최근 연구는 비만의 발달 도중 Adipose 조직 리모델링에 있는 혈관신생 그리고 동정적인 혁신의 중요한 역할을 강조했습니다. 여기서 우리는 지방 조직에서 혈관과 신경 섬유를 효율적으로 견딜 수 있는 변형된 면역 형광 방법을 시연합니다. 우리의 접근 방식은 스탠딩 효율성과 품질에 대한 타협없이 직선적이고 효율적입니다.
우리는 공초점 현미경 검사를 사용하여 이미지를 취득합니다. 이미지의 고해상도를 통해 혈관 네트워크를 재구성하고 그 특성을 정확하게 분석할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 6주 C57 Black-6J 남성 마우스의 마취 및 관류로 이 절차를 시작합니다.
마우스에서 백색과 갈색 지방 문제를 해부합니다. 가위를 사용하여 조직 샘플을 작은 덩어리 조각으로 분해하십시오. 소독 된 핀셋으로 작은 덩어리를 카세트에 조직 샘플을 적절하게 라벨링하여 카세트를 포함 시키는 조직으로 옮습니다.
조직 샘플을 포함하는 임베디드 카세트는 섭씨 4도에서 24~48시간 동안 고정 용액에 담가 두는 다. 작은 덩어리를 페트리 접시에 멸균시켰다. 세척당 0.5 밀리리터에서 브러시 1x PBS 버퍼로 샘플을 3회 세척합니다.
이제 고정 조직 샘플을 살균 된 가위로 약 2 입방 밀리미터 큐브로 잘라냅니다. permeabalisation의 경우 샘플을 1%트리톤 PBS 버퍼 1밀리리터를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 18 RPM에서 1시간 동안 실온에서 튜브를 부드럽게 회전시합니다. 1시간 후 1x PBS를 동일한 튜브에 직접 추가하여 시료를 세 번 세척하여 1%트리톤 PBS 버퍼를 조심스럽게 제거합니다.
각 세척 하는 동안, 튜브를 여러 번 반전. 블로킹의 경우 0.5 밀리리터의 블로킹 버퍼를 시료와 인큐베이터에 2시간 동안 부드러운 회전으로 추가합니다. 1차 항체 용액의 0.4 밀리리터를 준비하려면, 블로킹 버퍼의 396 마이크로리터까지 안티 티로신 하이드록시 라제 항체의 2개의 마이크로리터와 안티 티로신 하이드록시 라제 항체의 2개의 마이크로리터를 희석시합니다.
소용돌이와 아래로 회전하여 볼륨을 복구합니다. 이제 조직 청크에서 차단 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. 준비된 1차 항체 용액의 100마이크로리터를 튜브에 넣고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양한다.
다음 날, 원하는 경우 재사용을 위한 1차 항체 용액을 신중하게 수집한다. 18 RPM에서 부드러운 회전으로 30 분 동안 세척 당 500 마이크로 리터에서 1 x PBST로 샘플을 세 번 세척하십시오. 이차 항체 용액의 제조를 위해, 밀가루 -flouro 의 두 마이크로 리터에 밀가루 - 밀가루의 공액 안티 신 IGG의 두 마이크로 리터를 차단 버퍼의 396 마이크로 리터로 희석.
소용돌이와 모든 액체를 수집하기 위해 잠시 회전. 이제 샘플에서 마지막 세척 버퍼를 제거합니다. 100 마이크로리터의 이차 항체 용액을 튜브에 넣습니다.
18 RPM에서 부드러운 회전으로 실온에서 샘플을 2 시간 동안 배양하십시오. 이차 항체 용액을 신중하게 제거한 후, 18RPM에서 부드러운 회전으로 세척당 500 마이크로리터에서 1x PBST로 샘플을 3회 세척합니다. 광학 클리어런스를 위해 샘플을 90% 글리세롤1밀리리터에 담그고 투명해질 때까지 어둠 속에서 4도의 섭씨로 샘플을 유지합니다.
여기에 실리콘 이솔레이터를 슬라이드에 추가하여 볼륨 이미징을 잘 만듭니다. 실리콘의 높이를 시료보다 약간 적게 유지합니다. 조심스럽게 우물로 샘플을 전송하고 마운팅 매체로 채웁니다.
표면에 덮개 슬립을 놓고 높은 점도 매체로 커버 슬립의 분기를 밀봉합니다. 실온과 어둠 속에서 24 시간 동안 장착 중간 을 치료하십시오. 경화가 완료되면 커버슬립의 가장자리를 완전히 밀봉하여 최적의 샘플 수명을 보장합니다.
공초점 현미경과 해당 소프트웨어의 20배 목표를 가진 Z 스택 이미지를 획득합니다. 시스템을 시작합니다. 구성 탭을 클릭하고 아르곤 레이저와 He-Ne 633 레이저를 모두 활성화합니다.
획득 탭을 클릭합니다. 가시 레이저 라인 패널에서 해당 강도 슬라이더를 위로 이동하여 488 나노미터 및 633 나노미터의 레이저 라인을 선택합니다. 처음에는 강도를 20~30%로 설정할 수 있으며 이제 488, 561, 633개의 삼중 이분해성 미러를 선택한다.
활성 확인란을 클릭하여 사진 승수를 활성화합니다. 633 나노미터 레이저의 488 나노미터 레이저 및 광증증 34에 의해 가해지는 방출에 대한 광증을 선택하십시오. 파장 범위를 500~550나노미터사이로 설정하여 사진 승수1의 경우.
