저자는 기술 지원 로버트 Holdcraft 감사드립니다. 이 연구는 USDA CSREES 특별 권한 부여 (2009-34155-19957) 및 해치 자금 (NJ08192)에 의해 부분적으로 투자되었다.

1. 휘발성 물질의 유도 지역 : herbivore 손상 <ol><li> 블루베리 식물의 두 가지가 잡아 늘인 폴리에스터 슬리브로 체포됩니다. </li><li> 여섯 집시 나방의 유충은 (2 차 -3 층 instars) 가방 안에 사전 휘발성 컬렉션에 2 일간 식물에 피드를 사용할 수 있습니다. 제어 식물은 어떤 유충을받지 않습니다. </li><li> 휘발성 배출량은 3 일 (그림 1)에서 (프로토콜 # 7) 아래에 설명된대로 수집하고 있습니다. 폴리에스터 슬리브 탈출에서 곤충을 방지하기 위해 식물에 남아 있습니다. </li></ol> 2. 휘발성 물질의 유도 지역 : 기계적 손상 <ol><li> 식물 기계적 손상이 집시 나방에 의해 제거 잎 영역의 금액을 모방하기 위해 구멍을 펀칭 자국으로합니다. </li><li> 공장마다 다섯 잎은 일 1과 2의 끝에 기지와 나뭇잎의 상단 부분에 위치한이 7 mm 구멍이 부상하고 있습니다. 제어 치료 기계적 손상을받지 않습니다. </li><li일 3 아래에 설명된대로&gt; 휘발성 배출을 수집하고 있습니다. </li></ol> 3. 휘발성 물질의 유도 지역 : MeJA <ol><li> 블루베리 식물은 0.1 % 십대 초반 - 2​​0 솔루션 MeJA 중 하나가 1 또는 1.5 MM 솔루션의 10 ML로 취급됩니다. </li><li> MeJA는 2 온스 스프레이 병을 사용하여 적용됩니다. 제어 식물은 0.1 % 십대 초반 - 2​​0 용액 10 ML과 함께 분무 있습니다. </li><li> 식물은 16시 시간에 처리하고, 17 cm 직경 휘발성 컬렉션하기 전에 35 cm 높은 플렉시 챔버 내부에 15 시간을위한 온실에 보관됩니다. </li><li> 아래에 설명된대로 휘발성 배출을 수집하고 있습니다. </li></ol> 4. 휘발성 물질의 체계적 유도 : 내부 신호 <ol><li> 블루베리 식물의 낮은 지점은 스펀 폴리 에스테르 슬리브와 함께 체포와 가방 내부 육 (2 차 -3 층 instars) 집시 나방의 유충을 배치하여 손상되었습니다. </li><li> 손상된 지점은 휘발성 수집 챔버 밖에서 남아있는 동안 branche손상된 지점 위의들 (그림 2) 챔버 내부에 배치됩니다. </li><li> 쐐기 벌레는 2 일 동안 바닥 지점에 먹이를 사용할 수 있습니다. </li><li> 일 3 시작, 휘발성 물질이 손상된 식물의 손상 부분에서 수집하고 있습니다. </li><li> 휘발성 물질 7 연속 일 동안 수집하고 있습니다. 제어 식물은 유사한 방식으로 취급되지만 herbivore 손상을받지 못했습니다. </li></ol> 5. 혈관 연결 <ol><li> 이 연구는 블루베리 공장 내의 서로 다른 지점 사이에 혈관 연결의 정도를 결정. </li><li> 공장에서 낮은 지점의 최종 부분으로 Orians 외에 설명된 Rhodamine - B (시그마 - 올드 리치) 염색 (0.25 % W / V), 6 ML 솔루션을 포함하는 꽃의 물 선택을 지원하기 위해 절단됩니다. 11 </li><li> 식물을 통해 염료의 운동은 7 일 동안 매일 모니터링합니다. </li><li> 7 일 후, 붉은 얼룩의 크기는 시각 식물의 다른 위치에서 평가됩니다. </li></ol> 6. HIPVs에 노출 : 외부 신호 <ol><li> 공장 내에서 가지는 두 인접한 지점에서 HIPVs에 노출 또는 HIPVs에 전혀 노출을받지 않습니다. </li><li> HIPVs에 지점을 노출 한 낮은 지점은 폴리 에스테르 슬리브 여섯 (2 차 -3 층 instars) 집시 나방의 유충이 봉지 (그림 3) 내부 배치와 함께 체포됩니다. </li><li> 공장은 위에서 설명한 것과 유사한 플렉시 챔버 내부에 갇힌입니다. 