성인 마우스에서 표피 세포를 수확하는 우리의 방법은 각질 세포 줄기 세포와 같은 다운스트림 응용 프로그램에 유용합니다. 우리의 기술은 매우 재현 가능하며 피부 발암 모델의 맥락에서 마우스의 생체 내 절차와 함께 사용할 수 있습니다. 안락사 된 성인 마우스에서 등쪽 피부 샘플을 수확 한 후, 자동 색포지와 메스를 사용하여 털이 많은 쪽에 하나의 등쪽 피부를 얇은 페트리 접시에 넣고 조직이 반투명 할 때까지 복부 피부 조직에서 지방을 포함한 피하 조직을 긁어 냅니다.
긁힌 피부를 PBS에 놓고 다른 나머지 모든 스킨이 처리될 때까지 놓습니다. 그런 다음 메스를 사용하여 피부 샘플을 0.5~ 1.5센티미터 스트립으로 자른다. 20 밀리리터 PBS의 표면에 시료 털이 많은 면을 부수기 전에 무균 페트리 접시에 스트립 털이 많은 면을 올려 놓고 20밀리리터 PBS와 2개의 x 젠타미신 용액을 플라스틱 100x 20mm 페트리 접시에 0.25%의 트립신으로 보충합니다.
인큐베이션의 끝에, 멸균, 플라스틱, 사각형 페트리 접시를 포함하는 15 밀리리터의 수확 매체를 30도 경사면에 넣고 곡면 집게를 사용하여 부동 피부 스트립을 조심스럽게 접시에 옮킨다. 피부에 수직 각도로 새로운 메스 블레이드를 잡고 충분하지만 과도한 힘을 사용하여 샘플에서 표피와 머리카락을 매체로 긁어 냅니다. 모든 스트립이 긁어지면, 1.5 인치 자기 교반 바를 포함하는 멸균 60 밀리리터 항아리에 수퍼넌트를 포함하는 표피 세포를 신중하게 감소시키고 나머지 표피 세포를 수집하기 위해 추가 수확 매체로 페트리 접시를 헹구는다.
항아리의 최종 부피를 신선한 배지로 30 밀리리터에 넣고 실온에서 20분 동안 분당 100회전으로 표피 세포 용액을 저어줍니다. 생물 안전 캐비닛에서 교반 인큐베이션의 끝에서 교반 바를 제거하고 50 밀리리터 원추형 튜브로 70 마이크로 미터 여과기를 통해 세포 용액을 필터링합니다. 집게와 파이펫을 사용하여 스트레이너를 통해 머리카락과 지층 각막 물질을 눌러 조직을 조작하여 조직을 조작하여 갇힌 모발 세포를 방출하고 남은 갇힌 모발 세포를 튜브로 방출하기 위해 수확 매체의 5 밀리리터를 추가로 사용합니다.
표피 세포와 머리카락이 조작되어 모낭에서 세포를 방출하는 것이 중요합니다. 튜브의 총 부피를 신선한 배지로 최대 50 밀리리터까지 가져와 서원심분리로 세포 여과를 수집합니다. 5 밀리리터 파이펫으로 약 20개의 트리튜션에서 신선한 수확 매체의 5밀리리터로 펠릿을 다시 놓습니다.
1-20 희석의 0.5 밀리리터를 복용하여 2 밀리리터 마이크로퍼지 튜브로 옮기십시오. 샘플을 신중하게 혼합한 후 마이크로퍼지 튜브에서 200 마이크로리터를 가져 와서 동일한 부피인 0.4 % trypan blue 용액과 부드럽게 섞습니다. 이 용액을 세 번 부드럽게 혼합하고 핵 각질 세포를 계산하기 위한 혈종계로 세포를 전달합니다.
모든 어두운 파란색 세포를 실행 불가능한 세포로 점수매기고 작은 금과 분홍빛이 도는 세포를 실행 가능한 세포로 점수로 매김시합니다. 생존가능성은 평균 약 80%이며 마우스당 최종 각질 세포 수율은 약 3천만 개의 실행 가능한 세포여야 합니다. 카운트 후, 또 다른 원심분리로 세포를 수집하고, 질량 배양을 위해 세포 배양 배지의 2 밀리리터에서 35밀리미터 페트리 접시당 6번째 실행 가능한 각질 세포에 2~4회 10회 를 되감는다.
clonogenic 식민지 형성 분석의 경우, X 선 조사 스위스 마우스 3T3 피더 층에 콜라겐 농도 60 밀리미터 페트리 접시코팅 콜라겐 당 혈청 농도에 보충제와 수정 된 윌리엄의 E 매체의 4 밀리리터 당 세 번째 각질 세포에 1 회 10에 세포를 다시 중단. 질량 배양의 경우, 적절한 세포 배양 기간에 대해 이산화탄소를 5%로 섭씨 32도에서 성장시다. 질량 배양에 대한 초기 시드 후 24 시간 및 그 후 일주일에 세 번 중간을 변경합니다.
복제 문화의 끝에서 매체를 흡인하 고 실온에서 밤에 10%버퍼링 된 포르말린콜로 콜로니를 고정한다. 다음 해 아침, 1시간 동안 오토클레이브 물에 0.5%의 로다민 B로 식민지를 얼룩지게 한 후, 물이 맑아질 때까지 차가운 오토클레이브 물로 접시를 헹구었다. 그런 다음 식민지를 세기 전에 뚜껑에 있는 요리를 말리십시오.
여기서, 다양한 국소 치료 후 각질 세포 식민지 형성 의 전형적인 결과가 나타난다. 모낭 줄기 세포는 전형적으로 마우스 모낭 줄기 세포 마커에 대한 흐름 세포 메트릭 염색에 의해 평가된 성인 C57BL/6 마우스 등쪽 피부로부터 분리된 세포의 약 9%를 구성합니다. 이 그림에서 4개의 상이한 중간 조건 하에서 배양 후 각질 세포 줄기 세포 콜로니의 성장 특성을 관찰할 수 있다.
이 절차에 따라, 세포는 유동 세포 측정, 형광 활성화 세포 분류, 세포 배양 및 분자 생물학적 분석에 사용될 수 있다. 이 기술은 표피 줄기 세포의 수가 새로운 줄기 세포 조절 유전자의 식별으로 이어지는 정량적이고 복잡한 특성임을 확인할 수 있었습니다.