650 내지 750 나노미터에서, 사진 승수 3. 각 사진 승수 옆에 있는 컬러 사각형을 두 번 클릭하고 팝업 메뉴에서 색상을 선택하여 이미지 디스플레이에 사용할 의사 색상을 선택합니다. 이제 라이브를 클릭하여 샘플에서 이미지를 확인합니다.
Z 위치 노브를 사용하여 관심 있는 XY 영역 내에서 초점 평면을 선택합니다. 레이저 강도, 스마트 게인 및 오프셋을 돌려 이미지의 밝기를 조정합니다. 각 형광 채널에 대해 빠른 조회 테이블 표시 모드에서 이 조정을 수행합니다.
빠른 조회 테이블 버튼을 클릭하여 적절한 밝기 레벨을 설정하는 데 도움이 되는 포화 픽셀이 파란색으로 표시되는 빠른 조회 테이블 모드로 전환합니다. 빠른 조회 테이블 버튼을 두 번 클릭하여 의사 색상 표시 모드로 돌아갑니다. 스캔하는 동안 Z 위치 노브를 시계 방향으로 돌려 초점 평면을 관심 볼륨의 한 쪽 끝으로 이동합니다.
그런 다음 끝 화살표 헤드를 클릭하여 스캔 및 위치를 설정합니다. 시계 방향으로 Z 위치 노브를 돌려 시편을 통해 관심 있는 볼륨의 다른 쪽 끝으로 초점 의 평면을 이동합니다. 그런 다음 시작 화살표 헤드를 클릭하여 스캔 시작 위치를 설정합니다.
Z 단계 크기를 3미크로 조정합니다. 1024로 1024의 형식, 100Hz의 속도 및 2개의 라인 평균을 선택하여 이미지 품질을 변경합니다. Z 스택 이미지 수집을 시작하려면 획득된 이미지 스택의 최대 투영을 시작하고, 프로세스 탭을 클릭한 다음 도구;3D 프로젝션을 선택하고 X, Y 및 Z.Set 임계값을 0으로 변경하지 않고 메서드 목록에서 최대값을 입력하고 적용을 클릭합니다.
Z 볼륨의 최대 강도는 표시되는 2D 이미지에 누적됩니다. 오픈 소스 소프트웨어를 통해 2D 이미지를 분석하려면 소프트웨어의 누적 된 이미지를 엽니 다. 모든 선박 구조물을 적절히 선택할 수 있을 때까지 선박 직경과 강도를 조정합니다.
실행 분석을 선택하고 소프트웨어 의 지침에 따라 데이터를 내보냅니다. 라이센스 소프트웨어를 통해 3D 이미지를 분석하려면 소프트웨어로 이미지의 원시 데이터를 엽니다. Z 부피의 각 레이어의 용기 구조가 적절하게 분할될 때까지 강도 임계값 및 기타 매개변수를 조정합니다.
생성된 비나라이즈된 이미지 스택을 스켈레톤화하여 특수 그래프를 가져옵니다. 선택한 세그먼트 특성을 분석하고 소프트웨어 지침에 따라 데이터를 내보냅니다. 탈경 부위 상반신 백색 지방 조직, 등암기 피하 백색 지방 조직의 내측 영역 및 내측 영역인 견갑골 갈색 지방 조직의 수집되었다.
전체 마운트 염색 후, 조직 트렁크는 초점 현미경으로 장착및 이미지화되었다. 더 많은 혈관이 긍정적으로 얼룩졌습니다. 글리세롤 인큐베이션된 피하 백색 지방 조직에서 안티 엔도무신 항체를 사용하면, 클리어링 단계가 혈관의 완전한 염색에 중요하다는 것을 시사한다.
혈관과 신경 섬유가 이 방법으로 데포스 중 상이한 패턴을 나타내는지 여부를 결정하기 위해, 공동 형광 염색은 혈관을 나타내고 항 티로신 하이드록시 라일과 함께 항 엔도무신을 가진 항체를 가진 지방 조직에서 수행되어 신경 섬유를 나타내도록 하였다. 흥미롭게도, 결과는 백색 지방 조직에 비해 갈색 지방 조직에 있는 신경 섬유 보다는 훨씬 더 많은 혈관이었다는 것을 보여줍니다. 백색 지방 조직 중, 피하 백색 지방 조직은 부피 백색 지방 조직 보다는 더 높은 혈관 조밀도를 전시했습니다.
참고로, 신경 섬유는 혈관과 병행하여 확장되었지만 상당한 공동 국소화를 보여주지 못했습니다. 혈관 영역, 접합 개 수 및 튜브 길이는 이러한 세 가지 유형의 지방 조직에서 2D 방법으로 질적으로 측정되었으며 유사한 결과를 발견했습니다. 이 방법은 효율적으로 혈관과 신경 섬유 및 지방 조직을 코스-덴.
그것은 비만의 발달 도중 지방 조직의 동적 변경을 공부하기 위한 유용한 공구로 소리합니다. 강력한 입 하이드독성입니다. P-ifa 는 더 넓은 피부 접촉 및 흡입에 관련된 단계를 수행하고 제대로 P-ifa를 처리하십시오 레이저 빔은 초점 현미경이되었기 때문에 아직 눈에 해를 끼치게하십시오.
목표에서 나오는 광선에 눈 노출을 피하고,