곤충은 인접 가지는 유도 방출 지점에서 휘발성 물질에 노출되는 등, 2 일간 식물에 피드를 사용할 수 있습니다. </li><li> 노출 후 (3 일), 노출된 지점은 곤충 부상에 지점 밖으로 (그림 2에서 볼 수)두고, 휘발성 수집 챔버 내부에 배치됩니다. </li><li> HIPV 노출 가지의 휘발성 물질은 아래에 설명된대로 수집하고 있으며, 낮은 지점에서 소비 잎 영역의 크기는 귀공자 이미지 Softwa를 사용하여 측정다시. </li></ol> 7. HIPVs으로 노출 : 마중물 <ol><li> 공장 HIPV 노출 후 &quot;준비하는&quot;여부를 확인하려면, 식물은 프로토콜 # 5에서와 같이 취급됩니다. </li><li> 식물 중 절반은 유도 인접 지점에서 HIPVs에 노출되며, 나머지 절반은 손상되지 않은 지점에 노출되는 동안. </li><li> 3 일, 맨투맨으로 초기 2 기 - instar의 집시 나방의 유충은 각 공장에 배치하고 아래에 설명된대로 휘발성 물질은 (그림 4) 수집하고 있습니다. </li><li> 휘발성 컬렉션 후, 처음, 집시 나방의 유충뿐만 아니라 3 일에 손상되는 사람에 의해 손상된 잎을 excised 있으며, 잎 지역 소비의 금액이 측정됩니다. </li></ol> 8. 휘발성 물질의 수집 <ol><li> HIPV 배출은 푸시풀 시스템을 사용하여 온실에서 샘플입니다. herbivore 손상 치료에 유충을 포함하여 화분에 심은 식물의 위 지상 부분 (줄기, 가지, 그리고 단풍이), 4 L vola 내부에 배치됩니다타일​​ 수집 챔버. 2 조각의 단두대는 식물의 기반을 지원합니다. 정화 공기 2 L / 분 속도로 각 챔버의 상단에 들어갑니다. </li><li> 휘발성 물질은 Alltech 슈퍼 - Q 1 L / 분 속도로 실에서 공기를 당겨 흡착제의 30 MG 가득 트랩으로 수집하고 있습니다. </li><li> 휘발성 수집 장치는 네 가지 식물 (그림 1)에서 휘발성 물질의 동시 모음에 대한 허용, 넷 챔버로 구성되어 있습니다. </li><li> 컬렉션은 오전 9 시부터 17시 H.으로 낮에는 실시 </li><li> 수집 후, 식물의 모든 잎은 수확되며, C ° 60 건조 오븐, 그리고 무게, 그리고 여왕님 수돗물과 70 % 에탄올로 씻어서 있습니다. </li></ol> 9. 휘발성 물질의 분석 <ol><li> 슈퍼 - Q 트랩에서 수집한 휘발성 물질은 dichloromethane (150 μl) 400 N - 옥탄의 NG 내부 표준과 함께 추가됩니다 eluted 있습니다. </li><li> 화합물의 분리 및 부량은 휴렛 팩커드 6890 시리즈 이루어집니다불꽃 이온화 검출기 (FID) 및 장착된 기체 크로마토 그래프 (GC) (그림 5), 애질런트 HP - 1 컬럼 (10 MX 0.53 mm X 2.65 μm의) 및 캐리어 가스로 사람을 사용 (일정한 흐름 = 5 ML / 분 , 속도 = 39cm / 초). 온도 프로그램이 40에서 시작 ° C 14에서 증가, 1 분 유지 ° 180 C / 분 ° C (2 분) 후, 40 ° 200 C / 분 ° C와 200 ° C에서 보관 2 분 . </li><li> 화합물의 임시 신분증은 캐리어 가스로 Supelco MDN - 5 열 (30 MX 0.32 mm X 0.25 μm의)을 갖춘 Finnigan 매트 8,230 질량 분석기 (MS)에 결합 Varian 3400 GC,과 그가 함께 수행됩니다. MS는 250에서 전자 이온화 (조회) 및 총 이온 크로마토 그램 (TIC) 모드에서 운영 ° C (소스 온도). 이 프로그램은 35 ° C (1 분), ° C / 분, 170 ° C, 15 ° 그리고 280 C / 분 ° C. 4 증가에서 시작 </li><li> 화합물은 미정 NIST 라이브러리와 B의 기능과 스펙트럼 데이터의 비교에 의해 식별됩니다Y GC 보존 지수와 상용 화합물의 그 자신의 유지 시간을 비교하여. </li></ol> 10. 