이 프로토콜은 살아있는 세포에서 미토콘드리아 막 전위 및 미토콘드리아 질량을 측정할 수 있는 간단한 유동 세포계 기반 분석입니다. 표준 신진 대사 분석은 조혈 줄기 세포와 같은 희소한 인구로 일할 때 실패합니다. 이 방법은 사용자가 세포의 낮은 수로 작업 할 때 미토콘드리아 막 프로파일링을 가능하게하고 HSC와 같은 세포의 새로운 대사 변조기를 결정할 수 있습니다.
더욱이, 당신은 당신의 세포 포스트 배양의 기능을 결정하기 위해 골수 이식 또는 식민지 형성 소와 같은 다운스트림 기능적 작용과 결합 할 수 있습니다. 우리의 기술은 골수 이식및 조혈 면역 회복의 맥락에서 HSC 기능을 향상할 수 있는 새로운 분자의 식별을 위해 이용될 수 있습니다. 우리의 프로토콜에 설명 된 바와 같이, 우리의 방법은 면역 T 세포의 신진 대사 적 적합성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
세포가 염색 한 후 빛에 최소한의 노출을 갖는 것이 매우 중요합니다. 더욱이, 펌프 억제제 베라파밀의 사용은 펌프 efflux의 기여를 평가하기 위해 포함되어야 한다. 그러나, 사용자는 verapamil 심오닉 평형을 심오하게 perturbs 하 고 미토 콘 드리 아 막 잠재력에 대사 변조기의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 없습니다 알고 있어야.
이 방법의 시각적 데모는 셀 수가 적은 작업할 때 염두에 두어야 할 몇 가지 중요한 단계가 있기 때문에 매우 중요하며 이러한 단계는 사용자가 PubMed에서 읽는 일반 논문에서 매우 자주 누락됩니다. FAC 정렬의 경우, 계보 네거티브, Sca1 양성, cKit 양성으로 정의된 LKS 모집단이 식별됩니다. LKS 인구에 있는 세포의 약 5에서 10%에서 조혈 줄기 세포는 HSC로 표지된 CD150 양성, CD48 음성 인구에 대한 게이팅에 의해 확인됩니다.
조혈 줄기 세포 분류 후, 원심 분리는 섭씨 4도에서 5 분 동안 300 배 g에서 튜브를 분리합니다. 펠릿을 손상시키지 않고 대부분의 상체를 부드럽게 제거하고 셀 펠릿 위에 50~80마이크로리터를 둡니다. 줄기 세포 팽창 매체에서 세포 펠릿을 200 마이크로리터의 최종 부피로 재중단한다.
멸균 조직 배양을 준비하여 96U-바닥 우물 플레이트를 처리하고 세포가 배양될 우물을 식별한다. 이전에 이러한 우물에서 제조 된 2 배 기저 배지의 100 마이크로 리터를 전송합니다. NR에서 잘 표시, 100 x 니코틴 아미드 리보 사이드 솔루션의 두 마이크로 리터를 추가합니다.
염색 제어를 위해 2배 기저 배지의 100마이크로리터를 우물로 옮기다. 2배 기저매질을 함유한 우물 위에 준비된 조혈 줄기세포의 100마이크로리터를 시드한다. 스테인링 컨트롤로 표시된 우물에 전체 골수 세포의 100 마이크로 리터를 시드.
모든 주변 우물에 200 마이크로리터의 오토클레이터를 추가하여 세포가 함유된 우물의 증발을 줄입니다. 72시간 동안 5%의 이산화탄소를 37도의 인큐베이터에 보관하십시오. 24시간마다 니코티나미드 리보사이드를 보충하기 위해 접시를 꺼내 인큐베이터에 다시 넣습니다.
배양 기간이 끝나면 각 테스트 웰에 100x TMRM 용액의 마이크로리터 2개와 100x 녹색 형광 얼룩 용액 2개를 추가합니다. TMRM 염색 제어에 100x TMRM의 마이크로리터 2개를 잘 추가합니다. MitoTracker 염색 컨트롤에 100x 녹색 형광 얼룩의 두 개의 마이크로리터를 잘 추가합니다.
알루미늄 호일로 접시 의 상단을 덮습니다. 접시를 37°C의 인큐베이터에 다시 놓고 이산화탄소를 5%에서 45분간 조리합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 원심분리기를 300배 g에서 5분간 분리합니다.
플레이트를 반전하여 상체를 제거하고 표준 FACS 버퍼 200 마이크로리터를 추가하여 다시 일시 중지합니다. 호일로 접시를 덮습니다. 접시를 300배 g에서 5분간 원심분리합니다.
이 세탁 단계를 세 번 반복하십시오. FACS 버퍼의 200 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고 FACS 튜브로 전송합니다. 유량 사이토미터에서 샘플을 실행하려면 먼저 단일 색상 컨트롤을 컴퓨터에 로드하고 각각 5, 000개 이상의 이벤트를 하나씩 기록합니다.
소프트웨어에서 다운로드를 누르고 대시보드에 기록하여 단일 색상 컨트롤을 획득하고 기록합니다. 보상 설정을 누르고 보상 계산을 클릭하여 보상을 계산합니다. 보상이 적용되면 조혈 줄기 세포 샘플을 획득하고 가능한 한 많은 이벤트를 기록하십시오.
사이토미터에서 FACS 파일을 내보내고 분석 소프트웨어에서 파일을 엽니다. FlowJo에서, 세포 인구를 확인하기 위해 전방 산란 및 측면 산란 게이팅을 사용합니다. 다음 게이트에서 싱글을 식별한 다음 라이브 셀을 나타내는 DAPI 음수 분수를 플롯합니다.
살아있는 세포 게이트에서, 각각 미토콘드리아 막 전위와 질량을 측정하기 위해 TMRM 및 녹색 형광 얼룩 채널에서 윤곽 플롯을 합니다. 라이브 셀 게이트에서 이 두 채널의 평균 형광 강도를 내보냅니다. 그런 다음 모든 샘플에서 TMRM 로우 게이트에서 셀의 비율을 내보냅니다.
니코틴아미드 리보사이드 치료는 TMRM 낮은 인구에 있는 명확한 증가를 보여주었습니다. 또한 TMRM 낮은 게이트에서 세포의 비율을 크게 증가시키고 TMRM 형광 강도의 현저한 저하를 보였다. 미토콘드리아 질량은 니코틴아미드 리보사이드 보충제에 따라 변하지 않았다.
또한, 줄기 세포 마커 염색은 미토콘드리아 염색 후 배양과 결합되었다. 조혈 줄기 세포를 식별하는 게이팅 전략으로 니코틴아미드 리보사이드에 대한 노출은 TMRM 저인구의 현저한 증가와 게이트 HSC의 TMRM 형광 강도의 현저한 감소를 보였다. 녹색 형광 미토콘드리아 얼룩 녹색 신호는 두 가지 조건에서 변경되지 않았습니다.
염색된 시료에 대한 빛의 노출을 최소화하기 위해 알루미늄 호일로 염색 판을 덮는 것이 중요합니다. 이 방법은 골수 이식 및 콜로니 형성 소법과 같은 다운스트림 소법과 결합하여 줄기 세포의 기능을 결정할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 HSC의 새로운 신진 대사 변조기의 식별을위한 간단한 스크리닝 방법을 허용합니다.
