이 방법은 선형 올리고뉴클레오티드, DAS의 소스 재료로부터 DNA 나노기술을 좀 더 원형 DAS로 확장한다. 이러한 기술의 주요 장점은 대부분의 실험실에서 간단하고 견고하며 저렴하다는 것입니다. 원형 DNA 정제를 위해, 20 마이크로리터의 포머미드를 신선하게 준비된 원형 DNA용액에 넣고, 혼합이 있는 140마이크로리터의 최종 부피에 넣습니다.
원형 DNA 용액의 16~20마이크로리터를 7~9개의 데나링 PAGE 젤 웰에 로드합니다. 해당 전구체 선형 DNA의 8개의 마이크로리터와 염색제 를 적재하는 2개의 마이크로리터를 혼합하고, 혼합물을 별도의 기준체에 잘 주입한다. 그런 다음 젤을 10볼트퍼센트에서 약 2시간 동안 실행하여 자일렌 시안올 FF가 젤 아래약 3분의 2를 관찰할 수 있을 때 달리기를 중단한다.
고무 장갑과 고글을 착용하고 젤을 형광 박층 크로마토그래피 플레이트에 옮기고 면도날을 사용하여 UV 조사에 의해 가려진 대상 젤 밴드를 차단합니다. 젤 밴드를 건조를 위해 2밀리리터 미세원심분리기 튜브에 넣은 다음 말린 젤을 페이스트에 넣고, 실온에서 하룻밤 동안 흔들리기 위해 젤의 두 배에 이온화 물을 넣습니다. 다음 아침, 혼합물을 2밀리리터 미세원심분리기 튜브로 필터링하여, 잔류 DNA를 복구하기 위해 소량의 이온화 된 물로 첫 번째 튜브의 측면을 헹구고, 다시 여과하여 슈퍼네이트를 결합합니다.
그런 다음 에탄올 강수량을 통해 원형 DNA를 정화하고 DNA를 섭씨 영하 20도에 저장합니다. 한 냄비 어닐링의 경우, 10배 의 Tris 아세테이트 EDTA 마그네슘 버퍼의 마이크로리터 2개, 선형 및 원형 가닥 세트의 각 10마이크로리터 DNA 스톡 솔루션 1개, 200마이크로리터 PCR 테스트 튜브에 추가 Tris EDTA 버퍼를 200 마이크로리터 PCR 테스트 튜브에 혼합하여 20마이크로리터의 최종 부피에 넣습니다. 그런 다음 48시간 이상 95~25도의 열병에 조립 용액을 음결합니다.
무한 격자의 2 단계 어닐링의 경우, 10 배 Tritate EDTA 마그네슘 버퍼의 두 마이크로 리터, 동일한 어어 비에 선형 및 원형 가닥의 각 10 마이크로 리터의 마이크로 리터, 추가 트리스 EDTA 버퍼 200 마이크로 리터 PCR 테스트 튜브, 최종 볼륨 20. 첫 번째 하위 타일 어닐링 단계에서, PCR 써모사이클러의 각 전구체 하위 타일 용액을 2시간 반 이상 95~25도의 빠른 선형 냉각 방법을 사용하여 음막. 조립 용액을 준비하려면, 4개의 무한 격자 각각에 대해, 각 두 개의 해당 하위 타일 용액각각의 10 마이크로리터를 각 가닥에 대해 0.25 마이크로몰라의 최종 농도로 혼합한다.
제2 격자 어닐링 단계에서, 느린 냉각 방법을 사용하여 PCR 써모사이클러에서 20 마이크로리터 혼합물을 음닐한다. 두 개의 유한 사각형 격자의 두 단계 어닐링의 경우, 10 배 트리시테이트 EDTA 마그네슘 버퍼의 마이크로 리터 1 개, 선형 및 원형 가닥 세트의 각각 10 마이크로 리터의 0.5 마이크로 리터와 200 마이크로 라이트 PCR 의 마이크로 라이트 PCR 테스트R 에 추가 Tris EDTA 버퍼를 혼합합니다. 첫 번째 어너링 단계에서, PCR 써모사이클러의 각 전구체 서브 타일 용액을 빠른 선형 냉각 방법을 사용하여, 입증된 바와 같이, 95~25도, 2시간 반 이상, 200마이크로리터 PCR 시험관에 함께 2마이크로리터를 혼합한다.