대표 결과 : 스물 둘 휘발성 물질은 블루베리 잎 (그림 6)에서 식별되었습니다. 그림 7은 손상되지 않은 블루베리 잎의 대표 크로마토 그래프를 보여줍 집시 나방에 의해 먹이에 의해 손상을 떠납니다. 집시 나방의 유충에 의해 기계적 손상과 수유 컨트롤 (그림 8)에 비해 블루베리 나뭇잎에서 로컬 휘발성 물질의 배출량을 증가시켰습니다. 애벌레의 먹이에 비해 MeJA 처리는 집시 나방 (그림 9)에 의해 유도된 17 화합물 밖으로 11 유도. 칠일 초기 먹이 손상 (즉, 내부 신호 부족) (그림 10) 이후 집시 나방 - 손상 식물의 잎 손상에서 휘발성 물질의 체계 유도의 증거는, 그러나,이 없었다. 또한, 일주일 뒤에, 매우 움직임을 느리게빨간 염료의 ment는 블루베리 식물의 지점 (그림 11) 사이에서 관찰되었다. 높은 혈관 연결은 단일 지점 사이 잎 사이가 발생했습니다. 그러나, 두 수직 촬영 이내에 정렬된 지점, 그리고 촬영의 반대편에서 두 가지 사이의 낮은 연결 사이 중급 - 투 - 낮은 연결이있었습니다. HIPVs (그림 12)에 노출되지 않은 비교 HIPVs에 노출 지점에서 방출되는 휘발성 물질의 양의 차이가 없었다. 그러나, HIPVs은 블루베리의 외부 방어 신호로 작동. 나뭇잎을 먹이 집시 나방의 유충은 이전 unexposed 제어 단풍 (그림 13)에서 그 공급했던 것보다 71% 적은 잎 자료를 소비 HIPVs에 노출. 또한, HIPV 노출 지점에서 소비 잎 영역의 금액 당 방출 휘발성 물질의 금액 표시, unexposed 가지 (그림 14)에 비해 4 배 높은 것을 HIPV - 예에서 출발<html> 포즈를 가지는 herbivory (즉, 그들이 준비하는 줄)에 더 반응했다. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 푸시풀 시스템은 블루베리 식물의 휘발성 물질을 수집하는 데 사용됩니다. 식물은 유리 챔버 내부에 배치하고 깨끗한 공기는 그들을 통해 전달됩니다. 흡착제 자료를 포함하는 필터는 공장에서 배출 트랩 휘발성 물질 각 챔버의 측면에 붙어 있 었지. 진공은 필터를 통해 챔버 내부의 공기를 끌어하는 데 사용됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 블루베리 식물의 체계적 휘발성 반응을 연구하기 위해, 낮은 블루베리 가지는 중 집시 나방의 유충 (오른쪽 챔버) 또는 왼쪽 손상 (왼쪽 챔버)에 의해 손상되었다. 이일 (3 일)를 후, 손상 및 손상되지 않은 식물에서 피해가 상위 지점에서 휘발성 물질이 수집되었다. <html> ontent &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 손상되지 않은 지점에서 낙엽이 손상된 지점에서 HIPVs에 응답할 수 있는지 여부를 테스트하려면, 난 블루베리 식물의 각 지점 중 하나를 체포. 나는 그 식물의 절반의 가방 내부 집시 나방의 유충을 배치. 내 안에서 가방의 외부로 휘발성 물질의 움직임을 허용 사용되는 가방. 식물은 HIPVs에 손상 지점을 폭로 플렉시 챔버 내부에 배치했다. 휘발성 물질은 다음 노출 지점에서 수집되었다. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 손상되지 않은 지점에서 나뭇잎이 HIPVs에 노출 후 &quot;준비하는&quot;수 있는지 여부를 테스트하려면 실험은 그림 3에 설명되어 있지만 집시 나방의 유충은 각 휘발성 수집 챔버 내부 HIPV 노출과 unexposed 지점에 위치 것처럼 반복했다. G &quot;고도는 =&quot;그림 5 &quot;/&gt; 그림 5. 휘발성 컬렉션 후, 샘플 블루베리 식물에서 방출되는 휘발성 물질을 확인하고 수치로 기체 크로마토 그래프 (GC)에 주입하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig6.jpg" alt="그림 6"/> 그림 6. 