이 방법은 위장관에 있는 미생물에 의하여 식민지 와 감염의 역학에 관하여 미생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간에서 음식 매개 감염을 더 대표하고 구강 개간에 비해 물고기의 잠재적 인 조직 손상을 감소시킨다는 것입니다. 이 방법의 시각적 데모는 파라메시아의 매우 운동성 특성 때문에 세척 단계가 수행하기 어려울 수 있기 때문에 중요합니다.
살아있는 성장 문화에서, 파라메슘 배양1 밀리리터와 e-coli MG1655 배양의 1 밀리리터를 E3 배지의 8밀리리터를 포함하는 10 밀리리터 조직 배양 플라스크에 추가하십시오. 2주마다 1밀리리터의 새로운 10밀리리터를 함유한 새로운 10밀리리터 조직 배양 플라스크에 22도의 플라스크를 가볍게 소용돌이치게 한다. 파라메뮴 내의 세균 반감기수를 결정하기 위해 600개의 파라메시아 박테리아 공동 배양의 광학 밀도에서 파라메시아의 수를 계산하고 6시간 동안 매시간 새로운 1.5 밀리리터 미세센심분리기 튜브에 50 마이크로리터 알리쿼트를 추가한다.
PBS에 1% 비이온 계면활성제의 950마이크로리터를 튜브에 추가합니다. 그리고 1분 동안 의 소용돌이로 각 시료에 파라메시아를 lyse한 다음 멸균 PBS에서 각 시료의 10개의 희석제 중 하나를 만듭니다. 그리고 각 희석제의 100 마이크로리터를 섭씨 37도에서 16시간 배양에 선택용 플레이트에 접시에 놓습니다.
다음 날, 플레이트에 세균 성 식민지의 수를 결정하기 위해 고립되고 뚜렷한 개별 식민지만 계산합니다. 그리고 30-300 식민지 형성 단위를 산출 희석플레이트를 식별합니다. 감염 전날, 원심분리에 의한 치료당 600배양문화의 광학밀도로부터 1부의 박테리아를 수집한다.
그리고 튜브 당 E3 배지의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 다음으로, 각 세균 현탁액에 적절한 세균 얼룩의 마이크로 리터 1 개를 추가합니다. 그리고 호일로 표백 튜브 사진을 보호합니다.
박테리아 샘플을 실내 온도에서 15분 동안 엔드 오버 엔드 회전으로 배양하기 전에. 인큐베이션의 끝에서, 과도한 염료를 제거하기 위해 E3 배지의 큰 부피에서 박테리아를 두 번 세척한다. 그리고 튜브 당 신선한 E3 매체의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 중단.
그런 다음 실온에서 2 시간 동안 조건당 신선한 파라메시아 의 두 플라스크각각에 세균 현탁액 1 밀리리터를 추가하십시오. 조건당 두 플라스크의 내용을 개별 50 밀리리터 원추형 튜브로 가져옵니다. 그리고 원심분리에 의해 샘플을 펠렛.
sterilogical 파이펫을 사용하여 각 튜브의 E3 상체의 약 10 밀리리터를 신선한 E3 배지 10 밀리리터로 교체하여 3개의 세심분리에 의해 세정합니다. 마지막 세척 후, E3 슈퍼나티의 약 10 밀리리터를 제거하고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하고, E3 배지의 나머지 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 각 현탁액의 500마이크로리터를 개별 1.5 밀리리터 마이크로센리분리기 튜브로 옮기고 원심분리로 파라메시아를 펠릿으로 전달한다.
슈퍼나티의 400 마이크로리터를 폐기하고, 36.5%의 포름알데히드 용액 20개에 파라메시아의 나머지 100마이크로리터에 부드러운 파이펫팅을 추가한다. 실온에서 5분 후, 밀리리터당 죽은 파라메시아 수를 계산하기 전에 파이펫으로 각 튜브의 실제 총 부피를 측정합니다. 제브라피시의 식품 매개 감염의 경우, 파라메시아 샘플을 E3 중간 농도의 밀리리터 당 5개 파라메시아로 2배 10배까지 희석시.
그리고 각 파라메시아 배양의 밀리리터 3밀리리터를 조건당 6개의 웰 플레이트의 1웰에 추가합니다. 다음으로, 최소한의 액체부피에 10개의 마취된 제브라피쉬를 각 우물로 옮기. 그리고 일광 조건에서 일주 인큐베이터에서 섭씨 30도에서 2 시간 동안 공동 문화를 배양하십시오.
먹이 속도를 확인하려면 먹이 캡처의 비디오 영상을 획득하면서 스테레오 현미경으로 먹이 제브라피시를 볼 수 있습니다. 먹이 포획은 먹이를 향해 제브라피쉬의 눈에 띄는 특징이다. 각 스트라이크는 하나의 먹이 캡처 이벤트로 추정된다.
인큐베이션이 끝나면 제브라피쉬를 5개의 다른 우물에서 씻어 내고 3밀리리터의 신선한 E3 배지를 함유하고 있으며, 트리카인 리터당 100밀리그램을 잘 보충합니다. 그리고 검은 웰 6 웰 플레이트에 1 % 저용 아가로즈의 3 밀리리터에 각 제브라피쉬를 포함. 모든 물고기가 내장된 경우, 스테레오 현미경 아래에 접시를 놓고 잘린 젤 로딩 팁을 사용하여 머리가 왼쪽에 있고 꼬리가 각 시야에서 오른쪽에 있는지 확인합니다.
아가로즈가 설정될 때까지 5분 간 기다린 다음, 임베디드 된 생선을 트리카인으로 보충한 신선한 E3 배지로 오버레이하고 형광 현미경으로 제브라피시를 이미지하여 세균 감염의 진행 상황을 평가합니다. 병원성 대장균의 경우, 초기 세균 밀도는 파라메슘 당 790개의 박테리아이며, 박테리아는 반감기약 2.3시간으로 각 파라메슘 절단 원자의 바쿠올레스 내에서 저하된다. 먹이는 특징적인 타격 동작을 수반하며, 먹이 속도의 결정은 각 파업이 1 파라메슘의 내정화로 이어진다는 가정에 근거한다.
소화 후, 무료 박테리아는 포주에서 중간 및 후방 장으로 이동하며, 먹이가 시작된 후 약 1~2시간 후에 검출됩니다. S-enterica, 예를 들어, 상피로 호중구의 침투로 이어지는 일부 상피 침공과 함께 주로 장 점막에서 국소화. 특정 유형의 박테리아와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.
