재조합 바이러스의 사용은 바이러스 복제 메커니즘을 해독하고 백신을 위한 개발 플랫폼을 제공하기 위한 강력한 기술입니다. 마찬가지로, 좋은 품질의 바이러스 성 주식의 세대는 응용 연구에 가장 기본적인 연구에서 모든 바이러스 연구에 매우 중요합니다. 재조합 바이러스의 구조, 최적의 수확, 동결 및 RSV 주식의 적정은 모든 바이러스 학적 연구에 대한 중요한 방법입니다.
그들은 전통적인 것으로 간주 될 수 있지만 섬세 하 게 남아 특정 전문 지식이 필요. 전일, 밀리리터 농도당 0.5백만 개의 세포에서 완전한 배지에서 BSR-T7/5 세포를 중단한다. 6웰 플레이트에 잘 셀 서스펜션의 2밀리리터를 분배합니다.
다음날 80~90%에 도달할 때까지 이산화탄소를 5%로 섭씨 37도에서 배양합니다. 각 바이러스를 구출하기 위해 먼저 튜브에 해동 된 역 유전학 벡터를 혼합 한 다음 트랜스페션 시약 제조업체의 프로토콜에 따라 트랜스페션으로 진행합니다. 다음으로 혼합 벡터에 감소된 혈청 배지의 250 마이크로리터를 추가합니다.
또 다른 튜브에서, 감소된 혈청 매체의 250 마이크로리터에서 이 형질 시약의 10 마이크로리터를 희석시. 튜브를 부드럽게 소용돌이쳐 5분간 기다립니다. 두 튜브의 내용을 혼합하고 실온에서 20 분 동안 기다립니다.
한편, BSR-T7/5 세포를 혈청 배지 1밀리리터로 헹구고 1.5밀리리터의 최소 필수 항생제 항생제를 웰당 10%의 태아 종아리 혈청으로 보충한다. 필요한 경우 이산화탄소 환경의 섭씨 37도에서 배양하십시오. 20분 간 배양한 후, 각 우물에 500마이크로리터의 형체를 넣습니다.
3일 동안 5%의 이산화탄소 환경에서 37도의 섭씨에서 세포를 배양합니다. 구조 효율을 모니터링하려면 하루에 한 번 20배 배율로 반전된 형광 현미경으로 GFP 형광에서 관찰하십시오. 트랜스펙션의 셋째 날에, 전감염된 BSR-T7/5 6웰 플레이트의 각 우물에 있는 스크래치 세포.
세포와 상체를 각각의 상체를 멸균 2 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기다. 세포막에서 구조된 바이러스를 방출하기 위해 각 튜브를 30초 이상 격렬하게 소용돌이킵니다. 구조된 바이러스의 첫 번째 증폭을 위해, 먼저 전날 시드된 HEp-2 플레이트로부터 배양 배지를 제거한 다음, 신선한 통로 제로 바이러스 현탁액의 웰당 500 마이크로리터를 신속하게 추가한다.
HEp-2 플레이트를 시소 로커에 섭씨 37도에 두어 2시간 동안 부드러운 교반을 합니다. 구조 된 바이러스의 첫 번째 통로를 생성하려면 inoculum의 500 마이크로 리터를 버리고 2 % FCS로 MEM의 2 밀리리터를 추가하십시오. 3일 동안 이산화탄소 5%에서 37도의 플레이트를 배양합니다.
20X 배율에서 반전형 형광 현미경하에서 감염을 모니터링하려면 하루에 한 번 통로 제로 현탁액에 감염된 HEp-2 세포의 GFP 형광을 관찰한다. 밝은 필드 현미경에서, RSV 세포 병증 효과를 반영하는 작은 syncytia 및 세포 분리의 외관을 관찰합니다. 구조된 바이러스를 증폭시키기 위하여는, 먼저 FCS 가 없는 MEM의 바이러스 현탁액을 희석하여 밀리리터 당 50, 000 PFU에서 3밀리리터 서스펜션을 획득한 다음 HEp-2 플라스크에서 배지를 제거한다.
3밀리리터 바이러스 현탁액을 빠르게 추가하고 2시간 동안 부드러운 교반을 위해 시소 로커에 섭씨 37도의 플라스크를 배양합니다. 다음으로 접종을 제거하고 폐기하고 2 %의 FCS로 MEM의 15 밀리리터를 추가합니다. 2~4일 동안 이산화탄소 5%에서 섭씨 37도에서 배양합니다.
바이러스를 수확하는 적당한 시간을 추정하기 위하여는, 20X 배율에서 반전된 형광 현미경의 밑에 세포 형태와 GFP 형광을 확인하십시오. 이는 일반적으로 HEp-2 세포 층의 50%에서 80%가 감염 후 48시간 에서 72시간 사이에 발생하는 RSV 세포병증 효과로 인해 분리될 때입니다. 다음으로 셀 스크레이퍼를 사용하여 모든 세포를 긁어냅니다.
세포와 상체를 함께 수집하고 50 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮기십시오. 10X RSV 보존 솔루션의 부피의 1/10을 추가합니다. 튜브를 5초 동안 활발하게 소용돌이시키고 원심분리기는 200배g에서 5분간 소용돌이어 서스펜션을 명확히 합니다.
