호흡기 싱크로바이러스에 대한 보호의 중요한 마커로서 RSV 중화 항체를 측정하기 위한 정확하고 높은 처리량 방법이 필요합니다. 이 방법은 10% 미만인 기준 항세럼에 대한 분석 간 변형으로 매우 재현가능한 이 분석법이 상대적으로 저렴한 비용으로 전 세계 많은 실험실에서 쉽게 확립될 수 있다고 믿습니다. 여기에서 RSV 하위 그룹 A에서 테스트되었으며 RSV 하위 그룹 B 및 다른 샘플 유형에 맞게 조정할 수 있는 이미징 기반 미세 중화 분석이 여기에 설명되어 있습니다.
절차를 시연하는 것은 MCRI의 연구 팀의 일원인 르우벤 Tse입니다. 첫날 에 시드 플레이트, 먼저 DMEM 매체에서 A549 세포를 다시 중단, 와 10%FCS와 1, 000 단위 페니실린-연쇄상 구균 혼합물 의 농도400, 밀리 리터 당 000 세포. 그런 다음 잘 당 100 마이크로 리터의 밀도에 40, 000 A459 세포와 96 잘 평평한 바닥 멸균 플레이트를 시드.
하룻밤 사이에 5%의 이산화탄소 환경에서 37도의 플레이트를 배양합니다. 둘째 날에 혈청 희석을 준비하기 위해 먼저 실온에서 인간 RSV 기준 혈청 및 혈청 검사 샘플을 해동하십시오. 그런 다음 56°C의 수조에 넣고 30분 동안 가열하여 활성화합니다.
다음으로, 150 마이크로리터의 최종 부피에 페니실린-스트렙토마이신 혼합물과 FCS 프리 DMEM 미디어와 참조 혈청의 1.5 마이크로리터를 혼합하여 기준 세럼의 1~100희석의 110마이크로리터 이상을 준비한다. 96웰 U-바닥 멸균 플레이트의 잘 A12로 이 희석의 파이펫 110 마이크로리터. 플레이트 아래로 1~2개의 희석제를 연속하여 먼저 페니실린-스트렙토마이신 혼합물을 사용하여 FcS가 없는 DMEM 미디어 55마이크로리터를 H12에서 H12에 웰즈B12에 추가합니다.
그런 다음 새로운 팁 전송 55 마이크로 리터 잘 A12에서 잘 B12. 파이펫을 5회 위아래로 사용하여 용액을 혼합하고 H12에 도달할 때까지 계속합니다. 잘 H12에서 용액의 초과 55 마이크로 리터떨어져 파이펫.
다음으로, 혈청 시험 시료의 1~100희석을 준비하고, 96웰멸균 플레이트의 A9 및 E1에 대응하는 웰 A1에 각 희석제 110마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 페니실린-연쇄상 구균 혼합물을 갖춘 FCS 가 없는 DMEM 미디어 55마이크로리터를 1~9개의 기둥의 우물에 추가합니다. 이전에 설명한 대로 행 A에서 행 D행 및 행 E에서 행 H로 연속 1~2회 희석을 만듭니다.
페니실린-스트렙토마이신 혼합물을 10과 11의 우물에 첨가하여 FCS 가 없는 DMEM 미디어 55마이크로리터를 첨가합니다. 바이러스 육수를 준비하기 위해 먼저 RSV의 냉동 유리병을 37도 의 수조에 넣고 빠르게 해동한 다음 유리병을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 페니실린-스트렙토마이신 혼합물을 함유한 DMEM 미디어에 바이러스를 추가하여 100개의 우물에 대해 총 55밀리리터를 만들기 위해 우물당 약 200PFU를 함유하고 있다.
바이러스 혈청 혼합물을 준비하기 위해 먼저 10 및 11의 H를 통해 1~9개의 열과 우물을 통해 모든 컬럼에 희석된 바이러스의 55마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 페니실린-스트렙토마이신 혼합물로 FCS가 없는 DMEM 미디어 55마이크로리터를 열 10과 11의 D를 통과하는 모든 우물에 추가하고, 1시간 동안 5%의 이산화탄소 환경에서 37°C의 플레이트를 배양합니다. RSV를 가진 A549 세포의 접종에 앞서, A549 세포 단층이 80%의 컨실루인지 확인하기 위하여 광 현미경의 밑에 세포 판을 검사합니다.