적어도 22 화합물은 블루베리 잎에서 방출됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig7.jpg" alt="그림 7"/> 그림 7. 손상 블루베리에서 일반 chromatographs은 나뭇잎과 집시 나방의 유충에 의해 피해를 떠납니다. 휘발성 물질은 손상되지 않은 블루베리 잎에서 매우 낮은 금액에 방출하고 있습니다. 하지만, 단풍이 집시 나방의 유충에 의해 손상된 경우, 휘발성 물질의 배출이 급격히 증가했습니다. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig8.jpg" alt="그림 8"/> 그림 8. 그래프 손상 나뭇잎, M에서 방출되는 휘발성 물질 22 각각의 금액을 보여줍니다나뭇잎 echanically - 손상, 그리고 집시 나방의 유충에 의해 피해를 떠납니다. 쐐기 벌레에 의해 제거 잎 영역의 금액을 모방하는 인공 손상 블루베리 잎에서 휘발성 배출을 증가했지만 반응은 집시 나방의 먹이로 나뭇잎의 휘발성 응답과는 다른되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig9.jpg" alt="그림 9"/> 그림 9. JA 경로는 블루베리 잎에서 휘발성 방출을 조절 여부를 테스트했습니다. 식물은 MeJA 다양한 양의와 함께 분무되었습니다. 나는 exogenously - 적용 MeJA의 증가 농도는 블루베리 잎에서 휘발성 물질의 배출을 증가 것으로 나타났습니다. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig10.jpg" alt="그림 10"/> 그림 10. 그래프 컨트롤 블루베리 지점에서와 집시 나방 손상 식물 (전신 반응)에서 손상되지 않은 지점에서 방출되는 휘발성 물질의 총 금액을 보여줍니다. 휘발성 물질이 위해 수집되었습니다7 연속 일 할거야​​. 나는 식물의 낮은 지점에 초기 손상 후에도 휘발성 물질 칠일에 대한 체계적 유도를 찾을 수 없습니다. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig11.jpg" alt="그림 11"/> 그림 11. 난 블루베리 식물 내에 지점 간의 연결 혈관에 노출된 정도를 확인 rhodamine - B (적색 염료)를 사용합니다. 그 약 발견했습니다. 80%, 20 %, 5 %와 염료를 포함하는 지점에서 나뭇잎 0 %, 직접 염료, 염료를 포함하는 지점에 걸쳐 지점, 그리고 블루베리 공장 내에서 다른 촬영에 위치한 지점을 포함하는 지점 위에 가지는 각각 있었다 완벽하게 색소로 얼룩진. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig12.jpg" alt="그림 12"/> 그림 12. 그래프 HIPVs와 unexposed 지점에 노출 지점에서 방출되는 휘발성 물질의 양을 보여줍니다. 나는 HIPVs에 노출이 울다에서 휘발성 배출에 영향을 미치지 않았 발견손상 블루베리 가지를 재미. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig13.jpg" alt="그림 13"/> 그림 13. 그래프 HIPVs와 unexposed 지점에 노출 블루베리 지점에서 집시 나방의 유충에 의해 먹이의 양을 보여줍니다. HIPV 노출 가지의 유충은 unexposed 지점에 그에 비해 단풍 적은 금액을 소비. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig14.jpg" alt="그림 14"/> 그림 14. 전 소비 영역 당 방출 속도를 계산, 나는 HIPV 노출 지점이 증가 휘발성 응답 블루베리 가지의 나뭇잎을 준비하는 HIPVs 해당 노출을 나타내는 unexposed 가지와 비교 휘발성 물질의 방출 속도를 증가했다는 사실을 발견했습니다.