상체를 50밀리리터 튜브로 옮기십시오. 소용돌이와 알리텍은 알코올 내성 태그로 표시된 극저온 튜브의 서스펜션을 간략하게 알리쿼트합니다. 튜브를 미리 식히고 영하 80도 알코올을 최소 한 시간 동안 담그고 영하 80도에서 보관하십시오.
플라크 적정 분석법을 수행하기 위해 먼저 멸균 물로 상업용 10X MEM을 희석하고 L-글루타민, 밀리리터 페니실린 당 1, 000 단위, 밀리리터 연쇄 상감 절제술당 1 밀리그램을 추가하여 2배 최소 필수 매체를 만듭니다. 희석을 활발하게 흔들어 섭씨 4도에 보관한 다음 FCS가 없는 MEM 의 마이크로리터 900개를 6개의 튜브에 추가합니다. 바이러스 알리쿼트해와 5초 동안 적극적으로 소용돌이를 가합니다.
직렬 희석을 만들기 위해 먼저 바이러스의 마이크로리터 100마이크로리터를 첫 번째 튜브에 있는 배지의 900 마이크로리터에 추가합니다. 튜브에 캡을 놓고 몇 초 동안 소용돌이를 통해 내용을 혼합한 다음 두 번째 튜브에서 배지의 900 마이크로 리터에 첫 번째 희석제 100 마이크로리터를 추가합니다. 튜브와 소용돌이에 캡을 넣습니다.
여섯 번째 튜브까지이 절차를 반복합니다. HEp-2 12웰 플레이트에 바이러스 이름과 전체 희석을 적는다. 얼룩이 있는 동안 분리될 수 있으므로 플레이트와 덮개에 맞게 마크를 추가합니다.
플레이트에서 배지를 제거하고 400 마이크로리터를 잘 분배합니다. 바이러스 흡착을 위해 2시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 바이러스 흡착 시, 2X MEM의 pH를 약 7.2로 조정하여 미세결정 셀룰로오스 오버레이를 먼저 조절하여 멸균 나트륨 중탄산염 용액을 7.5%로 조절한다.
오버레이 100밀리리터를 얻으려면 2X MEM 10밀리리터, 2.4%의 단결정 셀룰로오스 서스펜션 10개, MEM의 밀리리터 80개를 2%FCS로 보충하고 적극적으로 혼합합니다. 2시간 배양이 끝나면 접종을 제거하지 않고 12웰 플레이트의 각 웰에 오버레이2~3밀리리터를 넣습니다. 6일 동안 이산화탄소 5%에서 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.
크리스탈 바이올렛 용액으로 세포를 염색하려면 먼저 판을 부드럽게 흔들어 미세 결정 셀룰로오스 오버레이를 벗습니다. 수퍼나티를 제거하고 1X PBS로 세포를 두 번 씻은 다음 크리스탈 바이올렛 용액의 1 ~2 밀리리터를 추가하고 10 - 15 분 기다립니다. 후속 판 염색을 위해 재사용할 수 있는 용액을 제거합니다.
마지막으로 바이러스 티터를 건조 플레이트의 우물에 보이는 플라크 수와 접종 부피 및 희석의 일부로 계산합니다. 음수 조절에 대한 플라크 분석법을 수행하여 N, P, L 및 M2-1의 발현 플라스미드만으로 감염되어 가장 낮은 희석에서 플라크가 없음을 드러냈습니다. 상기 전지로부터 얻은 티터는 구조가 효율적이라면 밀리리터당 100PFU 이상이 될 것으로 예상되었다.
이 티터는 통로를 통해 1~2번 의 통로에서 밀리리터당 100만 PFU에 도달했습니다. 이러한 형광 바이러스 덕분에, 단백질 N과 세포 단백질 IMPDH를 표적으로 하는 siRNA에 의한 RSV 발현의 억제를 쉽게 관찰하고 측정할 수 있다. 대조적으로, 비표적화 siRNA 또는 세포 단백질 GAPDH에 대하여 siRNA로 전감염된 세포 세포에 대한 강력한 GFP 신호가 관찰되고 측정되었다.
마찬가지로 이러한 바이러스는 항바이러스 화합물에 의한 RSV 곱셈억제의 쉬운 관찰을 가능하게 했다. HEp-2 감염 된 세포에서 형광 단백질 M2-1을 추적 하는 것은 매우 동적 구조로 IB와 IB 관련 과립을 보였다. IB는 융합하고 더 큰 구형 포함을 형성 할 수있는 모바일 및 구형 구조로 관찰되었다.
IB 관련 과립은 성장하고, 큰 IB 관련 과립으로 융합한 다음 사라진 작은 IB 관련 과립의 형성과 함께 지속적인 조립 분해 주기를 겪었습니다. 미세 결정 셀룰로오스 오버레이를 사용하여 RSV의 플라크 적정 프로토콜은 다른 세포 및/또는 기타 바이러스에 쉽게 적응될 수 있다. 그것은 미세 결정 셀룰로오스의 농도를 조정해야합니다.