그런 다음 접시를 부드럽게 뒤집어 미디어를 버리고, 가볍게 멸균 흡수성 종이 타월에 접시를 블롯. 각 후 여과 된 멸균 PBS로 씻어 주세요. 다음으로 원고에 제공된 플레이트 템플릿에 따라 A549 세포판에 해당하는 우물에 바이러스 혈청 혼합물 100마이크로리터를 추가하고, 1시간 동안 5%의 이산화탄소로 37도에서 플레이트를 배양한다.
인큐베이션의 끝에서, 파이펫을 사용하여 우물당 90 마이크로리터를 제거하고 페니실린-스트렙토마이신 혼합물에 1XM199, 1.5%CMC 및 2%FCS를 함유한 미디어의 마이크로리터 100을 추가한다. 3일 동안 이산화탄소 5%에서 37도의 플레이트를 배양합니다. 분석판을 고치고 개발하기 위해 먼저 RSV에 감염된 A549 세포판을 부드럽게 반전시켜 M199, CMC, 2%FCS 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합물을 포함하는 매체를 폐기한다.
그런 다음 고정 버퍼 200 마이크로리터를 각 웰에 천천히 추가합니다. 20 분 동안 영하 20도에서 접시를 배양하십시오. 그런 다음 고정 버퍼를 버리고 흡수성 종이 타월에 부드럽게 얼룩이 있습니다.
접시를 아래로 내려 놓고 10 분 동안 건조시십시오. 그런 다음 05 폴리소르바트 20을 포함하는 필터링 된 PBS 버퍼를 사용하면 5 %의 우유 차단 용액을 만듭니다. 블로킹 용액 200마이크로리터를 각 웰에 추가하고 실온에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
인큐베이션이 끝나면 접시를 부드럽게 반전하여 용액을 버리고 흡수성 종이 타월에 얼룩을 놓습니다. 1차 항체를 만들기 위해 블로킹 용액에서 염소 XRSV 항체를 1~500개 희석한다. 각 우물에 50 마이크로리터를 추가하고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다.
여과 된 PBS-폴리소르베이트로 접시를 세 번 씻으시다. 다음으로, 블로킹 용액에서 알렉사 플루오르 당나귀 당나귀 면역 글로불린 G를 희석하여 이차 항체를 만든다. 각 우물에 50 마이크로리터를 추가하고 1시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.
여과 된 PBS-폴리소르베이트로 접시를 5번 세척합니다. 자동 스팟 판독기가 있는 플라크를 계산하려면 먼저 사용하지 않은 96웰 컬쳐 플레이트를 사용하여 FITC 채널의 카운트 설정을 입력하여 계측기를 공동 작업합니다. 그런 다음 셀 플레이트를 읽고 호일로 감싸고 섭씨 4도에 보관하십시오.
다음으로, 우물의 이미지를 확인하여 실제 플라크 또는 세포 단층이 중단된 경우, 세포 단층이 중단된 우물을 제외합니다. 무혈제 대조유의 평균 플라크 수는 계산되어 바이러스 활성의 50% 억제를 초래할 50%의 중화 컷오프를 결정하는 데 사용되었다. 상호 혈청 희석은 x 축과 두 점 사이에 그려진 선에서 세미 로그 그래프의 y 축에 있는 플라크 수를 플롯했습니다.
시험 혈청 샘플의 50% 중화 titres는 무혈청 대조공 우물의 50% 값 의 위 또는 그 이하의 카운트를 가진 빨간색 및 혈청 희석제가 확인되었다. 감비아에서 두 개의 다른 성인 코호트와 멜버른에서 건강 한 자원 봉사자에 RSVAPRN assays 멜버른 성인에 비해 낮은 평균 NAB titre를 가진 감비아 성인 결과. 표시된 인간 RSV-참조 혈청은 6.82%의 변이계와 매우 낮은 가변성을 보여 주며, 이러한 개선된 높은 처리량 RSV 플라크 감소 중화 분석은 많은 실험실에서 용이하게 구현될 수 있으며, RSV 중화 항체 분석에 대한 WHO의 국제 조화 노력을 지원할 것이다.
이것은 미래에 새로운 RSV 백신 후보의 평가에 중요 할 것입니다.