이어서, 제2 어닐링 단계에서, 써모사이클러내의 64 마이크로리터 혼합물을 음침하여, 느린 냉각 방법을 사용하여, 입증하였다. 유한 격자의 전기포고 정화를 위해, 원토2%아가로즈 젤을 준비하고 유한 격자 용액의 20 마이크로리터를 각 우물에 적재하고, 100 내지 3000베이스 페어 DNA 사다리의 5마이크로리터를 별도의 우물로 첨가한다. 얼음 수조에서 5볼트퍼센트에서 2시간 동안 젤을 실행한 후, 목표 젤 밴드를 UV 빛 아래 1000베이스 페어 마커의 약 수준으로 자르고 젤 밴드를 미세한 조각으로 자른다.
분쇄된 젤을 필터 컬럼에 넣고 컬럼을 원심분리하여 격자를 추출합니다. 그런 다음, 원자력 현미경 이미징용 솔루션을 수집한다. 폴예탈렌 글리콜 또는 PEG에 의한 유한 격자 정제의 경우, 유한 격자 용액의 50 마이크로리터를 15%PEG 8000 버퍼의 동일한 부피로 혼합하고, 원심분리용액을 원심분리하고, 페그 버퍼의 100마이크로리터에 펠릿을 다시 일시 중단하여 추가원심분리를 한다.
두 번째 원심 분리 후, 원자력 현미경 이미징을 위해 Tris 아세테이트 EDTA 마그네슘 버퍼에서 펠릿을 다시 중단합니다. 무한한 2D 격자 원자력 현미경 이미징의 경우, 신선한 형태의 운모층을 갈라서 안래 샘플의 마이크로리터 2개를 깨끗한 표면에 증착하십시오. DNA 격자가 2분 동안 현미경 표면에 흡수하여 표면을 두 번 세척하기 전에 세척당 100 마이크로리터의 이온화 된 물을 사용하여 두 번째 세척 후 압축 공기로 표면을 건조시십시오.
공기 중의 무한DNA 격자의 원자력 현미경 이미지를 얻으려면 이미징 소프트웨어에서 태핑 모드를 열고 스캔 크기를 0.5 내지 5 마이크로미터로 설정하고 스캔 크기를 512줄로 설정하고 1내지 3.5 Hertz 사이의 스캔 속도를 설정합니다. 그런 다음 삼각형 원자력 현미경 프로브로 운하 표면을 스캔합니다. 유한 DNA 격자 이미징의 경우, 입증된 바와 같이 신선한 형태의 운모층을 갈라내고, 1겹 의 80마이크로리터를 1겹의 트리시테이트 EDTA 마그네슘 버퍼를 깨끗한 운하 표면에 보관하십시오.
다음으로, 완충에 유한 한 샘플 의 5 마이크로 리터를 추가하고, DNA 격자가 프로브에 TRIs 아세테이트 EDTA 마그네슘 버퍼의 또 다른 50 마이크로 리터를 추가하기 전에, 마이카 표면에 흡수 하는 2 분 허용. 이어서, 스캔 크기를 0.5~ 1마이크로미터로 설정하고, 스캔 해상도를 256선으로 설정하고, 스캔 속도를 1.5 Hertz로 설정하고, 삼각형 프로브로 표면을 스캔하기 전에, 입증된 바와 같이. 원형 DNA는 서투른 PAGE에서 전구체 선형 DNA보다 약간 느리게 움직이며, 이는 원형 DNA 내부의 모공이 젤 섬유에 의해 침투되고 지연되기 때문입니다.
원형 64 뉴클레오티드 어셈블리 제품군은 각 어셈블리에 대해 단 하나의 명확하고 깨끗한 대역을 가지고 있으며, 단일 모티프의 안정성을 확인합니다. 그러나 타일의 원형 84 뉴클레오티드 어셈블리 제품군은 주요 대역 주변에 얼룩이 있으며, 이는 사소한 부산물의 존재를 나타냅니다. 잘못된 동료의 제품에 의해 사소한에 관계없이, 높은 수율을 가진 우수한 격자는 대상 단조량 모티브에서 조립 될 수있다.
각 어셈블리는 나노와이어, 나노튜브, 나노나선형, 나노리본 및 나노사각형과 같은 마이크로미터 스케일에 고유한 형태학적 특징을 가지고 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 특히, 단계 중 또는 오프 파편 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 기술은 DNA 나노 기술 분야의 연구를 위한 길을 열어 좀 더 원형 DNA 나노 기술의 새로운 가족 구성원을 탐구합니다.
