축수 된 중간 대뇌 동맥에서 멤브레인 전위를 기록하는 마이크로 전극 Impalement 방법

이 프로토콜은 정상 및 병이 있는 혈관의 막 잠재력을 측정하고 막 잠재력, 혈관 톤 및 혈류를 조절하는 약리학 에이전트를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술에서 생성된 막 잠재력은 혈관 내의 혈관 원활한 근육이 syncytium에 있기 때문에 생리 범위에 가깝습니다. 절차를 시작하기 전에, 원하는 위치에 선박 챔버에 가까운 이중 채널 차동 전기계 증폭기를 배치합니다.

BNC-BNC 케이블을 사용하여 증폭기 채널 A 또는 B의 출력을 디지타이저의 채널 입력에 연결합니다. 미세 조작기에 프로브를 장착하고 진동이없는 테이블에 현미경과 근시로 마이크로 조작기로 전환합니다. 매뉴얼에 설명된 대로 앰프 의 전면에 손잡이와 스위치를 적절한 위치에 놓습니다.

그런 다음 목욕 지를 증폭기의 회로 접지에 적절한 전극으로 연결하고 케이지가 증폭기의 섀시에 접지되도록합니다. 보로실리케이트 유리 마이크로 전극을 준비하려면 표준 풀러를 사용하여 직경이 1마이크로미터 미만인 짧고 점진적인 8-10mm 테이퍼를 달성하여 더 높은 저항과 더 작은 팁을 위해 두 번 반복합니다. 마이크로화이버 주사기를 사용하여 미세 전극을 염화물 3마리의 알륨으로 채우고, 주입 중에 플런저를 천천히 회수하여 유체가 채워질 수 있도록 하고 마이크로 전광구 내부의 거품형성을 방지합니다.

완전히 로드된 마이크로 전극을 마이크로 전하 홀더에 놓고 조심스럽게 전극 생크를 지루한 구멍을 통해 홀더에 단단히 밀어 넣습니다. 실험실 조직으로 과도한 유체를 제거하고 전극 홀더 어셈블리를 증폭기 프로브에 연결합니다. 전극 저항을 측정하기 위해 전극 테스트를 수행합니다.

그런 다음 녹음 소프트웨어를 열고 파일에 이름을 할당하고 파일을 저장하여 향후 분석을 위해 저장합니다. 다음으로, 일반 생리용액 또는 PSS의 5밀리리터로 챔버를 적재하기 전에 증류수로 근사챔버를 여러 번 헹구는다. 5 밀리리터 주사기를 사용하여 유리 캐뉼라와 부착된 튜빙을 기포를 도입하지 않고 여과된 일반 PSS로 채우고, 무딘 집게를 사용하여 10-0 모노피라멘트 나일론 봉합사 2개로 반 매듭을 만듭니다.

그런 다음 해부 현미경의 밑에 해부 집게를 사용하여, 팁에서 약간 멀리 두 캐뉼러에 부분적으로 닫힌 봉합매듭을 놓습니다. 중간 대뇌 동맥 격리를 위해 스프링 가위와 집게를 사용하여 쥐 뇌의 내직경100에서 200 마이크로미터의 중간 뇌 동맥을 식별하고 해부하십시오. 미세 한 집게를 사용하여 중간 대뇌 동맥을 유리 칸누라에 장착하고 봉합사를 조여 캐뉼라에 동맥을 고정하십시오.

동맥 내의 흐름이 없도록 황실 캐뉼라를 닫고 유입 피펫을 PSS의 저수지에 연결합니다. 반전된 현미경 및 이미징 소프트웨어에 장착된 충전 결합 장치 카메라를 사용하여 캔누울화된 중간 뇌동맥을 시각화합니다. MCA의 축 길이를 대략적인 길이로 설정하여 강성도 flaccid가 나타나지 않습니다.

목욕 용액을 섭씨 95% 및 이산화탄소 5%를 섭씨 37도에서 상화합니다. 심근의 PSS에 앰프의 지면을 침수. 혈관 챔버를 조명하고 현미경을 통해 목욕 용액의 미세 전극 의 끝을 시각화합니다.

마이크로 조작기를 사용하여 미세 전극의 끝을 혈관의 외부 벽에 가깝게 이동하고 기록을 시작합니다. 마이크로 전하의 끝을 선박쪽으로 천천히 이동하여 선박의 중심을 노립니다. 팁이 용기에 근접하면 전극을 한 번의 빠른 움직임으로 전진하여 근육의 막을 침전시킵니다.

멤브레인이 침투되면 막 전위가 관찰될 수 있습니다. 멤브레인이 찔려 나면 마이크로 조작기에 닿지 마십시오. 멤브레인 잠재적 변화가 기록되면 조작기를 사용하여 하나의 빠른 움직임으로 마이크로 전극을 제거하고 데이터 파일을 저장하기 전에 기록을 중지합니다.

음극에 대한 급격한 편향이 있을 때, 멤브레인 전위는 최소 30초 동안 안정되고, 전극을 제거하면 전압이 갑자기 0밀리볼트로 되돌아갑니다. 성공적인 방전 및 막 잠재적 안정화 후, 관심의 약물은 목욕으로 퍼질 수 있으며 멤브레인 잠재력의 변화를 기록 할 수 있습니다. 이 대표적인 실험에서 염화칼륨과 관입은 멤브레인을 약 6밀리볼트로 탈극화하고, 대형 전도성 칼슘 활성화 칼륨 채널의 칼슘 의존활성제와 함께 배분하여 멤브레인을 거의 4밀리볼트로 양극화시켰다.

기억해야 할 가장 중요한 것은 직경이 1마이크로미터 미만인 짧고 점진적인 테이퍼가 있는 고저항성 미세 전극을 당기는 것입니다.