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나는 공개 아무것도 없어

푸시풀 휘발성 수집 장치는 식물 휘발성 물질의 헤드 스페이스 콜렉션을위한 표준 방법을 나타냅니다 여기서 설명했다. 이 장치는 집시 나방의 유충에 의해 herbivory에 블루베리 나뭇잎의 휘발성 응답을 결정하는 데 사용하며 나를 내부 식물 신호에 HIPVs의 역할에 대한 새로운 증거를 제공하기 위해 허용했다. 결과는 애벌레의 먹이 exogenously - 적용 MeJA를 보여 여기에 제시하고...

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 휘발성 수집 챔버 </td><td> 분석 연구 시스템즈 </td><td> VCC - G6X12DT - 1P </td><td> 게인스빌, 플로리다 </td></tr><tr><td> 공기 압축기, 20 여자, 오일 무료, 2 HP </td><td> 서쪽으로 </td><td> 3JR71 </td><td> Grainger 주식 판매 </td></tr><tr><td> 공기 전달 시스템 </td><td> 분석 연구 시스템즈 </td><td> VCS - ADS - 4AFM4C </td><td> 게인스빌, 플로리다 </td></tr><tr><td> 공기 수집 시스템 </td><td> 분석 연구 시스템즈 </td><td> VCS - MVCS - 4CX1P </td><td> 게인스빌, 플로리다 </td></tr><tr><td> 진공 펌프 100 - 150V, ¼ HP </td><td> Gast 제조 주식 회사 </td><td> <a href="http://www.grainger.com/Grainger/GAST-Vacuum-Pump-4F740">4F740</a> </td><td> Grainger 주식 판매 </td></tr><tr><td> 메틸 jasmonate </td><td> 시그마 - 올드 리치 &lt;/ TD&gt; <td> J2500 </td><td> 세인트 루이스, 미주리 </td></tr><tr><td> 십대 초반 - 2​​0 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 93,773 </td><td> 세인트 루이스, 미주리 </td></tr><tr><td> Rhodamine - B </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td></td><td> 세인트 루이스, 미주리 </td></tr><tr><td> 플라스틱 스프레이 병, 이온스 </td><td> Setco 주식 회사 </td><td></td><td> Cranbury, NJ </td></tr><tr><td> 스펀 폴리 에스테르 소매 </td><td> Rockingham 기회 주식 회사 </td><td></td><td> Reidsville, NC </td></tr><tr><td> 슈퍼 - Q 휘발성 수집 트랩 </td><td> 분석 연구 시스템즈 </td><td> VCT-1/4X3-SPQ </td><td> 게인스빌, 플로리다 </td></tr><tr><td> 귀공자 이미지 소프트웨어 </td><td> 귀공자 주식 회사 </td><td></td><td> 프레더릭, MD </td></tr><tr><td> Dichloromethane </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 270,997 </td><td> 세인트 루이스, 미주리 </td></tr><tr><td> 기체 크로마토 그래프 HP 6890 </td><td> 휴렛 팩커드 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 기체 크로마토 그래프 Varian 3400 </td><td> Varian </td><tD&gt; </td><td></td></tr><tr><td> N - 옥탄 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 296,988 </td><td> 세인트 루이스, 미주리 </td></tr><tr><td> 질량 분석계 매트 8230 </td><td> Finnigan </td><td></td><td> 산호세, 캘리포니아 </td></tr><tr><td> HP - 1 GC 칼럼 </td><td> 애질런트 테크놀로지 </td><td></td><td> 팔로 알토, CA </td></tr><tr><td> MDN - 5 GC 컬럼 </td><td> Supelco 주식 회사 </td><td></td><td> Bellefonte, PA </td></tr></table>

herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling

Herbivore 유도된 식물의 휘발성 물질 (HIPVs)은 일반적으로 herbivore 공격 1,2 후 식물에서 방출됩니다. 이러한 HIPVs은 주로 방어 식물 호르몬 jasmonic 산 (JA) 및 휘발성 메틸 유도체 jasmonate (MeJA) 3,4,5에 의해 규제됩니다. 지난 3 수십 연구자 이상 HIPVs이 격퇴하거나 유치 herbivores를 herbivores의 천적을 확보하고 경우에 그들은 이전 herbivore의 공격을 유발하거나 주요 공장 방어 수 수 문서화합니다. 최근 논문 6, 나는 다르게이라도, 블루베리 식물의 휘발성 물질의 배출을 유도 집시 나방의 유충, 외인성 MeJA 응용 프로그램, 그리고 기계적 손상에 의해 그 먹이를 발표했다. 또한, 블루베리 가지는 JA와 herbivores (즉, 직접 식물의 방어)에 저항의 수준을 증가하여 동일한 식물의 인접 지점에서 방출 HIPVs에 대응하고, 프라이밍 휘발성 배출하여 (즉, 간접 식물 방어). 찾을 유사ings는 쑥의 일종 7, 포플러 8, 리마 콩 9 최근에보고되었습니다 .. 자, 내가 herbivore (집시 나방) 먹이주기, 외인성 MeJA 응용 프로그램, 그리고 기계적 손상에 의해 유도된 블루베리 휘발성 물질을 수집을위한 푸시풀 방법을 설명합니다. 휘발성 수집 유닛은 4 L 휘발성 수집 챔버, 2 피스 단두대, 유입 공기를 정화 공기 공급 시스템 및 휘발성 물질 5,6,10를 수집하는 슈퍼 - Q 흡착제로 가득 함정에 연결된 진공 시스템으로 구성되어 있습니다 . 슈퍼 - Q 트랩에서 수집한 휘발성 물질은 dichloromethane과 eluted 후 분리 및 가스 크로마 토그래피 (GC)를 사용 계량입니다. 이 휘발성 징수 방법은 블루베리 식물 내에 herbivore - 손상된 지점에서 휘발성 물질에 노출 피해가 가지의 휘발성 반응을 조사하는 데 사용되는 N 제 연구 6되었습니다. 이러한 방법은 여기에 설명되어 있습니다. 간단히, 손상 블루베리 가지는 아프로 HIPVs에 노출되는같은 공장 내에서 m 근처 지점. 위에서 설명한 동일한 기술을 사용하여 HIPVs에 노출 후 지점에서 방출되는 휘발성 물질을 수집 분석하고 있습니다.

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Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

식물의 휘발성 물질을 수집을위한 푸시풀 방식이 설명되어 있습니다. 방법은 herbivore 먹이, 외인성 메틸 jasmonate, 기계적 손상에 의해 유발되는 휘발성 물질의 비교를 허용합니다. 이 기술은 또한 블루베리 식물 이내 herbivore - 손상된 지점에서 휘발성 물질에 노출 피해가 가지의 휘발성 반응을 조사하는 데 사용됩니다.

Herbivore 유도 블루베리 휘발성 물질과 내부 식물 신호

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.3K 조회수.  Rutgers University. 식물의 휘발성 물질을 수집을위한 푸시풀 방식이 설명되어 있습니다. 방법은 herbivore 먹이, 외인성 메틸 jasmonate, 기계적 손상에 의해 유발되는 휘발성 물질의 비교를 허용합니다. 이 기술은 또한 블루베리 식물 이내 herbivore - 손상된 지점에서 휘발성 물질에 노출 피해가 가지의 휘발성 반응을 조사하는 데 사용됩니다.

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Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

연구

생물학

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Craniofacial 개발 과정 Ectodermal 상피 조직의 신호 특성을 평가

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

의 형광 단백질의 편광 Translocation XenopusWnt 신호에 응답> Ectoderm

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

혈관 CA의 시각화 2 + Paracrine 유래 ROS에 의해 트리거된 신호

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

호스트 식물 휘발성 물질에 대한 선별 도구로 Electroantennographic Bioassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

세포 단일 층의 기계적 자극에 의​​한 칼슘 웨이브 전파 : 소 각막 내피 세포의 예

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

분리 및 문화 성인 마우스 세포 신호 전달 용의 Cardiomyocytes과의<em&gt; 시험관</em&gt; 심장 비대

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

대사율의 측정에<em&gt; 초파리</em&gt; Respirometry를 사용하여

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED 열 흐름 - 유동 세포 계측법으로 Optogenetics 결합

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...