되고 여러 클론은 methylation의 정도를 결정하기 위해 (~ 20-30) 순서가있다. Pyrosequencing은 DNA의 methylation을 정량하기위한 다른 방법을 나타냅니다. 또한 bisulfite 변환과 bisulfite PCR 대신 복제 및 amplicon이 CPG 잔여물의 methylation 상태가 쉽게 계량 할 수있는 C / T 단일 염기 다형성으로 읽어 직접 pyrosequencing 반응에 노출되는 시퀀스를 활용합니다. 두 가지 방법 methylation 9와 비슷한 수준을 감지하지만, 복제 단계를 생략할 수 있기 때문에 pyrosequencing 시간이 더 효율적입니다. 단, 템플릿에 따라서만 40-100 세포핵이 다른 시퀀싱 프라이머와 pyrosequencing 여러 라운드가 필요하므로 한 번에 순서가 수 있습니다. 이것은 THA에게 주어진 중요한 제한 사항입니다DNA의 t보다 높은 금액 (반응 당 약 1 μg)은 작은 뇌 조직 펀치에서 사용할 수있는 금액을 초과 예측하는 필요합니다. 따라서 pyrosequencing에 의한 여러 kilobases의 범위에서 지역의 초기 검사는 단일 클론 독서 같은 덜 적합한 나타납니다. 그럼에도 불구하고, 관심 pyrosequencing의 작은 영역의 신분에 따라 고려되어야한다. 이하, 위에서 설명한 프로토콜은 epigenetic 변화를위한 두뇌 micropunches의 신속하고 비용 효과 분석을위한 정확하고 효율적이고 능률적인 접근 방식을 제공합니다. 여러 개의 표본은 하나의 실행 작업을 중간 크기의 실험에서 샘플을 실행할 때 방법은 적합 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> DNeasy 혈액 및 조직 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 69,506 </td></tr><tr><td> Nucleospin RNA II </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740955.50 </td></tr><tr><td> Bisulfite 키트 Epitect </td><td> Qiagen </td><td> 59,104 </td></tr><tr><td> Nucleospin 추출 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740609.50 </td></tr><tr><td> pGEM-T 벡터 복제 키트 </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 743100.50 </td></tr><tr><td> 몽타쥬 96 장면 청소 </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar DNA 형성 촉매의 중합 효소 </td><td> Qiagen </td><td> 203,203 </td></tr><tr><td> DNA 형성 촉매의 중합 효소 </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain

다이어트에 노출, 생명 1,2의 민감한 창문 동안 마약과 초기 삶의 역경은 생리학과 행동 phenotypes의 표시에 기여하는 유전자 발현의 지속적인 변화를 가져올 수 있습니다. 이러한 환경 프로그램은 신진 대사, 심장 혈관과 정신 질환에 3,4로 느끼기 쉬운 성질을 높일 가능성이 높습니다. DNA의 methylation과 히스톤 수정은 유전자 - 환경 대화의 중재로 핵심 프로세스를 고려, 환경 프로그래밍 할 5 밑받침하는 것도 표시됩니다. 포유 동물에서 DNA의 methylation은 일반적으로 CPG dinucleotides의 컨텍스트 내에서 사이 토신의 5 - 위치에 메틸 그룹의 공유 결합 이외로 구성되어 있습니다. CPG methylation은 세포의 이질은 높은 조직 수량이 한정되어 두뇌의 이산, 작은 지역을 공부하기 위해 도전하고 고도로 조직과 세포에 특정한 방식으로 발생합니다. 또한, Because 유전자 발현과 methylation이 밀접하게 이벤트를 연결되었으며, 증가 가치는 동일한 표본에서 두 매개 변수를 비교하여 얻은 수 있습니다. 여기에서 뇌의 epigenetic 프로그래밍의 조사를 위해 단계별로 프로토콜 (그림 1) 설명의 목적을위한 초기 삶의 역경 &#39;모성 분리&#39;패러다임을 사용하여 제공됩니다. 프로토콜 따라서 동일한 샘플의 DNA의 methylation 및 유전자 발현 분석을 허용, DNA와 RNA를 동시에 격리 수있는 differentially 중년 마우스 두뇌에서 micropunches의 준비에 대해 설명합니다.

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Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

초기 생활 스트레스시의 DNA methylation 및 유전자 발현 변화를 공부하는 능률적인 작업 흐름이 나타납니다. 갓 태어난 생쥐와 이산 뇌 조직의 고립 모성 분리 월부터, 우리는 동시에 후속 bisulfite의 시퀀싱 및 RT-PCR 분석을위한 두뇌 조직 펀치에서 DNA와 RNA를 분리하기위한 프로토콜을 나타냅니다.

뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 DNA Methylation과 유전자 발현의 최적화 분석

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.7K 조회수.  Max Planck Institute of Psychiatry. 초기 생활 스트레스시의 DNA methylation 및 유전자 발현 변화를 공부하는 능률적인 작업 흐름이 나타납니다. 갓 태어난 생쥐와 이산 뇌 조직의 고립 모성 분리 월부터, 우리는 동시에 후속 bisulfite의 시퀀싱 및 RT-PCR 분석을위한 두뇌 조직 펀치에서 DNA와 RNA를 분리하기위한 프로토콜을 나타냅니다.

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Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

척수 전기 생리학 II : 세포 흡입 전극 제작

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

연구

신경과학

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

설치류 또는 인간의 네이절 강한 줄기 세포를 분리

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

성인 쥐의 특정 두뇌 영역의 Excitotoxic 병변에 대한 Stereotaxic 외과

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

모르 올리고 뉴클레오티드의 Cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 Zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현의 미세 조작

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

electroporation하여 병아리 배아 척수에서 차동 유전자 발현의 RNA-SEQ 분석

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

전방 시상 핵의 깊은 뇌 자극 후 쥐 해마의 유전자 발현 변화 분석

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

쥐 뇌 조직 검사 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 셀 타입 별 유전자 발현

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...