우리는 새로 합성 된 DNA의 EdU 표지 및 나노 골드 입자의 은색 강화 및 크로마틴의 ChromEM 염색을 통한 라벨 검출에 의해 세포 내의 복제 도메인의 전자 현미경 시각화를위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 상온 샘플 처리를 위해 크로마틴의 최상의 구조적 보존을 제공하는 전통적인 글루타르알데히드 고정으로 고대비 사전 임베딩 라벨링을 제공합니다. 이 프로토콜은 페트리 접시의 커버슬립 상에서 성장하는 부착 세포에 최적화되어 있습니다.
EdU를 최종 농도 10 마이크로몰에 첨가하고, 원하는 라벨링 시간 동안 세포를 인큐베이터에 넣는다. 표지 된 세포를 100 밀리몰 소듐 카코딜레이트 용액에 2.5 % gluaradehydrate로 1 시간 동안 고정하십시오. 고정 시간이 길면 EdU 라벨링에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다.
샘플을 다섯 밀리몰의 염화마그네슘으로 보충된 PBS로 헹구어 글루타르알데히드를 제거하고, PBS 스타로 더 간주한다. 10 분 동안 세 번 씻으십시오. PBS 별에 Trione X-100의 1 % 용액으로 원형질막을 투과시키고 각각 5 분 동안 두 번 변경하십시오.
이 용액은 PBS 스타 T.Exexex로 샘플을 PBS 스타로 광범위하게 세척하는 것으로 추가로 지칭된다. 각각 다섯 분 동안 다섯 가지 변경 사항. 잔류 알데히드 그룹을 PBS 별에 20 밀리몰의 글리신으로 담금질하고, 10분 동안 2회 켄칭한다.
샘플을 1%BSA로 PBS 별에 넣고 반시간 동안 보관한다. BSA에서 차단하면서 EdU 검출을 위해 반응 칵테일을 준비하십시오. 구성 요소 추가 순서가 중요합니다.
EdU 비오틴-아지드 컨쥬게이션은 반응 칵테일에서 증발 및 농도 이동을 최소화하기 위해 습한 챔버에서 수행된다. 촉촉한 챔버를 준비하십시오. 커버슬립을 파라 필름 위에 올려놓고 세포를 위로 향하게 하고 50 내지 100 마이크로리터의 반응 칵테일을 커버슬립 위에 올려 놓는다.
반응은 실온에서 30 분 걸립니다. PBS 별 T에서 샘플을 세척하여, 각각 다섯 분 동안 다섯 번 세척하여 반응을 중지시킨다. PBS 별 T에 1%BSA로 다시 차단하여 반 시간 더 차단합니다.
PBS 별 T에 스트렙타비딘-나노골드 용액을 1%BSA로 준비한다. 샘플을 스트렙타비딘으로 하룻밤 동안 플러스 네 도에서 새로 준비된 습한 챔버에서 배양하십시오. 이 절차는 EdU 비오틴-아지드 접합과 동일합니다.
반응을 중지하고 샘플을 세척하고, PBS로 각각 10분 동안 다섯 번 스타티.안정화 비오틴 스트렙타비딘 복합체를 추가로 고정시켜 PBS 스타글루타르알데히드 1%글루타르알데히드를 반시간 동안 고정시킨다. 탈이온수로 강렬한 세척으로 글루타르알데히드를 제거하십시오. 잔류 알데히드 그룹을 밀리리터 나트륨 보로하이드라이드 당 하나의 밀리그램으로 담금질한다.
다시 철저히 씻으십시오. 다음 단계는 황금 코스에 은을 증착함으로써 나노 금 입자의 크기를 증가시키는 것입니다. 암실 활동을 최소화하기 위해 프리믹스를 준비하십시오.
샘플을 세척 완충액으로 평형화시키고 암실로 진행하십시오. 암실에서 성분을 혼합하여 세척액을 준비하고 샘플에 적용하십시오. 아카시아 분말 용액은 매우 점도가 높습니다.
따라서 구성 요소를 혼합하는 동안 거품과 거품 형성을 피하기 위해 튜브를 천천히 흔드십시오. 반응은 두 분에서 다섯 분 정도 걸립니다. 최적의 반응 시간을 결정하기 위해 테스트 실행을 수행하는 것이 좋습니다.
더 긴 인큐베이션 시간은 비특이적 인 은 증착을 초래할 수 있습니다. 반응을 멈추려면 탈이온수의 세 가지 내지 다섯 가지 변화로 샘플을 빠르게 헹구십시오. 그 다음에는 각각 다섯 분 동안 세 가지 변경 사항이 더 있습니다.
오스뮴 테트록사이드에 의한 용해로부터 은 나노입자를 보호하기 위해, 샘플을 암흑 속에서 두 분 동안 0.05% 테트라클로로우르산에서 인큐베이션한다. 탈 이온수로 철저히 씻으십시오. 이 단계에서, 추가적인 콘트라스트가 함유 물질을 함유하는 DNA에 첨가된다.
DRAQ5 DNA 염색으로 샘플을 포화시킵니다. 디아미오노벤지딘 용액을 샘플에 첨가하고 일분 동안 인큐베이션한다. 커버 슬립을 유리 바닥 페트리 접시로 옮기고 거꾸로 된 현미경의 무대에 놓습니다.
640 나노 미터 적색 빛으로 여러 시야를 조사하십시오. 왼쪽 패널은 DRAQ5의 완전한 사진 표백을 보여줍니다. 오른쪽 패널에서, DAB 침전물을 나타내는 투과광에서 동일한 시야각이 영상화된다.
탈이온수로 샘플을 세척하십시오. 다음 단계는 흄 후드 아래에서 수행되어야합니다. 부분적으로 환원된 오스뮴 테트록사이드 용액을 제조하였다.
조심하세요. 이 물질은 매우 휘발성이며 독성이 있습니다. 준비된 용액을 샘플 상에 바릅니다.
이 단계에서, 환원된 오스뮴 화합물은 디아미오노벤지딘 침착과 반응하여 DNA의 콘트라스트를 증가시킨다. 현지 규정에 따라 오스뮴 함유 용액을 폐기하고 샘플을 다섯 분 동안 세 번 씻으십시오. 샘플은 일련의 증가된 에탄올 농도에서 추가로 탈수되고, 이어서 에탄올 수지 혼합물로 세포의 침윤이 뒤따른다.
알코올 수지 믹스를 갓 준비된 순수한 수지로 교체하십시오. 적절한 크기의 임베딩 몰드를 갓 준비된 수지로 채 웁니다. 셀이 수지로 채워진 캐비티 위로 아래로 향하도록 커버슬립을 놓습니다.
37도에서 24 시간 동안 수지를 경화하십시오. 그런 다음 적어도 이틀 동안 60도에서. 덮개의 바닥면에서 수지를 제거하십시오.
슬래브를 액체 질소에 떨어 뜨린 다음 끓는 물로 옮깁니다. 유리는 분리되어야합니다. 필요한 경우 반복하십시오.
조사된 시야는 디아미오노벤지딘 침착 및 DAB 염색으로 인해 명확하게 볼 수 있어야 한다. 쇠톱이나 다른 적절한 도구를 사용하여 슬래브에서 관심 영역을 잘라냅니다. 컷아웃을 울트라마이크로톰 단순 홀더에 넣습니다.
최종 블록 트리밍을 위해 울트라 마이크로 톰을 설정하십시오. 면도날을 사용하여 피라미드 모양의 필렛을 준비하십시오. 피라미드 꼭대기에있는 평평한 면적의 크기는 약 400 x 200 미크론이어야합니다.
준비된 피라미드를 울트라 마이크로 톰 암에 장착하고 칼을 설치하십시오. 섹션을 준비합니다. 단면 두께는 실험 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다.
우리는 EM 단층 촬영을 목표로합니다. 그래서 우리는 250 나노 미터 두께의 섹션을 세미 씬 섹션이라고도합니다. 나이프 가장자리에서 섹션을 분리하여 슬롯 그리드에 장착합니다.
우리는 슬롯 그리드를 사용했고, 그들은 한 밀리미터 둘레에 둥글고, 한 밀리미터의 측면 개구부가있었습니다. 작은 개구부 크기는 섹션의 더 나은 안정성을 제공합니다. 샘플을 그리드에서 말리십시오.
현재 섹션은 관찰 할 준비가되었습니다. 그리드를 전자 현미경 샘플 홀더에 넣습니다. 샘플을 전자 현미경에 적재하십시오.
틸트 시리즈를 획득합니다. 포유류 세포 핵에서의 복제 초점은 S상 진행에 따라 뚜렷한 분포 패턴을 나타낸다. 형광 표지된 아지드와의 클릭 반응에 의해 확인된 성공적인 EdU 라벨링은 글루타르알데히드가 상부에 고정된 후 이종 세포 집단에서 전형적인 복제 패턴을 입증한다.
스트렙타비딘 라벨링은 글루타르알데히드에 의해 영향을 받을 수 있다. 그래서 먼저 스트렙타비딘 나노골드와 동일한 조건으로 염색한 스트렙타비딘 형광을 하단에 확인한다. 은 증진 절차의 좋은 결과는 바닥에 표시된 일부 핵과 매우 희미한 노란색 세포 플라스트 염색의 짙은 갈색 염색입니다.
사전 임베딩 라벨링의 장점은 단면화를 위해 셀을 선택할 수 있다는 것이다. 이 단계에서는 라벨링 패턴이 밝은 현장 현미경으로 보이기 때문에 가능합니다. 적절한 레이블 지정으로 인해 잘 구분된 복제 사이트가 생성됩니다.
화살촉은 DAB 염색된 크로마틴 섬유를 보여준다. 오른쪽의 배경 라벨링은 평방 미크론 당 몇 개의 나노 입자로 제한됩니다. 반박형 섹션은 단층 촬영을 할 준비가되어 있으며 금 나노 입자를 추가 할 필요가 없습니다.
기술된 접근법은 복제가 가능한 부위에서 크로마틴 조직의 연구에 사용되었다. 크로마틴 분리의 고해상도 이미징을 포함하는 크로마틴의 복제 후 재배열 분석용. 또한 큰 염색체 도메인의 복제 표지 및 고차 크로마틴 폴딩 및 헤테로 크로마틴의 연구에 사용됩니다.
이러한 이미징 기술은 또한 다른 비현미경적 접근법에 의해 생성된 데이터의 기준점으로서 중요하다. 이 방법은 또한 초해상도 기술을 포함하는 상관 관계된 현미경 연구에 수용될 수 있다. 이것은 크로마틴 고차 구조와 세포의 다양한 생리 학적 상태에서의 역학에 대한 연구에서 새로운 지평을 열어줍니다.
